基于全癌標(biāo)志物檢測評(píng)價(jià)細(xì)胞治療產(chǎn)品制備質(zhì)量安全及臨床應(yīng)用效果標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—XXXX目錄TOC\o"1-1"\h\z\u1范圍 22規(guī)范性引用文件 23術(shù)語和定義 24原理 35試劑和材料 36儀器設(shè)備 47分析步驟 48結(jié)果計(jì)算和表達(dá) 59質(zhì)量控制與驗(yàn)證 610安全措施 711方法性能指標(biāo) 8附錄 9基于全癌標(biāo)志物檢測評(píng)價(jià)細(xì)胞治療產(chǎn)品制備質(zhì)量安全及臨床應(yīng)用效果標(biāo)準(zhǔn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了基于全癌標(biāo)志物檢測評(píng)價(jià)細(xì)胞治療產(chǎn)品制備質(zhì)量安全及臨床應(yīng)用效果的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于干細(xì)胞治療產(chǎn)品、免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品、細(xì)胞衍生治療產(chǎn)品等的質(zhì)量安全評(píng)估及臨床應(yīng)用效果評(píng)價(jià)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成對(duì)本文件必不可少的條款。其中，標(biāo)注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。人干細(xì)胞產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則（2024年版）細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（2023年修訂版）ICHS6(R1）：生物技術(shù)藥物的臨床前安全性評(píng)價(jià)ICHQ5D：基因治療產(chǎn)品的質(zhì)量要求ISO20387:2018，生物技術(shù)—生物樣本庫通用要求細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測指導(dǎo)原則（2025年版）中華人民共和國藥典（2025年版第四部）藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1DNA甲基化DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中的一種重要機(jī)制，指的是在DNA分子中的胞嘧啶（C）堿基上加上甲基（CH?）基團(tuán)，形成5甲基胞嘧啶（5mC）。這種化學(xué)修飾會(huì)影響基因的表達(dá)，而不改變基因的編碼序列。3.2全癌DNA甲基化標(biāo)志物TAGMe?TAGMe?（TumorAlignedGeneralMethylatedEpiprobe）是一種基于全癌標(biāo)志物DNA甲基化技術(shù)，能夠通過識(shí)別和分析特定的DNA甲基化位點(diǎn)，來評(píng)估細(xì)胞產(chǎn)品的安全性與有效性。3.3致瘤性（Oncogenicity）指細(xì)胞裂解物中的化學(xué)物質(zhì)、病毒、病毒核酸或基因以及細(xì)胞成分接種動(dòng)物后，導(dǎo)致被接種動(dòng)物的正常細(xì)胞形成腫瘤的能力。即接種物（細(xì)胞和/或裂解物）促使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的能力。3.4成瘤性（Tumorigenicity）指細(xì)胞接種動(dòng)物后在注射部分和（或）轉(zhuǎn)移部位由接種細(xì)胞本身形成腫瘤的能力。即接種的細(xì)胞自身形成腫瘤的能力。3.5促瘤性（Tumor-PromotingActivity）指細(xì)胞治療產(chǎn)品通過旁分泌、免疫抑制或物理接觸等方式間接促進(jìn)宿主已有腫瘤生長或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。原理TAGMe?技術(shù)可識(shí)別出腫瘤細(xì)胞中普遍存在的DNA甲基化標(biāo)志物，全癌標(biāo)志物的甲基化通常出現(xiàn)在癌癥細(xì)胞的基因區(qū)域，在正常細(xì)胞中，這些區(qū)域通常處于未甲基化狀態(tài)。通過對(duì)細(xì)胞產(chǎn)品中DNA甲基化水平的檢測，TAGMe?技術(shù)能夠揭示出細(xì)胞是否已經(jīng)經(jīng)歷過潛在的癌變或成瘤性轉(zhuǎn)變。試劑和材料試劑DNA提取試劑盒：市售，符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。Me-qPCR試劑：包括反應(yīng)緩沖液、酶等。陽性對(duì)照：已知高甲基化的細(xì)胞系或樣本，如Hela細(xì)胞系。陰性對(duì)照：正常非癌細(xì)胞系，如HEK293細(xì)胞系或其他已知無甲基化的細(xì)胞系。其他：包括但不限于Taq酶、dNTPs、引物等。材料5.2.1離心管：多種規(guī)格，如2mL、10mL、15mL等。5.2.2移液器及移液吸頭：不同量程，如100μL、1000μL、5000μL等。5.2.3其他：如樣本采集相關(guān)材料等。儀器設(shè)備PCR儀器：如ABI7500、宏石SLAN96S等。DNA提取儀：如有需要可配備。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥10000r/min。電子天平：感量為0.01g和感量為0.0001g。生物安全柜：用于樣本處理等操作。其他：如恒溫設(shè)備等。分析步驟樣本準(zhǔn)備干細(xì)胞產(chǎn)品采集：從干細(xì)胞制劑或治療性細(xì)胞產(chǎn)品中，采用無菌技術(shù)收集細(xì)胞樣本。推薦使用第3代（P3）至第7代（P7）細(xì)胞樣本。免疫細(xì)胞產(chǎn)品采集：對(duì)于免疫細(xì)胞，如CAR-T、CAR-NK等，可以通過靜脈采集患者或供者的外周血、骨髓或組織樣本。臨床患者樣本采集：從接受細(xì)胞治療的患者體內(nèi)（如外周血、腫瘤組織或其他相關(guān)組織）采集全血樣本，需在患者治療前或治療后的特定時(shí)間點(diǎn)（如半個(gè)月，1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月等）進(jìn)行采集。樣本處理細(xì)胞樣本處理：收集的細(xì)胞樣本應(yīng)立即進(jìn)行處理。若細(xì)胞樣本需要保存，必須按照適宜條件（2-8℃）及合適保存液中短期存放，避免細(xì)胞活性喪失。對(duì)于長期存儲(chǔ)，推薦采用低溫凍存技術(shù)，存儲(chǔ)溫度為-80℃或更低，避免反復(fù)凍融。核酸提取：細(xì)胞樣本必須確保高質(zhì)量的DNA提取，避免樣本中的RNA或其他污染物干擾后續(xù)的甲基化分析。檢測在上述準(zhǔn)備好反應(yīng)體系中分別加入處理好的待測樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各8μL，終體積為30μL/管，蓋緊管蓋，混勻，瞬時(shí)低速離心。使用PCR儀器進(jìn)行檢測，設(shè)置如下程序：步驟溫度（℃）時(shí)間循環(huán)數(shù)（次）1955min129420sec3536030sec3547220sec35靶標(biāo)T1檢測通道：FAM；G1檢測通道：CY5；G2檢測通道：ROX。結(jié)果計(jì)算和表達(dá)定性使用基因甲基化檢測分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，輸出甲基化狀態(tài)的判定結(jié)果。根據(jù)檢測結(jié)果分析樣本的DNA甲基化水平，并與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，評(píng)估樣本的致瘤性/成瘤性風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)樣本PM值大于等于60.00時(shí)，判定為甲基化陽性；當(dāng)樣本PM值小于60.00時(shí)，判定為甲基化陰性。風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)劃分低風(fēng)險(xiǎn)：PM值小于60.00（甲基化陰性），即未發(fā)現(xiàn)TAGMe出現(xiàn)高甲基化。該批次產(chǎn)品的甲基化水平穩(wěn)定，未見顯著異常變化，通常表示細(xì)胞產(chǎn)品安全性較高。中等風(fēng)險(xiǎn)：PM值在60.00至80.00之間，TAGMe出現(xiàn)輕微的高甲基化。該批次產(chǎn)品存在一定的成瘤性/致瘤性風(fēng)險(xiǎn)，需進(jìn)行更加嚴(yán)格的質(zhì)控，并可能需要進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證或修正生產(chǎn)工序。高風(fēng)險(xiǎn)：PM值大于或等于80.00，TAGMe顯示高甲基化，提示細(xì)胞可能具有較高的致瘤性或成瘤性。該批次產(chǎn)品的甲基化水平明顯異常，提示可能存在嚴(yán)重的癌變風(fēng)險(xiǎn)，建議暫停臨床應(yīng)用或進(jìn)一步進(jìn)行工藝優(yōu)化。質(zhì)量控制與驗(yàn)證陽性對(duì)照陽性對(duì)照的PM值應(yīng)大于等于60.00，表明目標(biāo)甲基化位點(diǎn)在陽性對(duì)照中正確被檢測到，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的有效性和靈敏度。陰性對(duì)照陰性對(duì)照的PM值應(yīng)小于60.00，說明在無DNA甲基化的情況下，實(shí)驗(yàn)沒有產(chǎn)生任何非特異性信號(hào)。重復(fù)性測試所有樣本應(yīng)進(jìn)行至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（即三個(gè)技術(shù)重復(fù)），特別是在臨床試驗(yàn)或細(xì)胞產(chǎn)品放行測試中。分析重復(fù)實(shí)驗(yàn)的PM值，計(jì)算每個(gè)樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。標(biāo)準(zhǔn)偏差較小的樣本結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)具有較高的一致性和可重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)過程中的質(zhì)量控制樣本質(zhì)量控制：在每次實(shí)驗(yàn)前，需確保提取的DNA質(zhì)量符合要求。DNA的純度（如OD260/280比值）應(yīng)達(dá)到1.8-2.0之間，且濃度適合PCR反應(yīng)（50ng-100ng）。質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)記錄與評(píng)估：實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)詳細(xì)記錄，包括樣本信息、陽性/陰性對(duì)照、重復(fù)性測試結(jié)果等。空白對(duì)照：每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照（僅加入緩沖液和試劑，不加入DNA），以排除試劑污染和操作誤差帶來的影響。標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）制定詳細(xì)的SOP，包括樣本處理、DNA提取、PCR擴(kuò)增、數(shù)據(jù)分析等所有步驟。每個(gè)操作步驟都應(yīng)嚴(yán)格按照SOP執(zhí)行，以減少人為誤差，確保結(jié)果的可靠性。安全措施實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備：所有實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)佩戴實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)人防護(hù)裝備（PPE），包括實(shí)驗(yàn)服、一次性手套、護(hù)目鏡和面罩，避免直接接觸化學(xué)品、試劑和可能感染性材料。在處理可能含有生物危害的樣本時(shí)，應(yīng)佩戴適當(dāng)?shù)目谡?，以防止樣本中的微?；虿≡w傳播。樣本與試劑處理10.2.1生物樣本處理：所有的細(xì)胞樣本、血液樣本、體液樣本等可能含有病原的物質(zhì)都應(yīng)視為潛在感染源。處理時(shí)應(yīng)使用專用的生物安全柜進(jìn)行操作，確?？諝饬魍?。10.2.2化學(xué)品和試劑處理：在操作DNA提取試劑、PCR試劑盒等化學(xué)品時(shí)，嚴(yán)格按照化學(xué)品的安全數(shù)據(jù)表（SDS）規(guī)定使用。特別是有機(jī)溶劑、酸、堿、苯類化學(xué)品等，在使用過程中應(yīng)佩戴防護(hù)手套，并操作于通風(fēng)柜內(nèi)。操作環(huán)境安全10.3.1實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)：確保實(shí)驗(yàn)室配備有效的通風(fēng)系統(tǒng)，避免因化學(xué)試劑或生物樣本操作所產(chǎn)生的有害氣體或微粒對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成危害。特別是在使用溶劑或處理可能存在生物危害的樣本時(shí)，必須在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行操作。10.3.2生物安全柜使用：處理任何可能含有致病微生物或人源性細(xì)胞時(shí)，必須在認(rèn)證的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作。廢物處置實(shí)驗(yàn)廢棄物的分類與處理：所有實(shí)驗(yàn)廢棄物都應(yīng)根據(jù)危險(xiǎn)性進(jìn)行分類，并放入相應(yīng)的生物廢物容器中。使用過的細(xì)胞樣本、培養(yǎng)皿、試劑等，必須按照生物危險(xiǎn)廢物進(jìn)行處理，交由專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行滅菌、消毒或丟棄。緊急處理與事故應(yīng)對(duì)10.5.1化學(xué)品泄漏處理：遇到化學(xué)試劑泄漏，應(yīng)立即穿戴防護(hù)設(shè)備進(jìn)行處理。使用適當(dāng)?shù)奈詹牧希ㄈ缥图?、活性炭）吸收泄漏的化學(xué)物質(zhì)，避免其擴(kuò)散。10.5.2生物樣本泄漏處理：在處理生物樣本泄漏時(shí)，應(yīng)立即清理現(xiàn)場，并使用適當(dāng)?shù)南緞ㄈ?5%乙醇、漂白水等）進(jìn)行徹底消毒。實(shí)驗(yàn)記錄與人員培訓(xùn)10.6.1記錄管理：實(shí)驗(yàn)過程中的所有操作步驟、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和異常情況應(yīng)詳細(xì)記錄，并確保所有記錄符合實(shí)驗(yàn)室管理要求。10.6.2人員培訓(xùn)：實(shí)驗(yàn)室所有人員在操作前必須經(jīng)過培訓(xùn)，熟悉TAGMe?技術(shù)的使用流程和安全操作規(guī)程。方法性能指標(biāo)檢出限本方法可根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)確定其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)品致瘤性/成瘤性風(fēng)險(xiǎn)的檢出限。靈敏度靈敏度應(yīng)≥95%。特異性特異性應(yīng)≥95%。假陰性率假陰性率應(yīng)≤5%。假陽性率假陽性率應(yīng)≤5%。附錄（資料性）TAGMe?DNA甲基化檢測報(bào)告樣本信息樣本ID：____________________________樣本類型：__________________________(如干細(xì)胞、免疫細(xì)胞等)來源/供者信息：_____________________樣本收集日期：______________________檢測日期：__________________________檢測人員：__________________________實(shí)驗(yàn)條件PCR儀器型號(hào)：______________________DNA提取方法：_______________________質(zhì)控結(jié)果：合格/不合格陽性對(duì)照：合格/不合格陰性對(duì)照：合格/不合格主要發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因甲基化水平：目標(biāo)基因：_______________________甲基化PM值：______________________結(jié)果：陽性/陰性檢測結(jié)論總體評(píng)估：細(xì)胞產(chǎn)品的DNA甲基化狀態(tài)提示其致瘤性/成瘤性風(fēng)險(xiǎn)較低/較高（根據(jù)甲基化檢測結(jié)果）。陽性結(jié)果：提示細(xì)胞產(chǎn)品可能存在潛在的致瘤性或成瘤