THXCY-紫花苜蓿維生素E測(cè)定技術(shù)規(guī)程VIP

T/HXCYXXX—2025ICS65.020B20團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/HXCYXXX-2025紫花苜蓿維生素E測(cè)定技術(shù)規(guī)程TechnicalSpecificationforDeterminationofVitaminEinMedicagoSativa（征求意見稿）2025-XX-XX發(fā)布2025-XX-XX實(shí)施北京華夏草業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟發(fā)布

目次 前言 紫花苜蓿維生素E測(cè)定技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了紫花苜蓿中維生素E測(cè)定技術(shù)的術(shù)語和定義、原理、試劑和材料、儀器設(shè)備、分析步驟、分析結(jié)果的表述、精密度等內(nèi)容。本文件適用于紫花苜蓿中維生素E的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3術(shù)語和定義3.1紫花苜蓿MedicagoSativaL.紫花苜蓿（MedicagoSativaL.）為豆科苜蓿屬多年生草本植物，根系發(fā)達(dá)，有“牧草之王”的美譽(yù)。3.2維生素EVitaminE維生素E（VitaminE）是生育酚類物質(zhì)的總稱，是一種金黃色或者淡黃色的油狀物，在動(dòng)物機(jī)體中無法合成，是最主要的抗氧化劑之一。4原理試樣中的維生素E經(jīng)甲醇：三氯甲烷溶液提取、濃縮后，C30反相液相色譜柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。5試劑和材料除另有說明外，所用試劑均為分析純，提取用水應(yīng)符合GB/T6682中三級(jí)水的要求。5.1試劑5.1.12，6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚：簡(jiǎn)稱BHT。5.1.2無水乙醇。5.1.3三氯甲烷。5.1.4甲醇：色譜純。5.2試劑配制5.2.1甲醇：三氯甲烷溶液（2：1，V：V）：稱取0.015g2，6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚于燒杯中，加入100mL甲醇和50mL三氯甲烷，混勻備用。5.2.2甲醇：水溶液（95：5，V：V）：量取475mL甲醇，加入25mL水，混勻備用。5.3標(biāo)準(zhǔn)品5.3.1α-生育酚（C29H50O2，CAS號(hào)：10191-41-0）：純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.2β-生育酚（C28H48O2，CAS號(hào)：148-03-8）：純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.3γ-生育酚（C28H48O2，CAS號(hào)：54-28-4）：純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.4δ-生育酚（C27H46O2，CAS號(hào)：119-13-1）：純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.4.1維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1.00mg/mL）：稱取4種生育酚異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品各50.0mg（準(zhǔn)確至0.1mg），用無水乙醇溶解于50mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液濃度約為1.00mg/mL。將溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，密封后，在-20℃避光保存，有效期6個(gè)月。臨用前將溶液回溫至室溫，并進(jìn)行濃度校正（校正方法參見附錄A）。5.4.2維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液（10.00μg/mL）：準(zhǔn)確吸取維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1.00mL于同一100mL容量瓶中，用甲醇：水溶液（95：5，V：V）定容至刻度，此溶液中維生素E各生育酚濃度為10.00μg/mL。5.4.3維生素E標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取維生素E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇：水溶液（95：5，V：V）定容至刻度，該標(biāo)準(zhǔn)系列中4種生育酚濃度分別為0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL。5.5材料5.5.1有機(jī)系濾膜（孔徑為0.45μm）。6儀器設(shè)備6.1天平：感量為0.0001g。6.2離心機(jī)：轉(zhuǎn)速14000g。6.3旋渦混合器。6.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。6.5紫外分光光度計(jì)。6.6高效液相色譜儀：帶熒光檢測(cè)器。7分析步驟7.1試樣制備稱取50mg新鮮葉片在液氮中研磨至均勻一致，儲(chǔ)存于離心管中，樣品現(xiàn)用現(xiàn)制備。7.2提取向儲(chǔ)存樣品的離心管中加入1mL甲醇：三氯甲烷溶液（2：1，V：V），室溫避光放置20min。然后加入300μL三氯甲烷和600μL水，渦旋混合均勻后，14000g離心10min。棄去上層水相，將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)入三角瓶中。7.3濃縮將三角瓶接到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于40°C水浴中減壓濃縮至近干，用400μL甲醇溶解三角瓶中的殘留物，過0.45μm有機(jī)系濾膜后供高效液相色譜測(cè)定。7.4色譜參考條件7.4.1C30色譜柱，柱長(zhǎng)250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm，或具同等性能的色譜柱；7.4.2柱溫：30℃；7.4.3流動(dòng)相：甲醇：水溶液（95：5，V：V）；7.4.4流速：1mL/min；7.4.5激發(fā)波長(zhǎng)：294nm，發(fā)射波長(zhǎng)：328nm；7.4.6進(jìn)樣量：20μL。7.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將維生素E標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液分別注入高效液相色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算直線回歸方程。7.6樣品測(cè)定試樣液經(jīng)高效液相色譜儀分析，測(cè)得峰面積，采用外標(biāo)法通過上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。8分析結(jié)果的表述試樣中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的含量按式（1）計(jì)算：Xi=c×V×100m×1000…………式中：Xi-試樣中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；c-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；VQUOTE-試樣溶液定容的體積，單位為毫升（mL）；m-試樣的稱樣量，單位為克（g）；100-換算為100克樣品中含量的換算系數(shù)；1000-將濃度單位μg/mL換算為mg/mL的換算系數(shù)。試樣中維生素E的含量按式（2）計(jì)算：X=Xα+Xβ+X式中：X-試樣中維生素E的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；Xα-試樣中α-生育酚的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；Xβ-試樣中β-生育酚的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；Xγ-試樣中γ-生育酚的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；Xδ-試樣中δ-生育酚的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）。以兩次測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。9精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。10其他當(dāng)取樣量為50mg，定容0.4mL時(shí)，各生育酚的檢出限為32μg/100g，定量限為100μg/100g。

附錄A（資料性）維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度校正方法維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液配制后，在使用前需要對(duì)其濃度進(jìn)行校正，具體操作如下：分別取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液500μL于各10mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，混勻，分別用1cm石英比色杯，以無水乙醇為空白參比，按表A.1的測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度。試液中維生素E的濃度按式（A.1）計(jì)算：X=A×10000式中：X-維生素E標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度