微生物菌種保藏

微生物菌種保藏技術(shù)2011級微生物學(xué)劉艷敏菌種是進(jìn)行微生物學(xué)研究和應(yīng)用的基本材料，是發(fā)展生物工程的重要基礎(chǔ)條件之一，是國家的重要生物資源。微生物個體微小，代謝活躍，生長繁殖快，如果保存不妥容易發(fā)生變異，或被其他微生物污染，甚至導(dǎo)致微生物死亡，這種現(xiàn)象屢見不鮮。菌種的長期保藏對任何微生物學(xué)工作者都是很重要的，而且也是非常必要的。菌種保藏要求各保藏管理中心所保藏的菌種，必須具有該菌種的詳細(xì)歷史及有關(guān)實(shí)驗(yàn)資料。并對其所負(fù)責(zé)保藏的菌種均應(yīng)采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌種的污染或死亡。微生物菌種保藏基本原理是在挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使新陳代謝處于最低或幾乎停止的狀態(tài)，即使其處于休眠狀態(tài)基礎(chǔ)上，人為地創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境，使其長期保存后仍能保持菌種原有的優(yōu)良特性。基本措施是低溫、真空、干燥。常用保藏方法定期移植法液體石蠟法真空冷凍干燥法

-80℃低溫凍結(jié)法液氮超低溫凍結(jié)法（一）定期移植法亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，待得到健壯的菌體后，于4～6℃進(jìn)行保存并間隔一定時間（3-6個月）進(jìn)行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。操作步驟：

斜面制備接種培養(yǎng)保藏

斜面制備培養(yǎng)基配制分裝滅菌擺放斜面接種培養(yǎng)：細(xì)菌37℃，1-2d酵母28~30℃，2~3d絲狀真菌26℃，5~7d保藏：4~6℃，保藏3~6個月。方法總結(jié)操作簡單，使用方便；對設(shè)備和人員要求不高；可隨時使用，便于觀察菌種；工作勞動強(qiáng)度大，屬短期保藏，保藏成本高；菌種傳代頻繁，易退化、污染。（二)液體石蠟法亦稱礦物油保藏法，定期移植保藏法的輔助方法。指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至待得到健壯的菌體后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。操作步驟：液體石蠟預(yù)處理斜面培養(yǎng)物制備灌注石蠟保藏優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟滅菌：121℃濕熱滅菌30min，蒸發(fā)水分；160℃干熱滅菌2h；冷卻至室溫。液面高出斜面頂部1cm4～6℃，干燥處；直立放置；保藏時間1～2年。方法總結(jié)操作簡單，使用比較方便；對設(shè)備要求不高，對人員操作水平有一定要求；工作勞動強(qiáng)度大，保藏成本較高；菌種易退化、污染。(三)真空冷凍干燥法指將保藏的菌種細(xì)胞或孢子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長期菌種保存方法。安瓿管，又叫安瓿瓶，簡稱安瓿，指裝注射劑用的密封的小玻璃瓶，用藥時將瓶頸的上端弄破。1、安瓿管的準(zhǔn)備

清洗

選用中性玻璃材質(zhì)的安瓿管；2%鹽酸浸泡8～10h，自來水沖洗至中性，蒸餾水沖洗2～3次；

置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；標(biāo)簽

激光打印標(biāo)簽，標(biāo)明菌株編號和保藏日期，大小約10×20mm。

噴碼于安瓿管外，160℃固定20min。滅菌同一菌種安瓿管包在一起，121℃濕熱滅菌30min.2、保護(hù)劑的準(zhǔn)備保護(hù)劑：12%脫脂牛奶蒸餾水溶液，2～5ml/管；滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中，113℃滅菌20min；打開放氣閥緩慢排出蒸汽，取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻；30℃培養(yǎng)2天，無菌檢查合格后備用。3、凍干樣品制備制備斜面培養(yǎng)物；將保護(hù)劑用無菌吸管注入到斜面培養(yǎng)物上，用吸管刮取斜面上的菌體，使菌體均勻地懸浮在保護(hù)劑內(nèi)。用長毛細(xì)滴管將菌懸液分裝到安瓿管內(nèi)，0.1～0.2ml/管，操作時要把帶有菌懸液的長毛細(xì)滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。4、預(yù)凍制備菌懸液、經(jīng)分裝到進(jìn)行預(yù)凍之間的時間不宜超過1h；分裝完成后將安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱預(yù)凍1h，使菌液完全凍結(jié)；可采用分段式預(yù)凍，先將分裝好的安瓿管置－20℃凍30分鐘，再放入－80℃冰箱凍30min；采用離心式凍干裝置時勿需預(yù)凍。5、真空干燥在開動真空泵后應(yīng)使真空度在15min內(nèi)達(dá)到66.5Pa，隨后逐漸達(dá)到26.6～13.3Pa，在此條件下，樣品將保持凍結(jié)狀態(tài)，其中水分則不斷升華，干燥才能順利地進(jìn)行。終止干燥時間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀真空度接近空載時的最高值樣品溫度與管外溫度接近選用1～2支對照管，其水份與菌懸液同量，當(dāng)其水分完全蒸發(fā)時視為干燥完結(jié)

6、熔封將安瓿管的中上部用火焰燒軟，拉成細(xì)頸；將安瓿管裝到多歧管上，開啟真空泵，當(dāng)真空度達(dá)到1.33Pa時，用火焰在細(xì)頸處熔封，嚴(yán)格的密封會使安瓿管上產(chǎn)生一個小窩；拉管時注意火焰不要離菌體太近，以免影響菌體的活力。7、真空度檢測

用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內(nèi)呈現(xiàn)灰藍(lán)色光，說明真空度符合要求。檢查時高頻電火花應(yīng)射向安瓿管的上半部，切勿直接射向樣品，以免影響其中的菌種。8、保藏4～6℃下避光保藏，一般可保藏8～10年。方法總結(jié)

保藏、運(yùn)輸方便；保藏時間長(5～10年)；對設(shè)備要求高(真空冷凍干燥機(jī)、多歧管),對人員操作水平要求高；冷凍干燥過程對菌體有損傷，需恢復(fù)培養(yǎng)。(四）－80℃冰箱凍結(jié)法將菌種懸浮于保護(hù)劑中，在－80℃冰箱中凍結(jié)保存的一種長期菌種保藏方法。準(zhǔn)備冷凍

管準(zhǔn)備保護(hù)劑（10%-15%甘油)準(zhǔn)備菌懸液（細(xì)胞、孢子或芽孢懸液）制備冷凍管（取菌懸液和保護(hù)劑至冷凍管）保藏（-80℃，2～5年）方法總結(jié)

使用比較方便；保藏時間較長；對設(shè)備要求高(-80℃冰箱)；運(yùn)輸不方便。（五）液氮超低溫凍結(jié)法

指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮?dú)庀嘀斜４娴囊环N長期菌種保藏方法。操作步驟冷凍管準(zhǔn)備保護(hù)劑制備同“－80℃冰箱凍結(jié)法”保藏培養(yǎng)物準(zhǔn)備預(yù)凍---將程序降溫系統(tǒng)預(yù)冷到4℃，將制備好的冷凍管放入其中，以1℃/min降溫速率降至-35℃；

---使用程序降溫盒。保藏將預(yù)凍后的冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮?dú)庀?-150℃)或液相(-196℃)。方法總結(jié)保藏時間長；保藏效果好，菌種不易退化；對設(shè)備要求高(程控降溫儀、液氮罐)，對人員操作水平要求高；保藏成本高。不同保藏方法的比較保藏方法保藏原理保藏時間保藏設(shè)備菌種活性保藏成本操作性定期移植法低溫（4℃）3～6月冰箱易退化高簡單液體石蠟法低溫（4℃）阻斷氧氣1～2年冰箱退化較高比較簡單真空冷凍干燥法干燥、低溫、無氧、保護(hù)劑8～10年－80℃冰箱、真空冷凍干燥機(jī)、封管設(shè)備退化低復(fù)雜-80℃冰箱凍結(jié)法低溫（-80℃）、保護(hù)劑2～5年－80℃冰箱退化較低復(fù)雜液氮超低溫凍結(jié)法超低溫(-150℃或-196℃）、保護(hù)劑無期限程控降溫儀、液氮運(yùn)輸罐及液氮罐不易退化高復(fù)雜菌種保藏技術(shù)進(jìn)展程序降溫控制技術(shù)原位低溫保藏技術(shù)有些菌種不可培養(yǎng)，也無法采用標(biāo)準(zhǔn)的冷凍干燥技術(shù)保藏，如一些致病菌、無法培養(yǎng)的菌種或者與其他微生物共生的菌種（如菌根真菌）等。這些菌種可采用原位低溫保藏技術(shù)，這一技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用在一些銹菌種的保藏過程中。包埋固定化技術(shù)是在藻酸鈣顆?；蚱渌|(zhì)中進(jìn)行的。含有藻酸鈉的菌懸浮液加入氯化鈣后會形成藻酸鈣固定化細(xì)胞，細(xì)胞一旦固定化，便可采取傳統(tǒng)的凍干保藏方法進(jìn)行保藏。這種固定化技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用在真菌中，并延伸至線蟲和藻類。玻璃化技術(shù)就是用極快的冷卻速率，使細(xì)胞及其所處的溶液來不及形成冰晶，一下子以“非晶體”的方式固化下來，可以阻止冰晶體對細(xì)胞的破壞作用。對于1微米直徑的純凈水滴，只有當(dāng)冷卻速率高達(dá)107℃/秒時才能實(shí)現(xiàn)“玻璃化”。國內(nèi)認(rèn)可的菌種收藏機(jī)構(gòu)1979年7月，全國第一屆菌種保藏管理會議正式成立中國菌種保藏管理委員會（CCCCM），委員會下設(shè)7個全國性菌種保藏管理中心及機(jī)構(gòu)所在地：普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）,中國科學(xué)院微生物研究所農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）,中國農(nóng)科院區(qū)劃所工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC），中國藥品生物制品鑒定所抗菌素菌種保藏管理中心（CACC），中國醫(yī)科院醫(yī)用生物技術(shù)研究所