鈣敏感受體對動脈粥樣硬化大鼠急性心肌梗死易感性的影響和保護研究-國基標(biāo)書

檢查保護(2008版)資助類別： 亞類說明： 附注說明：項目名稱： 依托單位： 通訊地址： 電子郵件：申報日期：2008年2月28日徐長慶性別男主要研究領(lǐng)域在研項目批準(zhǔn)號哈爾濱醫(yī)科大學(xué)[在此錄入修改][在此錄入修改][在此錄入修改]鈣敏感受體對動脈粥樣硬化大鼠急性心肌梗死易感性的影響和保護研究受體（CaSR）在心肌有功能性表達（2003）并證明CaSR參1王麗娜王麗娜女42李弘李弘女信號傳導(dǎo)通路43郭津郭津女動脈硬化模84女baishuzhi12@65席玉慧席玉慧女36李宏霞李宏霞女47李光偉李光偉女68[在此錄入修改][在此錄入修改]9[在此錄入修改][在此錄入修改]81313），報告正文報告正文查看報告正文撰寫提綱用了各種現(xiàn)代化治療方法，AMI所致的左心AMI是由于冠狀動脈粥樣斑塊破裂后,在血小然發(fā)病和治療過程中，常發(fā)生心肌缺血-再灌注損傷，其發(fā)病機制有鈣超載、自由基增目前，尋找合理、有效的防治AMI方法正處在“十字路口”[6]。后適應(yīng)等，在心肌缺血-再灌注損傷中作用、機制和信號傳導(dǎo)通路[7-16]。及線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變等[18]。2006年，Tfelt-Hansen等人報告，CaSR在新生大鼠心室肌細(xì)同年，我們課題組揭示了大鼠不同鼠齡CaSR的表達規(guī)律[21]。近年來，其他實驗小組也心血管系統(tǒng)通過鈣敏感受體發(fā)揮第一信使作用”[24]?？梢?，CaSR在心血管系統(tǒng)中的作2004年以來，我們獲得了2項國家自然科學(xué)肌細(xì)胞鈣敏感受體的生物學(xué)活性及其在心肌缺血/再灌注損傷中的作用》（編號30370577，2004-2006，主持人徐長慶2）大鼠心肌多胺代謝規(guī)律和"雙刃劍"作鼠齡的表達規(guī)律2）CaSR激活通過G蛋白-PLC-IP3肌興奮-收縮偶聯(lián)的調(diào)控，是細(xì)胞鈣超載的機制3）心肌缺血-再灌注時Ca缺血后適應(yīng)的心肌保護作用5）細(xì)胞內(nèi)多胺穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，精胺濃度導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，是雙刃劍6）急性心肌缺血可誘導(dǎo)心肌發(fā)生表達增加，多胺合成增加；再灌注早期（1－2h）,aclinicalviewonacomplexpat4.ThorstenReffelma5．FrankEefting,BeTheNeedforTranslationIntoClinicalTherapharmacologicalapplications.Pharmacol.Rev.2005;513.TiloGrosser,SusanneFries,acardiovascularconsequencesofCOX15.KarlStang,Christoph,Thoma16.XuCY,Bailly-Maitrofpolyaminesinmammals.Eu19.WangR,XuCQ,ZhaoWM,etal.Cal20.Tfelt-HansenJ,HansenJL,SmajilovicS,etal.Calciumreceptorisfunctionally21.孫軼華,徐長慶（）,等。不同鼠齡大鼠心肌組織中鈣敏感受體的表達及與缺氧-再灌注損傷的關(guān)系。中國病理生理雜志.2006，22（8）：1522.RoyC.Ziegelstein23.SanelaSmajilovic,JakobLercheHansen,TueE.H.CSheikh,E.F.Terwilliger,EdwardM.Brown,StigHaunso,JacobviaPKC-mediatedcalciumsimulatedischemia/repBiophysicalResearchCommunications2006,347:872-881(SCI收錄，IF3.0.)31．張偉才，張偉華,徐長慶。鈣敏感受體與缺血／再灌注損傷誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的線粒體途徑的關(guān)系。中華心血管病雜志.2007,35(8)：740-744(PubMed收錄，IF1.272)32.吳博,徐長慶,等.鈣敏感受體對大鼠心肌缺氧－復(fù)氧損傷時細(xì)胞凋亡的影響.中國病35.孫軼華，徐長慶等.大鼠心肌鈣敏感受體蛋白的表達及與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系.中華部分為重點闡述內(nèi)容）研究內(nèi)容在前期的研究中，我們在大鼠離體心臟灌流模型和原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)模型中已證誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；2）心肌缺血/再灌注時可發(fā)生多胺代謝紊亂，（2）檢測動脈粥樣硬化（AS）大鼠心肌組織、動脈平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞中鈣敏感受（4）以動脈粥樣硬化（AS）大鼠為實驗對象，以正常大鼠為對照組，通過注射兒茶酚胺（異丙腎上腺素）模擬強烈的情緒應(yīng)激和/或冠脈結(jié)扎模擬完全性冠脈閉塞，復(fù)研究目標(biāo)急性心肌梗死(AMI)是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，且呈年輕化趨勢。斑塊破裂、血表達增多，激活眾多細(xì)胞凋亡通路，進而增加對急性心肌梗死（AMI）的易感性”的假擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題因孰果？還是因果轉(zhuǎn)化從而進一步闡明動脈粥樣硬化和急性心肌梗死發(fā)生機制和驗手段、關(guān)鍵技術(shù)等說明）研究方法具體制備方法參照：Zhen-YuHuang,Peng-YuanYang,Mohamadanalysisoftheproteomeofleftventricularheartofarteriosclerosisinrat.LifeSciences75(2004)311)冠脈結(jié)扎法清潔級Wistar大鼠，烏拉坦橫行切口，剪開心包，暴露心臟，以肺動脈圓錐與左心耳交界處的左冠狀靜脈為標(biāo)志，于左心耳下2)異丙腎注射法采用大鼠連續(xù)兩天皮下注射異丙腎上腺素（200mg·kg-1·d-1）制備大鼠心②血清學(xué)檢查（心肌標(biāo)記酶CK-MB,T①ZhaoYJ,XuCQ,etal.PolyamineMetabolisminRatIschemia/ReperfusionInjuryHeartandtheRelationshipbetweenL-Arg/PAsPathwayandL-Arg/NOPathway.Eur.J.病理生理雜志2007,23(7):1249-1253修飾程度通過測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)值。OX-LCercekB,YarmashitaM,DimayugaD,etal.Nuclearfactor-kappaBactivityandarterialresponsetoballoninjury.Athero2sclerosis,1997,131(1):59Yi-huaSun,Chang-qingXuetal.Calcium-sensingreceptorinducesratneonatalventricularcardiomyocyteapoptosis.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications3)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的制備參照下述文獻建立細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。模擬缺糖DMEM,細(xì)胞置于無菌密閉容器，放在恒溫水浴箱內(nèi)保持37℃,進氣口通入95％N2＋5％CO2混合BradyNR,Hamacher-BradyA,GottliebRA.ProapoptoticBCL-2familymembersandmitochondrialdysfunctionduringischemia/reperfusioninjury,astudyemployingcardiacHL-1cellsandGFPbiosensors.BiochimBiophysActa.2006,1757(5-6):667-678.磷脂酶C抑制劑（U73122）、鈣庫內(nèi)鈣消耗劑（caffeine）等工具藥，進一步確定細(xì)胞cardiactissues.Eur.J.Biochem.270,2我們在國內(nèi)首先建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏苯甲酰氯衍生反向高效液相色譜法檢測心肌組織國病理生理雜志2005,21(2):412-41321(5):555～9p54、p46JNK、Erk1/2（包括磷酸化和非），①ZhaoYJ,XuCQ,etal.PolyamineMetabolisminRatIschemia/RtheRelationshipbetweenL-Arg/PAsPathwayandL-Arg/NOPathway.Eur.J-246②Yi-huaSun,Chang-qingXuetal.Calcium-sensingreceptorinducesratneonatalventricularcardiomyocyteapoptosis.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications③WeihuaZhang,Chang-qingXuetal.Involvementofcalcium–sensingreceptorinischemia/reperfusion–inducedapoptosisinratcardiomyocytes.BiochemiacalandBiophysicalResearchCommunications2006,347:8725mmol/L,Tris-HCl15mmol/L,pH6.8）進行勻漿，經(jīng)離心（9500r/min,20min）去除細(xì)胞碎片，上清液再離心（19000r/min,45min），將沉淀懸浮于緩沖液（KCl600mmol/L,Tris-HCl定SR膜制備中SR標(biāo)志酶葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase)，質(zhì)膜Na+-K+-ATP酶〔Tris-ATP5mmol/L,NaN35mmol/L(購自美國Sigma公司),KCl100mmol/L,MgCl225mmol/L,Tris-HCl20mmol/L，pH6.8)625μl中,在室溫下加入10μmol/L45Ca(11)線粒體膜電位變化(△Ψm）的觀察Calcein-AM是胞漿熒光標(biāo)記物，本身無熒光，將熒光燃料Calcein-AM與線粒體共孵K通道，可采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)直接測定。KATP通道阻斷劑用以格列苯脲為代倍的BMS-180448。對于大鼠心肌線粒技術(shù)路線實驗設(shè)計嚴(yán)格遵循三大原則1）隨機2）對照3）重復(fù)。（4動脈粥樣硬化＋急性心肌梗死）組（AS＋AMIg可行性分析發(fā)現(xiàn)：1）大鼠心臟有功能性鈣敏感受體（Ccaspase-3通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；4）心CaSR參與了離體心臟和原代培養(yǎng)心肌的缺血（缺氧）/再灌注（復(fù)氧）損用動脈粥樣硬化大鼠通過模擬情緒應(yīng)激（注射大劑量兒茶酚胺）來復(fù)制急性心肌梗死國際合作與交流計劃等）年度研究計劃2010.1－2010.12復(fù)制動脈粥樣硬化大鼠急性心肌梗死模型，確認(rèn)模型復(fù)制成功。同2011.1－2011.12觀察外源性精胺對動脈粥樣硬化大鼠急性心肌梗死的保護作用，揭示其藥物預(yù)適應(yīng)的機制。同時完成課題的總結(jié)和鑒定，并申報科研預(yù)期研究成果（CaSR）的表達增多，激活細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)通路，增加對急性心?。?）培養(yǎng)3-4名博士研究生和1-2名碩士研究生。（3）申報部省級自然科學(xué)獎或科技進步獎1項。（二）研究基礎(chǔ)與工作條件1、工作基礎(chǔ)（與本項目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績）項目申請人所在的哈醫(yī)大病理生理教研室，科研方向始終為心肌缺血/再灌注灌注組和CaSR激動劑組(NiCl2＋CdCl2＋GdCl3)的大鼠心MorphologicalchangesofcardiactissueiA:control;B:anoxia;C:A/R;D:NiCl2+CdCl2+A/R;E:GdCl3+NiCl2+CdCl2+A/R.ReresentativeillustrationofTUNELstainingincaA:control;B:anoxia;C:A/R;D:NiCl2+CdCl2+A/R;E:GdCl3+NiCl2+CdCl2+A/R.#P<0.05vsA正常對照組B缺血/再灌注組C缺血預(yù)適應(yīng)組DA正常對照組B缺血/再灌注組C缺血預(yù)適應(yīng)組適應(yīng)。型心肌的CaSR增多，與AMI的損傷密切相關(guān)。2、工作條件（包括已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑，包括利用國家實驗室、國家重點實驗室和部門重點實驗室等研究基地的計劃與落實情況）配套設(shè)備(如膜片鉗儀，基因鉗儀，數(shù)模轉(zhuǎn)換儀，電極拉制器，倒置顯微鏡，三維液壓PCR儀，全自動蛋白核酸電泳儀，毛細(xì)管電各種設(shè)備，制冰機等)，多道生理記錄儀，雙光束紫外分光光度儀，液閃計數(shù)學(xué)歷和研究工作簡歷及心肌保護研究》(黑龍江省自然科學(xué)二等獎，25）楊寶峰、何樹莊、周晉、李玉榮、徐長慶：《青蒿素等中藥活性成分與鉀通道關(guān)系的研究》6）楊寶峰、李玉榮、徐長慶、杜智敏、羅大力：《幾種中藥抗心律失常作用與鉀離子通道關(guān)系的7）李玉榮、楊寶峰、徐長慶、杜智敏、李寶馨：《幾種中藥抗心律失常作用與鉀離子通道亞型關(guān)8）王孝銘、張力、付國輝、徐長慶、李相忠：《丹參對心肌保護作用的細(xì)胞及分子機理研究》Basic&ClinicalPharmacology&Toxicology,2008102:329–336Tian,Yan-jieLv,Bao-fengYaninculturedneonatalratcardiomyocytes.BiochemicalRatVentricularMyocytes.ClinicalandExperimentalPharmacologyandPhysiology.20085.HanL,XuC,GuoY,LiH,JiangC,ZhaoY.PolyaminemetabolisminratmyocardialYan-liWang,Li-juanDu,Zhi-ruiSun,Bao-fengYang,RuiWang，Chang-qing（）Post-conditioningprotereceptors.BiochemiacalandBiophysicalResearchCommunications2007,3ANDCELLULARCARDIOLOGY42:S80-S81Supcardiomyocytes.BiochemiacalandBiophysicalResearchCommunications2006,347:12.HuangY,WuL,XuC,YangB,WangR.IncreasedHO-1expressionanddecreasediNOSexpressioninthehiCellBiochemBiophys.2006;46(1):35-42(SCI收錄，IF2.138)15.吳博,張偉華,李全鳳,高秀香,張力,楊金霞,王秀麗,張明爽,張卓然,徐長慶.鈣敏感受16.姜春明,韓麗萍,李鴻珠,徐長慶,孫軼華,趙煒明.鈣敏感受體在大鼠心肌缺血/再肌缺血再灌注損傷誘發(fā)細(xì)胞凋亡的機制。中國地方病學(xué)18．韓麗萍，姜春明，李鴻珠，王莞，孫軼華，徐長慶.精胺對大鼠在體心肌缺血/再灌注（）鼠心肌多巴胺受體在缺氧-復(fù)氧時的表達變化及其意義.中國病理生理雜志2007,23(12)：2322-2326(IF0.541)21．裴天仙，徐長慶李濱，張卓然，高秀香，于靖，李鴻珠，楊寶峰。槲皮素對阿霉素致(IF0.67)熱休克蛋白70抑制c—Jun氨基末端激酶通路對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的保護作用。中國地方病學(xué)雜志.2007,26(5)：537-539(IF1.237)25．孫麗紅,李鴻珠,韓麗萍,姜春明,趙雅君,高秀香,田野,徐長慶。青蒿素對離體26．張明爽，徐長慶王秀麗，楊金霞，張卓然，吳博槲皮素抗實驗性心律失常作用的研究.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,血/再灌注損傷的保護作用。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2007,42(6):563-565(IF0.152)28．楊金霞，徐長慶王秀麗，高秀香，張明爽，張卓然，吳博，張偉華.外源性精胺對大鼠離體胸主動脈環(huán)的收縮作用.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2007,42(2):98-10129.孫軼華，張力,徐長慶,李弘,時颯,趙雅君,韓麗萍,張紅雨。不同鼠織中鈣敏感受體的表達及其在心肌缺血/再灌注損傷中的改變。中國病Wang.大鼠心肌鈣敏感受體蛋白的表達及與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系.中華心血管病雜志2006，34（8739－74331．李弘，徐長慶孫軼華,時颯,趙雅君,張力。多巴胺受體蛋白在大鼠心肌肥厚時的表達變化。中國病理生理雜志.2006，22（71373－1377(IF0.541)前后離子通道基因表達的變化。中國臨床康復(fù)2006，10（17）：42－44(IF0.531)36．李宏霞，徐長慶張紅雨，趙雅君，張力，楊寶峰，高秀香.外源性精胺致大鼠乳鼠心用.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.2006，40(6):457-438．趙雅君,徐長慶李全風(fēng)，馬麗英。應(yīng)用反相高效液相色譜分析離體心臟灌流大鼠心肌39．趙雅君，徐長慶時颯，孫宏力，王寧，李寶馨，王玲，楊寶峰，RuiWang。多胺對大鼠缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)鈣的影響。中國病理生理雜志2005,21(10):1938-1941(IF0.541.張艷橋,張一娜,吳江,朱秀英,徐長慶.中華麻醉學(xué)雜志2005，25（3）：219－220(IF0）：國病理生理雜志.2004，20（3）：402－406(IF045．張艷橋，陳仁武，徐長慶.GrahamHSteven.環(huán)加氧酶-246.徐曼，李全鳳，張偉華,張淑芹,徐長慶,王孝銘.復(fù)方丹參滴丸對培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞缺氧及缺氧/復(fù)氧時Fas/FasL蛋白表達的影響中國病47.張偉華，張偉才，王麗娜,李全鳳，周令望,高彥輝,徐長慶.熱誘導(dǎo)延遲損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡機理的探討中國地方病學(xué)雜志21．黑龍江省衛(wèi)生廳課題《鈣敏感受體在心肌肥大中的作用》（2007.1－2008.12）ratcardiomyocytes.BiochemicalandBiophys5．張偉華，王麗娜，李全鳳，等.熱休克蛋白706.張偉華，張偉才，王麗娜,等.熱誘導(dǎo)延遲損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡機理的探討中國7.王麗娜，張偉華，李全鳳，等.熱應(yīng)激預(yù)適應(yīng)對H2O2誘發(fā)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護RatVentricularMyocytes.ClinicalandExperimentalPharmacologyandPhysiology.2008ofCulturedNeonatalRatCardiomyocytesinSimulatedIschaemia/Reperfusion.Basic&ClinicalPharmacology&Toxicology,2008102:329receptorinducesratneonatalventricularcardiomyocyteapop5.李鴻珠，徐長慶，李弘，等。大鼠心肌多巴胺受體在缺氧-復(fù)氧時的表達變化及其意）：4、承擔(dān)科研項目情況外源性精胺心肌保護作用的電生理機2007.1-2007.1-2007.1-5、完成自然科學(xué)基金項目情況（1）項目概況大鼠心肌細(xì)胞鈣敏感受體的生物學(xué)活性及其在心肌缺血/再灌注損傷中的大鼠心肌多胺代謝規(guī)律和"雙刃劍"作2005.1-CaSR激活與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系及引起心肌細(xì)胞“鈣爆炸”的可），2）項目（30470688觀察大鼠心肌缺血/再灌注心肌組織多胺含量、多胺代謝限速酶(鳥氨酸意義；觀察不同劑量外源性精胺對大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子電流、細(xì)胞凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑篇）。另外，在國際和全國學(xué)術(shù)會議作大會報告、專題報告12人次。張偉華博士在第五屆國際病理生理大會上獲得十大杰出壁報貢獻獎，第六屆（3）后續(xù)研究進展及與本申請項目的關(guān)系我們在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)適應(yīng)在產(chǎn)生心肌保我們現(xiàn)成功復(fù)制了大鼠異丙腎性心肌梗死模型，并觀察了CaSR在其中的作用和并的CaSR增多，與AMI的損傷密切相關(guān)。（4）已結(jié)題項目總結(jié)摘要和相關(guān)成果目錄本課題首次發(fā)現(xiàn)和揭示：(1)鈣敏感受體（CaSR）在大鼠心肌組織中存在及不同鼠齡的表達規(guī)律2）CaSR激活通過G蛋白-PLC-IP3通路引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加，參與心肌興奮-收縮偶聯(lián)的調(diào)控，是細(xì)胞鈣超載的機血后適應(yīng)的心肌保護作用5）細(xì)胞內(nèi)多胺穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，精胺濃度過高致心肌細(xì)胞損傷，是雙刃劍6）低濃度外源性精胺對于心肌缺血-再灌注損傷和細(xì)胞凋亡具有保護作用7）多巴胺受體在大鼠心肌肥厚時的作用及與L精氨酸/NO通路關(guān)系8）CaSR通過神經(jīng)鈣調(diào)磷酸酶參與AngII誘導(dǎo)的大鼠心肌肥大9）多胺和NO途徑通過關(guān)鍵酶參與了L-精氨酸對心肌肥大預(yù)防作用10）在國內(nèi)首次建立了心肌多胺細(xì)胞凋亡和心肌肥大，有望成為防治新靶點。迄今為止，已發(fā)表相關(guān)論文29篇（SCI發(fā)表論文目錄（注明受本國家自然科學(xué)基金項目資助，通訊作者）Basic&ClinicalPharmacology&Toxicology,2008102:329–336RatVentricularMyocytes.ClinicalandExperimentalPharmacologyandPhysiology.2008Tian,Yan-jieLv,Bao-fengYaninculturedneonatalratcardiomyocytes.Biochemical5.HanL,XuC,GuoY,LiH,JiangC,