《鐵皮石斛繁育種子袋生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》

1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鐵皮石斛真菌-種子袋生產(chǎn)前原料準(zhǔn)備、鐵皮石斛種子活力檢驗(yàn)、真菌-種子袋生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)、安全防護(hù)措施、質(zhì)量要求、真菌-種子袋質(zhì)量檢驗(yàn)、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸和貯存等技術(shù)要求。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測(cè)定3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1真菌-種子袋Fungus-seedbags一種專門為鐵皮石斛種子在野外進(jìn)行直播而設(shè)計(jì)的繁殖用品，由鐵皮石斛種子、水苔等按照特定配比混合制成。4真菌-種子袋原料準(zhǔn)備4.1準(zhǔn)備茶包袋采購?fù)笟?、易降解的紙質(zhì)茶包袋（長(zhǎng)*寬：6.2*5.5cm），備用。4.2菌粉制作4.2.1菌株選擇選用石斛蠟殼菌（SerendipitaoficinaleX.J.Wang）專用菌株。4.2.2菌株活化該平板預(yù)先準(zhǔn)備好馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA；馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L,瓊脂20g/L，pH=5.8-6）；利用接種環(huán)，從試管斜面中取出一小塊石斛蠟殼菌（SerendipitaoficinaleX.J.Wang）菌種，將菌塊置于平板中心，用封口膜將平板密封，放置在25±2℃的培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)，約10天，待真菌菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，即可將其作為后續(xù)的接種物。4.2.3配制培養(yǎng)基a.配制馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB；配方：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L,pH=5.8-6）。2b.分裝300ml培養(yǎng)基至錐形瓶（500ml）中，用錫箔紙密封好瓶口，然后將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶放入高壓滅菌鍋中，設(shè)定條件為121℃下滅菌20分鐘。滅菌完成后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)上冷卻至室溫，以備后續(xù)使用。4.2.4擴(kuò)繁真菌a.在超凈工作臺(tái)上，使用已滅菌的尖鑷切取步驟4.2.2中獲得的菌塊，迅速將6-7塊菌塊（約1*1cm）轉(zhuǎn)接到裝有步驟4.2.3預(yù)備的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中。b.接菌操作完成后，立即用錫箔紙密封錐形瓶口，再用兩層報(bào)紙?jiān)俅伟靠?，用橡膠圈進(jìn)行固c.將含有培養(yǎng)基和菌塊的錐形瓶放置于振蕩培養(yǎng)箱中，啟動(dòng)儀器進(jìn)行振蕩培養(yǎng)（25℃±2℃,200轉(zhuǎn)/分），以促進(jìn)真菌的孵化擴(kuò)繁。培養(yǎng)15天左右，菌絲就能長(zhǎng)滿；冬季，培養(yǎng)時(shí)間可能需要延長(zhǎng)至20天左右，以確保菌絲生長(zhǎng)充分。4.2.5菌粉配制a.利用尼龍網(wǎng)過濾步驟4.2.4中得到的含有培養(yǎng)基和菌絲的混合液，以分離出菌絲。移除溶液，僅保留菌絲，并使其自然瀝干，得到純凈的菌絲。b.將純菌絲與瓊脂以1∶2的重量比混合，放入多功能粉碎機(jī)中，進(jìn)行4秒的快速粉碎，然后暫停機(jī)器，等待儀器完全停止，打開蓋子，用干凈玻璃棒進(jìn)行攪拌，確保菌絲充分粉碎，再次啟動(dòng)粉碎機(jī)進(jìn)行3秒的粉碎，以獲得粒徑均勻的菌粉。c.將得到的菌粉倒入潔凈的不銹鋼托盤中，攤平，厚度不超過1cm。將托盤放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在28℃的溫度下吹風(fēng)烘干24-36小時(shí)（期間適當(dāng)攪拌菌粉，確保菌粉充分干燥）。此過程完成后，使得菌粉的含水率降至大約10%，至此菌粉已準(zhǔn)備好，可用于后續(xù)步驟。5鐵皮石斛種子活力檢驗(yàn)鐵皮石斛種子使用前，先使用TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）染色法對(duì)種子活力進(jìn)行測(cè)定，保證種子活力達(dá)到90%以上，備用。具體方法見附錄A。6真菌-種子袋生產(chǎn)技術(shù)6.1配制菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末稱取200g步驟4.2.5獲得的菌粉，再精確稱取0.01g（約10000顆種子）活力達(dá)標(biāo)的鐵皮石斛種子，將菌粉和種子進(jìn)行混合均勻，獲得菌粉+種子混合粉末，使得每克菌粉+種子混合粉末中約含有50顆種子。6.2分裝水苔取約0.03g干燥水苔，裝入茶包袋中。6.3分裝菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末使用不銹鋼藥勺取約0.2g菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末，裝入含有0.08g水苔的茶包袋中，每袋茶包袋包含約10顆種子，折疊袋口，即可生產(chǎn)獲得鐵皮石斛真菌-種子袋。6.4打包3每50袋鐵皮石斛真菌-種子袋，用橡皮筋捆成一捆；每100捆裝入一個(gè)防水、防潮的自封袋中，抽真空，4℃條件貯存。7安全防護(hù)措施7.1應(yīng)對(duì)生產(chǎn)操作人員進(jìn)行安全防護(hù)知識(shí)培訓(xùn)，操作人員應(yīng)了解所用試劑、儀器的使用說明以及注意事項(xiàng)。7.2應(yīng)對(duì)操作高壓滅菌工作人員進(jìn)行特種設(shè)備培訓(xùn)，且必須獲得中華人民共和國(guó)特種設(shè)備安全管理和作業(yè)人員證。7.3鐵皮石斛真菌-種子袋生產(chǎn)操作過程中的生產(chǎn)人員應(yīng)當(dāng)穿著實(shí)驗(yàn)服，佩戴防塵口罩、橡膠手套。7.4生產(chǎn)場(chǎng)所應(yīng)保持清潔、通風(fēng)透氣。8質(zhì)量要求質(zhì)量合格的鐵皮石斛真菌-種子袋的萌發(fā)率應(yīng)大于等于95%，含水率10%-12%，菌粉量0.2-0.3g。9真菌-種子袋質(zhì)量檢驗(yàn)9.1抽樣每批真菌-種子袋生產(chǎn)完成后，隨機(jī)從10000袋真菌-種子袋抽取35袋，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)試驗(yàn)9.2萌發(fā)率檢驗(yàn)a.將已發(fā)酵的松樹皮（6-9mm）浸泡三天，以便充分吸水。之后，使用高壓滅菌鍋對(duì)其進(jìn)行滅菌處理，確保松樹皮的無菌狀態(tài)。冷卻后，將松樹皮均勻地鋪（厚度：2-3cm）到塑料飯盒中。b.手動(dòng)將鐵皮石斛真菌-種子袋中的粉末抖均勻，并用干凈水源充分浸泡（浸泡5-10分鐘），直至濕透。c.將濕潤(rùn)的真菌-種子袋放置于松樹皮基質(zhì)上，緊接著蓋上飯盒蓋。d.最后將塑料飯盒放置在組織培養(yǎng)室內(nèi)（25℃±2℃,光照周期：12/12h光/暗，光照強(qiáng)度：2000lx）中進(jìn)行共生萌發(fā)培養(yǎng)。9.3萌發(fā)率評(píng)估共生萌發(fā)培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)鐵皮石斛真菌-種子袋的萌發(fā)情況。萌發(fā)率（%）=成功萌發(fā)袋數(shù)/總袋數(shù)*100%。9.4菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末含水率檢驗(yàn)菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末長(zhǎng)期貯存要求的含水率與鐵皮石斛種子貯存要求的含水率一致，因此統(tǒng)一按照GB/T3543.6的規(guī)定進(jìn)行含水率檢驗(yàn)。9.5真菌-種子袋菌粉量檢驗(yàn)每批真菌-種子袋生產(chǎn)完成后，按照步驟9.1隨機(jī)取樣，使用天平依次稱重每袋真菌-種子袋的菌粉重量。9.6檢驗(yàn)結(jié)果判定4上述報(bào)告中若有一項(xiàng)不合格，即判定為不合格鐵皮石斛真菌-種子袋，并在檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告中注明處理意見。10標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存10.1標(biāo)志標(biāo)志應(yīng)在包裝上，標(biāo)志上應(yīng)當(dāng)注明鐵皮石斛真菌-種子袋中的有效真菌成分、含量、相關(guān)專利以及注意事項(xiàng)。10.2包裝外包裝應(yīng)使用防水、防潮材料。包裝材料使用后進(jìn)行合理處理，避免環(huán)境污染。