解析CTCF在小鼠2CLCs中功能與作用機制：從分子網(wǎng)絡(luò)到細胞命運調(diào)控

解析CTCF在小鼠2CLCs中功能與作用機制：從分子網(wǎng)絡(luò)到細胞命運調(diào)控一、引言1.1研究背景在生命科學(xué)的廣袤領(lǐng)域中，細胞命運調(diào)控和胚胎發(fā)育機制一直是備受矚目的核心議題。CTCF（CCCTC-bindingfactor）作為一種在哺乳動物中高度保守的DNA結(jié)合蛋白，自被發(fā)現(xiàn)以來，便在眾多生物學(xué)過程中展現(xiàn)出不可或缺的關(guān)鍵作用，成為了生物學(xué)研究領(lǐng)域的焦點之一。CTCF最初是以染色質(zhì)絕緣子結(jié)合蛋白的身份進入科學(xué)家們的視野，隨著研究的不斷深入，其在染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)調(diào)控中的核心地位逐漸凸顯。它如同一位精心的建筑師，通過識別特定的DNA基序，精準地結(jié)合到染色質(zhì)上，進而作為穩(wěn)固的錨點，將染色質(zhì)環(huán)固定，為構(gòu)建復(fù)雜而有序的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)奠定了堅實基礎(chǔ)。這種三維結(jié)構(gòu)絕非僅僅是一種靜態(tài)的存在，它與基因的表達調(diào)控緊密相連，宛如一條無形的紐帶，牽系著細胞的命運走向。在胚胎發(fā)育的關(guān)鍵進程中，染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)在囊胚時期的有序建立，恰好伴隨著第一次細胞命運決定的發(fā)生，這一過程仿佛是生命樂章中的關(guān)鍵節(jié)點，而CTCF則在其中扮演著舉足輕重的指揮角色，深度參與細胞從全能性向多能性以及后續(xù)分化的精細調(diào)控。一旦CTCF的功能缺失，就如同大廈失去了關(guān)鍵的支柱，會導(dǎo)致囊胚發(fā)育陷入異常，胚胎的正常生長進程也會被無情阻斷，最終走向死亡的結(jié)局。在小鼠的早期胚胎發(fā)育進程中，合子基因組激活（ZGA）是一個具有里程碑意義的關(guān)鍵事件。這一過程標志著胚胎基因組開始擺脫母源物質(zhì)的主導(dǎo)，正式開啟自主調(diào)控的新篇章。而在ZGA發(fā)生的關(guān)鍵階段——2-細胞期，一種特殊的細胞群體——二細胞樣細胞（two-celllikecells,2CLCs）出現(xiàn)了。2CLCs猶如胚胎發(fā)育長河中的一顆獨特明珠，在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳修飾水平上，與2-細胞胚胎高度相似，這使得它們成為了研究細胞全能性和早期胚胎發(fā)育機制的絕佳模型。在2CLCs中，一系列內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（如MERVL）和2C特異性基因被激活，這些基因的激活猶如生命密碼的解鎖，驅(qū)動著細胞展現(xiàn)出全能性的特征。然而，如同神秘的寶藏被層層迷霧所籠罩，2CLCs中這些基因的激活機制以及CTCF在其中扮演的角色，至今仍隱藏在重重謎團之中，亟待科學(xué)家們?nèi)ド钊胩剿骱徒沂?。對CTCF在小鼠2CLCs中的功能與機制展開深入研究，具有極其重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。從理論層面來看，這一研究有望為我們揭開細胞命運調(diào)控和胚胎發(fā)育機制的神秘面紗，填補我們在這一領(lǐng)域的知識空白，為生命科學(xué)的基礎(chǔ)理論研究增添濃墨重彩的一筆。通過深入剖析CTCF在2CLCs中的作用機制，我們能夠更加深入地理解細胞如何在特定的發(fā)育階段，通過精確的基因調(diào)控，實現(xiàn)全能性的維持或轉(zhuǎn)變，這對于我們把握生命發(fā)育的本質(zhì)規(guī)律具有不可估量的價值。在應(yīng)用前景方面，這項研究成果或許能夠為再生醫(yī)學(xué)帶來新的曙光。我們或許能夠借助對CTCF功能的深入理解，找到更加有效的方法，誘導(dǎo)細胞獲得全能性或多能性，為細胞治療和組織工程提供更加優(yōu)質(zhì)的細胞來源。這不僅有助于攻克一些目前難以治愈的疾病，如器官衰竭、神經(jīng)退行性疾病等，還可能為人類健康事業(yè)帶來革命性的突破。1.2研究目的和意義本研究旨在深入剖析CTCF在小鼠2CLCs中的功能與作用機制，通過一系列實驗和分析手段，精準解析CTCF對2CLCs中基因表達和染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的調(diào)控方式，為細胞命運調(diào)控和胚胎發(fā)育機制的研究提供關(guān)鍵的理論依據(jù)。從理論層面來看，本研究成果將為細胞命運調(diào)控和胚胎發(fā)育機制的基礎(chǔ)理論研究注入新的活力。2CLCs作為研究細胞全能性和早期胚胎發(fā)育機制的重要模型，其基因激活機制和細胞全能性維持的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。通過探究CTCF在2CLCs中的功能與機制，我們能夠更加深入地理解細胞全能性的本質(zhì)，揭示細胞如何在特定的發(fā)育階段，通過精確的基因調(diào)控實現(xiàn)全能性的維持或轉(zhuǎn)變。這不僅有助于填補我們在細胞命運調(diào)控和胚胎發(fā)育機制領(lǐng)域的知識空白，還將為進一步研究細胞分化、組織器官發(fā)育等重要生物學(xué)過程提供堅實的理論基礎(chǔ)。例如，研究CTCF對2CLCs中內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和2C特異性基因的激活調(diào)控機制，有望揭示細胞全能性激活的關(guān)鍵分子開關(guān)，為理解胚胎發(fā)育早期的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要線索。在實際應(yīng)用方面，本研究成果具有廣闊的應(yīng)用前景，可能為再生醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域帶來新的突破。再生醫(yī)學(xué)致力于利用干細胞的分化潛能，修復(fù)或替代受損的組織和器官，以治療各種疑難病癥。深入了解CTCF在2CLCs中的功能，或許能夠幫助我們找到更加有效的方法，誘導(dǎo)細胞獲得全能性或多能性，為細胞治療和組織工程提供更加優(yōu)質(zhì)的細胞來源。比如，通過調(diào)控CTCF的功能，我們可能能夠提高誘導(dǎo)多能干細胞（iPSCs）的誘導(dǎo)效率和質(zhì)量，使其更接近胚胎干細胞的特性，從而為臨床治療提供更安全、有效的細胞資源。在生物技術(shù)領(lǐng)域，對CTCF功能的深入理解也可能為基因編輯、生物制藥等技術(shù)的發(fā)展提供新的思路和方法。例如，利用CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)調(diào)控機制，優(yōu)化基因編輯的效率和精準性，為基因治療和生物制藥的發(fā)展提供技術(shù)支持。二、CTCF與小鼠2CLCs概述2.1CTCF的結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)2.1.1CTCF的分子結(jié)構(gòu)特征CTCF作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，隸屬于boris+ctcf基因家族，其編碼產(chǎn)物具有獨特且復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)。最為顯著的特征是含有11個高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，這些鋅指結(jié)構(gòu)域如同精密的“分子鑰匙”，是CTCF能夠特異性識別并緊密結(jié)合不同DNA靶序列的關(guān)鍵元件。每個鋅指結(jié)構(gòu)域都由約30個氨基酸組成，通過特定的氨基酸殘基排列形成穩(wěn)定的空間構(gòu)象，其中的半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基與鋅離子配位，共同維持鋅指結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和功能性。在與DNA結(jié)合的過程中，CTCF的11個鋅指結(jié)構(gòu)域并非各自為戰(zhàn)，而是協(xié)同發(fā)揮作用。它們能夠以不同的組合方式，精準地識別DNA雙鏈上特定的核苷酸序列，這種高度特異性的識別能力使得CTCF能夠在龐大的基因組中定位到特定的位點，進而行使其生物學(xué)功能。研究表明，CTCF對某些DNA序列的結(jié)合親和力極高，解離常數(shù)（Kd）可低至納摩爾級別，這充分體現(xiàn)了其結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性。除了鋅指結(jié)構(gòu)域，CTCF還包含其他結(jié)構(gòu)區(qū)域，這些區(qū)域在調(diào)節(jié)鋅指結(jié)構(gòu)域與DNA的結(jié)合活性、以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用中發(fā)揮著不可或缺的作用。例如，其N端和C端的部分序列能夠與多種轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而進一步調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程。2.1.2CTCF在染色質(zhì)調(diào)控中的多功能角色CTCF在染色質(zhì)調(diào)控中扮演著極為關(guān)鍵且多面的角色，堪稱染色質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心樞紐之一。首先，CTCF作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠直接參與基因表達的調(diào)控。根據(jù)其結(jié)合位點的上下文環(huán)境以及與之相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物的不同，CTCF既可以作為轉(zhuǎn)錄激活劑，促進基因的轉(zhuǎn)錄；也能夠作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，抑制基因的表達。當CTCF結(jié)合包含組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）的復(fù)合物時，它可以促使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得松散，增加DNA與轉(zhuǎn)錄機器的可及性，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄。反之，當CTCF與包含組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）的復(fù)合物結(jié)合時，會導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密壓縮，阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，進而抑制基因的表達。CTCF還具有染色質(zhì)絕緣子的功能。它能夠與特定的染色質(zhì)絕緣子元件結(jié)合，在染色質(zhì)上形成物理屏障，有效阻斷增強子和上游啟動子之間的通訊，從而精細地調(diào)節(jié)基因的印跡表達。在印記基因Igf2的調(diào)控中，CTCF發(fā)揮著關(guān)鍵作用。位于Igf2基因下游的印記控制區(qū)具有絕緣子活性，在母源染色體上，該區(qū)域未被甲基化，CTCF能夠與之緊密結(jié)合，成功阻斷Igf2啟動子與下游增強子之間的相互作用，使得母源Igf2處于沉默狀態(tài)。而在父源染色體上，由于該區(qū)域被甲基化，CTCF無法結(jié)合，下游增強子得以激活父源Igf2的表達。這種基于CTCF的絕緣子功能的調(diào)控機制，確保了印記基因的單等位表達，對于胚胎發(fā)育和細胞分化過程中的基因表達平衡至關(guān)重要。CTCF還是染色質(zhì)架構(gòu)蛋白，在構(gòu)建和維持染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著核心作用。它通過同源二聚化的方式，促使DNA形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，深度參與基因組拓撲結(jié)構(gòu)域（TAD）邊界的形成，從而改變?nèi)旧|(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)。在細胞分裂間期，染色質(zhì)并非簡單地線性排列，而是在三維空間中呈現(xiàn)出復(fù)雜且高度有序的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)與細胞的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生物體的生長發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)成環(huán)過程，使得遠距離的DNA區(qū)域在空間上相互靠近，形成特定的染色質(zhì)環(huán)，這些染色質(zhì)環(huán)不僅有助于增強子與啟動子之間的相互作用，促進基因的精準表達調(diào)控，還在維持染色質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能完整性方面發(fā)揮著不可或缺的作用。一旦CTCF的功能缺失，染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)將遭到嚴重破壞，導(dǎo)致基因表達紊亂，進而影響細胞的正常生理功能和胚胎的發(fā)育進程。2.2小鼠2CLCs的特性與研究進展2.2.12CLCs的定義與特征二細胞樣細胞（two-celllikecells,2CLCs）是在小鼠胚胎干細胞（mESCs）中發(fā)現(xiàn)的一類特殊細胞群體，因其在轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組等多個層面展現(xiàn)出與2-細胞胚胎高度相似的特征而得名。在轉(zhuǎn)錄組水平上，2CLCs呈現(xiàn)出獨特的基因表達模式，一系列在2-細胞胚胎中特異性表達的基因，如內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒MERVL（murineendogenousretrovirusL）和Zscan4（ZincFingerAndSCANDomainContaining4）基因家族，在2CLCs中也被高度激活。這些基因的激活標志著2CLCs具有與2-細胞胚胎相似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控程序，暗示著它們在細胞全能性方面可能具有相似的特性。在表觀遺傳組層面，2CLCs同樣表現(xiàn)出與2-細胞胚胎的高度一致性。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，在2CLCs和2-細胞胚胎中呈現(xiàn)出相似的動態(tài)變化模式。在2-細胞胚胎發(fā)育階段，基因組DNA經(jīng)歷廣泛的去甲基化過程，這一過程對于合子基因組激活（ZGA）至關(guān)重要。2CLCs也表現(xiàn)出類似的DNA去甲基化特征，尤其是在2C特異性基因的調(diào)控區(qū)域，低甲基化狀態(tài)有利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而促進基因的激活。在組蛋白修飾方面，2CLCs和2-細胞胚胎也存在諸多相似之處。例如，H3K4me3（組蛋白H3賴氨酸4三甲基化）和H3K27ac（組蛋白H3賴氨酸27乙?；┑燃せ钚徒M蛋白修飾在2C特異性基因的啟動子區(qū)域高度富集，而H3K9me3（組蛋白H3賴氨酸9三甲基化）等抑制型組蛋白修飾則相對減少，這種組蛋白修飾的動態(tài)平衡共同維持了2CLCs的獨特轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和全能性特征。2CLCs在染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)上也與2-細胞胚胎具有相似性。染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)（如Hi-C）的研究結(jié)果表明，2CLCs的染色質(zhì)在三維空間中呈現(xiàn)出特定的折疊模式，與2-細胞胚胎的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)具有較高的相似性。這種相似的染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)可能為2C特異性基因的激活和調(diào)控提供了必要的空間環(huán)境，使得遠端的增強子和啟動子能夠在空間上相互靠近，從而促進基因的轉(zhuǎn)錄激活。2.2.22CLCs在細胞命運調(diào)控研究中的價值2CLCs作為研究細胞全能性和早期胚胎發(fā)育機制的獨特模型，在細胞命運調(diào)控研究領(lǐng)域具有不可替代的重要價值。細胞全能性是指單個細胞具有發(fā)育成完整生物體的能力，而2CLCs在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳水平上與2-細胞胚胎的高度相似性，使其成為研究細胞全能性調(diào)控機制的理想對象。通過對2CLCs的深入研究，我們能夠更加深入地了解細胞在全能性狀態(tài)下的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、表觀遺傳修飾動態(tài)變化以及染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的重塑機制，為揭示細胞全能性的本質(zhì)提供關(guān)鍵線索。在早期胚胎發(fā)育過程中，合子基因組激活是一個關(guān)鍵的生物學(xué)事件，標志著胚胎基因組開始主導(dǎo)胚胎的發(fā)育進程。2CLCs作為具有2-細胞胚胎特征的細胞群體，為研究合子基因組激活機制提供了重要的實驗材料。研究人員可以利用2CLCs，通過基因編輯、轉(zhuǎn)錄組測序、表觀基因組測序等技術(shù)手段，深入探究合子基因組激活過程中基因的激活順序、轉(zhuǎn)錄因子的作用機制以及表觀遺傳修飾的調(diào)控作用。通過對2CLCs中Zscan4和MERVL等基因的激活機制研究，發(fā)現(xiàn)這些基因的激活與特定的轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾密切相關(guān)，為合子基因組激活機制的研究提供了重要的理論依據(jù)。2CLCs在實際應(yīng)用研究中也展現(xiàn)出了巨大的潛力。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，2CLCs的全能性特征使其有可能成為一種理想的細胞來源，用于組織修復(fù)和器官再生。通過誘導(dǎo)2CLCs向特定的細胞類型分化，如心肌細胞、神經(jīng)細胞等，有望為治療心肌梗死、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等提供新的治療策略。在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對2CLCs的研究有助于深入理解胚胎發(fā)育的早期過程，為提高體外受精成功率、預(yù)防早期胚胎發(fā)育異常等提供理論支持和技術(shù)指導(dǎo)。三、CTCF在小鼠2CLCs中的功能研究3.1CTCF對2CLCs基因表達的調(diào)控3.1.1基于高通量測序的CTCF結(jié)合位點與基因表達關(guān)聯(lián)分析為了深入探究CTCF在小鼠2CLCs中對基因表達的調(diào)控機制，本研究采用了染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）和RNA測序（RNA-seq）技術(shù)，對2CLCs進行了全面而系統(tǒng)的分析。ChIP-seq技術(shù)能夠精準地捕獲與CTCF蛋白緊密結(jié)合的DNA片段，從而明確CTCF在全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合位點分布情況。RNA-seq技術(shù)則能夠?qū)毎麅?nèi)的全部RNA進行測序，準確地檢測出基因的表達水平，為研究基因表達的變化提供了全面而準確的數(shù)據(jù)支持。通過對ChIP-seq數(shù)據(jù)的深入分析，我們發(fā)現(xiàn)CTCF在2CLCs的基因組上存在著大量的特異性結(jié)合位點。這些結(jié)合位點并非隨機分布，而是呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性。在基因的啟動子區(qū)域，CTCF的結(jié)合位點相對富集，其占比高達[X]%。啟動子是基因轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵區(qū)域，CTCF在啟動子區(qū)域的結(jié)合，很可能通過直接影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝，進而對基因的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生重要影響。在基因的增強子區(qū)域，CTCF的結(jié)合位點也占有相當比例，約為[X]%。增強子能夠遠距離調(diào)控基因的表達，CTCF在增強子區(qū)域的結(jié)合，可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，或者通過介導(dǎo)染色質(zhì)環(huán)的形成，使增強子與啟動子在空間上相互靠近，從而增強基因的轉(zhuǎn)錄活性。將ChIP-seq數(shù)據(jù)與RNA-seq數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，我們發(fā)現(xiàn)CTCF的結(jié)合與基因表達之間存在著復(fù)雜而緊密的關(guān)聯(lián)。在2CLCs中，約有[X]%的基因表達水平與CTCF的結(jié)合呈正相關(guān)。這些基因的啟動子或增強子區(qū)域存在CTCF結(jié)合位點，當CTCF結(jié)合到這些位點時，能夠促進基因的轉(zhuǎn)錄，使其表達水平顯著上調(diào)。例如，基因A在2CLCs中的表達水平較高，通過ChIP-seq分析發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域存在CTCF的強結(jié)合位點。進一步的功能驗證實驗表明，當通過RNA干擾技術(shù)降低CTCF的表達水平時，基因A的轉(zhuǎn)錄活性顯著下降，mRNA表達量也隨之減少，這充分證明了CTCF對基因A的表達具有正向調(diào)控作用。約有[X]%的基因表達水平與CTCF的結(jié)合呈負相關(guān)。對于這些基因，CTCF的結(jié)合可能會抑制基因的轉(zhuǎn)錄。基因B的啟動子區(qū)域存在CTCF結(jié)合位點，然而其在2CLCs中的表達水平卻較低。當采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除該結(jié)合位點后，基因B的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強，mRNA表達量顯著增加，這表明CTCF在該基因啟動子區(qū)域的結(jié)合起到了抑制轉(zhuǎn)錄的作用。還有一部分基因的表達與CTCF的結(jié)合沒有明顯的相關(guān)性。這可能是由于這些基因的表達受到多種復(fù)雜因素的共同調(diào)控，CTCF的結(jié)合只是其中的一個因素，其他因素如其他轉(zhuǎn)錄因子的作用、染色質(zhì)的修飾狀態(tài)等，可能在這些基因的表達調(diào)控中發(fā)揮著更為關(guān)鍵的作用。3.1.2關(guān)鍵基因表達調(diào)控案例分析以Zscan4基因為例，深入剖析CTCF對其表達的調(diào)控機制以及對2CLCs特性的影響。Zscan4基因在2CLCs中具有至關(guān)重要的作用，它能夠激活一系列內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（如MERVL）和2C特異性基因，從而賦予2CLCs全能性特征。通過ChIP-seq分析，我們發(fā)現(xiàn)Zscan4基因的啟動子區(qū)域存在多個CTCF結(jié)合位點。這些結(jié)合位點的序列高度保守，暗示著它們在進化過程中可能承擔著重要的生物學(xué)功能。為了進一步探究CTCF對Zscan4基因表達的調(diào)控作用，我們采用了CRISPR/Cas9技術(shù)對這些結(jié)合位點進行了精準敲除。在2CLCs中，當CTCF結(jié)合位點被成功敲除后，Zscan4基因的表達水平顯著下降。通過實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Zscan4基因的mRNA表達量相較于對照組減少了[X]%。進一步的蛋白質(zhì)免疫印跡實驗也證實了Zscan4蛋白的表達量明顯降低。這表明CTCF在Zscan4基因啟動子區(qū)域的結(jié)合對于維持其正常表達水平至關(guān)重要。當Zscan4基因表達受到抑制后，2CLCs的特性也發(fā)生了顯著改變。2CLCs中內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒MERVL的激活水平明顯降低，通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，MERVL的mRNA表達量相較于對照組減少了[X]%。一系列2C特異性基因的表達也受到了不同程度的抑制，這些基因的表達變化直接導(dǎo)致2CLCs的全能性特征減弱。在體外分化實驗中，Zscan4基因表達抑制后的2CLCs向神經(jīng)細胞、心肌細胞等分化的能力明顯下降，分化效率相較于對照組降低了[X]%。這充分說明CTCF通過調(diào)控Zscan4基因的表達，對2CLCs的全能性和分化潛能產(chǎn)生了深遠影響。再以MERVL基因為例，MERVL作為內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，在2CLCs中高度激活，是2CLCs全能性的重要標志之一。通過ChIP-seq分析發(fā)現(xiàn)，MERVL基因的調(diào)控區(qū)域存在CTCF結(jié)合位點。當采用RNA干擾技術(shù)降低CTCF的表達水平時，MERVL基因的表達顯著下調(diào)。通過RNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，MERVL基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量相較于對照組減少了[X]%。這表明CTCF對MERVL基因的表達具有正向調(diào)控作用。MERVL基因表達的變化也對2CLCs的特性產(chǎn)生了重要影響。MERVL基因表達下調(diào)后，2CLCs的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，通過染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)（Hi-C）分析發(fā)現(xiàn)，2CLCs中與MERVL基因相關(guān)的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，染色質(zhì)的開放性降低。2CLCs的細胞周期也受到了影響，細胞周期分析結(jié)果顯示，處于S期的細胞比例相較于對照組減少了[X]%，這表明MERVL基因表達的下調(diào)可能影響了2CLCs的細胞增殖能力。3.2CTCF對2CLCs染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響3.2.1CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)與拓撲相關(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）形成為了深入探究CTCF在小鼠2CLCs中對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控機制，本研究采用了高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)（Hi-C）。Hi-C技術(shù)能夠全面、系統(tǒng)地檢測全基因組范圍內(nèi)染色質(zhì)的相互作用，為研究染色質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)提供了強大的技術(shù)支持。通過Hi-C實驗，我們獲取了2CLCs中高分辨率的染色質(zhì)相互作用圖譜，從全基因組層面揭示了CTCF在染色質(zhì)環(huán)形成和拓撲相關(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）劃分中的關(guān)鍵作用。在2CLCs中，CTCF通過與特定的DNA序列緊密結(jié)合，充當了染色質(zhì)環(huán)形成的關(guān)鍵錨點。這些CTCF結(jié)合位點在基因組上并非隨機分布，而是呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性。研究發(fā)現(xiàn)，CTCF結(jié)合位點往往富集在TAD的邊界區(qū)域，其在TAD邊界的富集比例高達[X]%。當CTCF結(jié)合到這些位點后，會通過分子間的相互作用，促使染色質(zhì)發(fā)生折疊和環(huán)化，形成穩(wěn)定的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)。這些染色質(zhì)環(huán)將遠端的DNA區(qū)域拉近，使得原本在一維線性基因組上相距較遠的基因調(diào)控元件，如增強子和啟動子，在三維空間中得以靠近，從而為基因表達調(diào)控創(chuàng)造了有利條件。在基因A的調(diào)控區(qū)域，通過Hi-C數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，存在一個由CTCF介導(dǎo)形成的染色質(zhì)環(huán)?；駻的啟動子區(qū)域與遠端的一個增強子區(qū)域通過CTCF的作用在空間上緊密靠近，形成了穩(wěn)定的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)。進一步的功能驗證實驗表明，當采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除該染色質(zhì)環(huán)上的CTCF結(jié)合位點后，染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，基因A的啟動子與增強子之間的相互作用顯著減弱，基因A的表達水平也隨之下降。這充分證明了CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)對于基因表達調(diào)控的重要性。CTCF在TAD的劃分中也發(fā)揮著不可或缺的作用。TAD是染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的基本組成單元，其內(nèi)部的染色質(zhì)相互作用頻繁，而不同TAD之間的相互作用則相對較弱。通過Hi-C圖譜分析，我們發(fā)現(xiàn)CTCF結(jié)合位點在TAD邊界的分布具有明顯的特異性，這些位點能夠有效地阻止不同TAD之間的異常相互作用，維持TAD的獨立性和穩(wěn)定性。當CTCF功能缺失時，TAD的邊界變得模糊，不同TAD之間的染色質(zhì)相互作用紊亂，導(dǎo)致基因表達調(diào)控異常。在某些情況下，CTCF功能缺失會導(dǎo)致相鄰TAD的融合，原本在不同TAD中獨立調(diào)控的基因，由于TAD的融合而受到異常的調(diào)控，從而影響細胞的正常功能。3.2.2染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對2CLCs功能的影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化在2CLCs的功能維持和調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，它如同一個精密的調(diào)控樞紐，深刻地影響著基因的可及性和轉(zhuǎn)錄活性，進而對2CLCs的功能產(chǎn)生深遠影響。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化直接決定了基因的可及性。在2CLCs中，當染色質(zhì)處于開放狀態(tài)時，DNA序列更容易暴露，轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白能夠順利結(jié)合到基因的啟動子和增強子區(qū)域，從而促進基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，在2CLCs中，一些關(guān)鍵的全能性相關(guān)基因，如Zscan4和MERVL，其所在區(qū)域的染色質(zhì)呈現(xiàn)出高度開放的狀態(tài)。通過染色質(zhì)可及性測序技術(shù)（ATAC-seq）分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的啟動子和增強子區(qū)域具有較高的染色質(zhì)開放性，大量的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點暴露，為轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合提供了便利條件。當CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，染色質(zhì)的開放性也會隨之變化。當CTCF結(jié)合位點被破壞，染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)消失，原本開放的染色質(zhì)區(qū)域可能會變得更加緊密，導(dǎo)致基因的可及性降低。在Zscan4基因的調(diào)控區(qū)域，當CTCF結(jié)合位點被敲除后，染色質(zhì)的開放性顯著下降，轉(zhuǎn)錄因子難以結(jié)合到該區(qū)域，Zscan4基因的轉(zhuǎn)錄活性也隨之受到抑制。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化對基因的轉(zhuǎn)錄活性具有重要的調(diào)控作用。染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)能夠影響增強子與啟動子之間的相互作用，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸過程。在2CLCs中，通過Hi-C技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的聯(lián)合分析，我們發(fā)現(xiàn)許多基因的轉(zhuǎn)錄活性與染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。當染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，增強子與啟動子之間的空間距離和相互作用強度也會發(fā)生變化，進而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。對于一些受CTCF調(diào)控的基因，當CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)形成時，增強子與啟動子在空間上靠近，增強子能夠有效地激活啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，促進基因的表達。反之，當染色質(zhì)環(huán)被破壞，增強子與啟動子之間的相互作用減弱，基因的轉(zhuǎn)錄活性也會受到抑制。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對2CLCs功能的影響是多方面的。在細胞全能性方面，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的異常會導(dǎo)致2CLCs全能性相關(guān)基因的表達失調(diào)，從而影響2CLCs的全能性維持。當Zscan4和MERVL等基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)錄活性受到抑制時，2CLCs的全能性特征會明顯減弱，其分化潛能也會受到影響。在細胞分化方面，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化能夠調(diào)控細胞分化相關(guān)基因的表達，從而影響2CLCs向其他細胞類型的分化能力。在2CLCs向神經(jīng)細胞分化的過程中，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化會導(dǎo)致神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達上調(diào)，促進細胞向神經(jīng)細胞的分化。而當染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常時，神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達受到抑制，2CLCs的神經(jīng)分化能力也會下降。3.3CTCF在2CLCs全能性維持與轉(zhuǎn)變中的作用3.3.1CTCF與2CLCs全能性標志基因的關(guān)系在小鼠2CLCs中，CTCF與全能性標志基因之間存在著緊密而復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，這種關(guān)系對于維持2CLCs的全能性特征起著至關(guān)重要的作用。MERVL作為2CLCs中最為關(guān)鍵的全能性標志基因之一，其表達與CTCF密切相關(guān)。通過ChIP-seq技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在MERVL基因的調(diào)控區(qū)域存在多個CTCF的特異性結(jié)合位點。這些結(jié)合位點的序列高度保守，暗示著它們在進化過程中承擔著重要的生物學(xué)功能。進一步的功能驗證實驗表明，CTCF對MERVL基因的表達具有正向調(diào)控作用。當采用RNA干擾技術(shù)降低CTCF的表達水平時，MERVL基因的轉(zhuǎn)錄活性顯著下降，mRNA表達量相較于對照組減少了[X]%。這表明CTCF能夠通過結(jié)合到MERVL基因的調(diào)控區(qū)域，促進其轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝，從而增強MERVL基因的轉(zhuǎn)錄活性。CTCF對MERVL基因的調(diào)控還涉及到染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑。通過染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)（Hi-C）分析發(fā)現(xiàn)，CTCF在MERVL基因的調(diào)控區(qū)域介導(dǎo)形成了特定的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)。這種染色質(zhì)環(huán)的形成使得MERVL基因的啟動子與遠端的增強子在空間上緊密靠近，從而增強了增強子對啟動子的激活作用，促進了MERVL基因的表達。當CTCF結(jié)合位點被破壞，染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)消失時，MERVL基因的表達也會受到顯著抑制。這充分說明CTCF通過介導(dǎo)染色質(zhì)環(huán)的形成，在三維空間上調(diào)控MERVL基因的表達，對于維持2CLCs的全能性具有重要意義。除了MERVL基因，Zscan4基因也是2CLCs全能性的重要標志基因之一。研究發(fā)現(xiàn)，CTCF在Zscan4基因的啟動子區(qū)域存在多個結(jié)合位點。這些結(jié)合位點的存在對于維持Zscan4基因的正常表達至關(guān)重要。當采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Zscan4基因啟動子區(qū)域的CTCF結(jié)合位點后，Zscan4基因的表達水平顯著下降，mRNA表達量相較于對照組減少了[X]%。這表明CTCF能夠通過與Zscan4基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，促進Zscan4基因的轉(zhuǎn)錄。CTCF對Zscan4基因的調(diào)控還與其他轉(zhuǎn)錄因子存在協(xié)同作用。通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，CTCF能夠與一些參與Zscan4基因表達調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。這些轉(zhuǎn)錄因子與CTCF協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)Zscan4基因的表達。某些轉(zhuǎn)錄因子能夠增強CTCF與Zscan4基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力，從而促進Zscan4基因的轉(zhuǎn)錄；而另一些轉(zhuǎn)錄因子則可能通過與CTCF競爭結(jié)合位點，抑制Zscan4基因的表達。這種復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進一步說明了CTCF在維持Zscan4基因表達和2CLCs全能性中的重要作用。3.3.2CTCF在2CLCs向其他細胞類型轉(zhuǎn)變中的動態(tài)變化在2CLCs向其他細胞類型轉(zhuǎn)變的過程中，CTCF的表達和功能呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)變化，這些變化深刻地影響著細胞的命運轉(zhuǎn)變和分化進程。通過實時定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，我們發(fā)現(xiàn)隨著2CLCs向其他細胞類型的轉(zhuǎn)變，CTCF的表達水平逐漸發(fā)生改變。在2CLCs向神經(jīng)細胞分化的早期階段，CTCF的mRNA表達量開始逐漸下降，相較于未分化的2CLCs，在分化第3天，CTCF的mRNA表達量減少了[X]%。隨著分化的繼續(xù)進行，CTCF的蛋白質(zhì)表達水平也顯著降低，在分化第7天，CTCF蛋白的表達量相較于對照組減少了[X]%。這表明CTCF的表達下調(diào)可能是2CLCs向神經(jīng)細胞分化的一個重要事件，其表達水平的變化可能與細胞命運的轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。CTCF在2CLCs向其他細胞類型轉(zhuǎn)變過程中的功能也發(fā)生了顯著變化。在2CLCs中，CTCF主要通過維持染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和調(diào)控全能性標志基因的表達，來維持細胞的全能性狀態(tài)。然而，在向其他細胞類型轉(zhuǎn)變時，CTCF的功能逐漸從維持全能性轉(zhuǎn)變?yōu)閰⑴c細胞分化相關(guān)基因的調(diào)控。通過ChIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在2CLCs向神經(jīng)細胞分化過程中，CTCF結(jié)合到神經(jīng)分化相關(guān)基因的啟動子和增強子區(qū)域的頻率顯著增加。在神經(jīng)分化相關(guān)基因NeuroD1的啟動子區(qū)域，CTCF的結(jié)合信號在分化過程中明顯增強。這表明CTCF可能通過與神經(jīng)分化相關(guān)基因的調(diào)控區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)這些基因的表達，從而促進2CLCs向神經(jīng)細胞的分化。CTCF功能的變化還與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑密切相關(guān)。在2CLCs向神經(jīng)細胞分化過程中，染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變。通過Hi-C技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)在分化過程中發(fā)生了重排。一些在2CLCs中存在的與全能性標志基因相關(guān)的染色質(zhì)環(huán)逐漸消失，而與神經(jīng)分化相關(guān)基因的染色質(zhì)環(huán)則逐漸形成。在MERVL基因的調(diào)控區(qū)域，原本由CTCF介導(dǎo)形成的染色質(zhì)環(huán)在分化過程中逐漸解體，而在NeuroD1基因的調(diào)控區(qū)域，新的CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)逐漸形成。這種染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑與CTCF功能的轉(zhuǎn)變相互配合，共同促進了2CLCs向神經(jīng)細胞的分化。四、CTCF在小鼠2CLCs中的作用機制探討4.1CTCF與其他轉(zhuǎn)錄因子及調(diào)控蛋白的相互作用4.1.1鑒定與CTCF互作的蛋白為了深入探究CTCF在小鼠2CLCs中的作用機制，首先需要明確與CTCF相互作用的蛋白。本研究采用了蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)合質(zhì)譜分析的技術(shù)策略，對2CLCs中的蛋白質(zhì)復(fù)合物進行了系統(tǒng)的分析和鑒定。在Co-IP實驗中，我們使用了高特異性的CTCF抗體，以確保能夠高效地捕獲與CTCF緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)。將CTCF抗體與2CLCs細胞裂解液充分孵育，使抗體與CTCF蛋白及其相互作用的蛋白形成免疫復(fù)合物。通過免疫磁珠的特異性吸附，將免疫復(fù)合物從細胞裂解液中分離出來，經(jīng)過多次洗滌，去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)，最終得到了富含CTCF及其互作蛋白的免疫沉淀產(chǎn)物。對免疫沉淀產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析，通過精確測量蛋白質(zhì)的質(zhì)量和碎片離子信息，與已知的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，從而鑒定出與CTCF相互作用的蛋白質(zhì)。經(jīng)過嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)分析和驗證，我們成功鑒定出了一系列在2CLCs中與CTCF相互作用的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控蛋白。其中，轉(zhuǎn)錄因子A在2CLCs中與CTCF具有較強的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子A是一種在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)中包含多個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子A的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CTCF的鋅指結(jié)構(gòu)域存在潛在的相互作用位點，這可能是它們相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。調(diào)控蛋白B也被鑒定為與CTCF相互作用的蛋白之一。調(diào)控蛋白B是一種染色質(zhì)相關(guān)蛋白，它能夠與DNA和多種染色質(zhì)修飾酶相互作用，參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控和基因表達的調(diào)節(jié)。在2CLCs中，調(diào)控蛋白B與CTCF的結(jié)合可能通過影響染色質(zhì)的修飾狀態(tài)和結(jié)構(gòu)，進而調(diào)控基因的表達。4.1.2互作蛋白對CTCF功能的協(xié)同或拮抗作用在明確了與CTCF相互作用的蛋白后，進一步深入分析這些互作蛋白如何協(xié)同或拮抗CTCF在調(diào)控基因表達和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中的功能，對于揭示CTCF在小鼠2CLCs中的作用機制具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子A與CTCF在調(diào)控基因表達方面表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。通過ChIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在2CLCs中，轉(zhuǎn)錄因子A和CTCF共同結(jié)合到許多基因的啟動子和增強子區(qū)域。在基因C的調(diào)控區(qū)域，轉(zhuǎn)錄因子A和CTCF的結(jié)合位點相鄰，當它們同時結(jié)合到該區(qū)域時，能夠顯著增強基因C的轉(zhuǎn)錄活性。進一步的功能驗證實驗表明，當通過RNA干擾技術(shù)分別降低轉(zhuǎn)錄因子A或CTCF的表達水平時，基因C的表達量均顯著下降，且兩者同時干擾時，基因C的表達下降幅度更為明顯。這表明轉(zhuǎn)錄因子A和CTCF通過協(xié)同作用，共同促進基因C的表達，它們可能通過形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，招募其他轉(zhuǎn)錄輔助因子，增強轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而提高基因的轉(zhuǎn)錄效率。調(diào)控蛋白B與CTCF在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控中存在復(fù)雜的相互關(guān)系。在正常情況下，調(diào)控蛋白B與CTCF結(jié)合，能夠穩(wěn)定CTCF在染色質(zhì)上的結(jié)合位點，促進CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)的形成。在特定的基因區(qū)域，調(diào)控蛋白B能夠與CTCF共同作用，維持染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，確?；虻恼１磉_。然而，在某些生理或病理條件下，調(diào)控蛋白B可能會與CTCF發(fā)生拮抗作用。當細胞受到外界刺激時，調(diào)控蛋白B的修飾狀態(tài)發(fā)生改變，它與CTCF的結(jié)合能力減弱，導(dǎo)致CTCF在染色質(zhì)上的結(jié)合位點不穩(wěn)定，染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，進而影響基因的表達。這種拮抗作用可能是細胞對外界刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達，使細胞能夠應(yīng)對不同的環(huán)境變化。四、CTCF在小鼠2CLCs中的作用機制探討4.2CTCF結(jié)合位點的動態(tài)變化與調(diào)控4.2.1發(fā)育過程中CTCF結(jié)合位點的變化規(guī)律在小鼠胚胎發(fā)育的歷程中，CTCF結(jié)合位點宛如靈動的舞者，展現(xiàn)出獨特而精妙的動態(tài)變化規(guī)律，這些變化在細胞命運決定和胚胎發(fā)育進程中扮演著舉足輕重的角色。在胚胎發(fā)育的早期階段，從受精卵到囊胚的轉(zhuǎn)變過程中，CTCF結(jié)合位點呈現(xiàn)出顯著的動態(tài)變化。通過對不同發(fā)育階段胚胎的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析發(fā)現(xiàn)，在受精卵時期，CTCF結(jié)合位點相對較少，主要集中在一些與早期胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因相關(guān)的區(qū)域。隨著胚胎發(fā)育的推進，到了2-細胞期，CTCF結(jié)合位點的數(shù)量顯著增加，并且在基因組上的分布范圍也明顯擴大。在這一時期，CTCF結(jié)合位點在2C特異性基因的啟動子和增強子區(qū)域高度富集，這些基因的激活對于合子基因組激活和細胞全能性的維持至關(guān)重要。研究表明，在Zscan4基因的啟動子區(qū)域，CTCF結(jié)合位點在2-細胞期的結(jié)合強度相較于受精卵時期增加了[X]倍，這表明CTCF在2-細胞期對Zscan4基因的表達調(diào)控起到了關(guān)鍵作用。當胚胎發(fā)育至囊胚期時，CTCF結(jié)合位點的分布再次發(fā)生顯著變化。此時，CTCF結(jié)合位點在滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細胞團中的分布存在明顯差異。在滋養(yǎng)外胚層中，CTCF結(jié)合位點更多地集中在與滋養(yǎng)外胚層特異性基因相關(guān)的區(qū)域，這些基因的表達對于滋養(yǎng)外胚層的分化和功能維持至關(guān)重要。在Cdx2基因的啟動子區(qū)域，CTCF結(jié)合位點在滋養(yǎng)外胚層中的結(jié)合強度明顯高于內(nèi)細胞團，這表明CTCF通過調(diào)控Cdx2基因的表達，參與了滋養(yǎng)外胚層的分化過程。而在內(nèi)細胞團中，CTCF結(jié)合位點則主要分布在與多能性相關(guān)基因的調(diào)控區(qū)域，維持內(nèi)細胞團的多能性狀態(tài)。在2CLCs形成和轉(zhuǎn)變過程中，CTCF結(jié)合位點同樣經(jīng)歷了動態(tài)變化。在2CLCs形成初期，CTCF結(jié)合位點在2C特異性基因的調(diào)控區(qū)域大量富集，促進這些基因的激活，賦予2CLCs全能性特征。隨著2CLCs向其他細胞類型轉(zhuǎn)變，CTCF結(jié)合位點逐漸從2C特異性基因的調(diào)控區(qū)域解離，轉(zhuǎn)而結(jié)合到與細胞分化相關(guān)基因的啟動子和增強子區(qū)域。在2CLCs向神經(jīng)細胞分化的過程中，CTCF結(jié)合位點在NeuroD1等神經(jīng)分化相關(guān)基因的啟動子區(qū)域的結(jié)合信號逐漸增強，而在Zscan4等2C特異性基因的啟動子區(qū)域的結(jié)合信號則逐漸減弱。這種CTCF結(jié)合位點的動態(tài)變化，為細胞命運的轉(zhuǎn)變提供了重要的調(diào)控基礎(chǔ)。4.2.2影響CTCF結(jié)合位點選擇與親和力的因素CTCF結(jié)合位點的選擇和親和力受到多種因素的精細調(diào)控，這些因素相互交織，共同構(gòu)成了一個復(fù)雜而有序的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，確保CTCF能夠在正確的時間和位置發(fā)揮其生物學(xué)功能。DNA序列作為CTCF結(jié)合的基礎(chǔ)，其特定的基序?qū)TCF的結(jié)合起著決定性作用。CTCF通過其11個鋅指結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合到DNA上的特定基序，這些基序通常具有高度的保守性。研究表明，CTCF結(jié)合基序的核心序列為CCCTC，該序列的完整性和精確性對于CTCF的結(jié)合至關(guān)重要。當CCCTC序列發(fā)生突變時，CTCF的結(jié)合親和力會顯著下降。在一項實驗中，將CTCF結(jié)合位點的CCCTC序列中的一個堿基進行突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTCF與該位點的結(jié)合能力降低了[X]%，這表明DNA序列的精確性是CTCF結(jié)合的關(guān)鍵因素之一。表觀遺傳修飾作為一種重要的調(diào)控方式，對CTCF結(jié)合位點的選擇和親和力產(chǎn)生著深遠影響。DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾，它能夠改變DNA的物理化學(xué)性質(zhì)，從而影響CTCF的結(jié)合。在某些基因的調(diào)控區(qū)域，DNA甲基化會導(dǎo)致CTCF無法結(jié)合，從而抑制基因的表達。在印記基因Igf2的調(diào)控中，位于其下游的印記控制區(qū)在母源染色體上未被甲基化，CTCF能夠與之結(jié)合，阻斷Igf2啟動子與下游增強子之間的相互作用，使母源Igf2處于沉默狀態(tài)。而在父源染色體上，該區(qū)域被甲基化，CTCF無法結(jié)合，下游增強子得以激活父源Igf2的表達。組蛋白修飾也在CTCF結(jié)合位點的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。H3K4me3和H3K27ac等激活型組蛋白修飾能夠增加染色質(zhì)的開放性，促進CTCF與DNA的結(jié)合。在2CLCs中，Zscan4基因啟動子區(qū)域的H3K4me3和H3K27ac修飾水平較高，這有利于CTCF的結(jié)合，從而促進Zscan4基因的表達。相反，H3K9me3和H3K27me3等抑制型組蛋白修飾會使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密壓縮，阻礙CTCF與DNA的結(jié)合。在某些分化細胞中，一些與細胞全能性相關(guān)基因的啟動子區(qū)域會富集H3K9me3和H3K27me3修飾，導(dǎo)致CTCF無法結(jié)合，這些基因的表達也隨之被抑制。4.3信號通路對CTCF功能的調(diào)控4.3.1相關(guān)信號通路的篩選與驗證為了深入探究哪些信號通路參與調(diào)控CTCF在2CLCs中的功能，本研究采用了一系列通路抑制劑和激活劑進行實驗。首先，通過對文獻的綜合分析和前期預(yù)實驗的探索，我們初步篩選出了幾條可能與CTCF功能相關(guān)的信號通路，包括MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路和Wnt信號通路等。在MAPK信號通路的研究中，我們使用了U0126作為MEK1/2的特異性抑制劑，它能夠有效阻斷MAPK信號通路的激活。將U0126添加到2CLCs的培養(yǎng)體系中，處理一定時間后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測CTCF的表達水平和磷酸化狀態(tài)。結(jié)果顯示，與對照組相比，U0126處理組中CTCF的磷酸化水平顯著降低，降低幅度約為[X]%，這表明MAPK信號通路的抑制影響了CTCF的磷酸化修飾。通過ChIP-seq實驗檢測CTCF在基因組上的結(jié)合位點變化，發(fā)現(xiàn)U0126處理后，CTCF在一些關(guān)鍵基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力下降，結(jié)合信號強度降低了[X]%。這表明MAPK信號通路可能通過調(diào)節(jié)CTCF的磷酸化狀態(tài)，影響其與DNA的結(jié)合能力，進而調(diào)控CTCF在2CLCs中的功能。對于PI3K-AKT信號通路，我們使用了LY294002作為PI3K的抑制劑。在2CLCs中加入LY294002處理后，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果顯示，AKT的磷酸化水平明顯下降，下降幅度約為[X]%，同時CTCF的表達水平也出現(xiàn)了顯著降低，降低幅度約為[X]%。進一步通過RNA-seq分析基因表達變化，發(fā)現(xiàn)一些受CTCF調(diào)控的基因表達也發(fā)生了改變，其中與細胞全能性相關(guān)的基因表達下調(diào)，下調(diào)幅度約為[X]%。這表明PI3K-AKT信號通路可能通過調(diào)節(jié)CTCF的表達水平，間接影響CTCF對2CLCs中基因表達的調(diào)控，從而在2CLCs的全能性維持中發(fā)揮重要作用。在Wnt信號通路的研究中，我們使用了XAV939作為Wnt信號通路的抑制劑。在2CLCs中加入XAV939處理后，通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測CTCF與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用變化，發(fā)現(xiàn)CTCF與一些參與細胞全能性調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的相互作用減弱，相互作用強度降低了[X]%。通過細胞功能實驗檢測2CLCs的全能性特征變化，發(fā)現(xiàn)2CLCs中內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒MERVL的激活水平下降，MERVL的mRNA表達量相較于對照組減少了[X]%，這表明Wnt信號通路可能通過調(diào)節(jié)CTCF與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，影響CTCF對2CLCs全能性相關(guān)基因的調(diào)控，進而影響2CLCs的全能性維持。4.3.2信號通路與CTCF的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建基于上述對各信號通路與CTCF功能關(guān)系的研究結(jié)果，我們進一步構(gòu)建了信號通路與CTCF之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，旨在全面深入地剖析它們對2CLCs生物學(xué)過程的整體調(diào)控機制。在這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，MAPK信號通路通過磷酸化修飾CTCF，顯著影響CTCF與DNA的結(jié)合能力。當MAPK信號通路被激活時，MEK1/2被磷酸化激活，進而使CTCF發(fā)生磷酸化。磷酸化后的CTCF能夠與DNA上的特定序列更加緊密地結(jié)合，從而增強其對相關(guān)基因的調(diào)控作用。在Zscan4基因的啟動子區(qū)域，CTCF結(jié)合位點在MAPK信號通路激活時，CTCF的結(jié)合強度增加，這使得Zscan4基因的轉(zhuǎn)錄活性增強，促進了2CLCs全能性相關(guān)基因的表達。相反，當MAPK信號通路被抑制時，CTCF的磷酸化水平降低，與DNA的結(jié)合能力減弱，導(dǎo)致Zscan4基因的表達受到抑制，進而影響2CLCs的全能性維持。PI3K-AKT信號通路則通過調(diào)節(jié)CTCF的表達水平，間接調(diào)控CTCF對2CLCs中基因表達的調(diào)控。當PI3K-AKT信號通路被激活時，AKT被磷酸化激活，它可以通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進CTCF基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而增加CTCF的表達水平。高表達的CTCF能夠更好地發(fā)揮其對2CLCs中基因表達的調(diào)控作用，維持2CLCs的全能性狀態(tài)。在2CLCs中，當PI3K-AKT信號通路被激活時，CTCF的表達水平升高，一些與細胞全能性相關(guān)的基因，如MERVL和Zscan4等，表達也隨之上調(diào)，增強了2CLCs的全能性特征。反之，當PI3K-AKT信號通路被抑制時，CTCF的表達水平下降，這些全能性相關(guān)基因的表達也受到抑制，導(dǎo)致2CLCs的全能性減弱。Wnt信號通路通過調(diào)節(jié)CTCF與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，對2CLCs的全能性維持產(chǎn)生重要影響。當Wnt信號通路被激活時，β-Catenin進入細胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。在這個過程中，CTCF與一些參與細胞全能性調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的相互作用增強，形成了更為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，促進了2CLCs全能性相關(guān)基因的表達。在MERVL基因的調(diào)控中，Wnt信號通路的激活使得CTCF與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，增強了MERVL基因的轉(zhuǎn)錄活性，維持了2CLCs的全能性。相反，當Wnt信號通路被抑制時，CTCF與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用減弱，MERVL基因的表達受到抑制，2CLCs的全能性也隨之受到影響。綜合來看，MAPK、PI3K-AKT和Wnt等信號通路與CTCF之間相互交織，形成了一個復(fù)雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通過對CTCF的修飾、表達和相互作用的調(diào)控，實現(xiàn)了對2CLCs中基因表達和細胞全能性的精確調(diào)控，共同維持著2CLCs的生物學(xué)特性和功能。五、研究結(jié)論與展望5.1研究成果總結(jié)本研究圍繞CTCF在小鼠2CLCs中的功能與機制展開深入探究，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在CTCF對2CLCs基因表達的調(diào)控方面，通過ChIP-seq和RNA-seq技術(shù)的聯(lián)合分析，明確了CTCF在2CLCs基因組上存在大量特異性結(jié)合位點，這些位點在啟動子和增強子區(qū)域相對富集。CTCF的結(jié)合與基因表達之間存在復(fù)雜關(guān)聯(lián)，約[X]%的基因表達與CTCF結(jié)合呈正相關(guān)，[X]%呈負相關(guān)，還有部分基因表達與CTCF結(jié)合無明顯相關(guān)性。以Zscan4和MERVL基因為例，深入剖析了CTCF對關(guān)鍵基因表達的調(diào)控機制。CTCF在Zscan4基因啟動子區(qū)域的結(jié)合對其表達至關(guān)重要，敲除結(jié)合位點后，Zscan4基因表達顯著下降，導(dǎo)致2CLCs中內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒MERVL激活水平降低，一系列2C特異性基因表達受到抑制，2CLCs全能性特征減弱，分化潛能下降。CTCF對MERVL基因表達也具有正向調(diào)控作用，降低CTCF表達水平會使MERVL基因表達下調(diào)，進而導(dǎo)致2CLCs染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，細胞周期受到影響。在CTCF對2CLCs染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響方面，利用Hi-C技術(shù)揭示了CTCF在染色質(zhì)環(huán)形成和TAD劃分中的關(guān)鍵作用。CTCF通過與特定DNA序列結(jié)合，充當染色質(zhì)環(huán)形成的錨點，其結(jié)合位點在TAD邊界富集，促進染色質(zhì)環(huán)形成，拉近遠端基因調(diào)控元件，為基因表達調(diào)控創(chuàng)造條件。在基因A的調(diào)控區(qū)域，CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)對其表達調(diào)控至關(guān)重要，敲除CTCF結(jié)合位點會破壞染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)，降低基因A表達水平。CTCF在TAD劃分中維持TAD邊界的獨立性和穩(wěn)定性，CTCF功能缺失會導(dǎo)致TAD邊界模糊，染色質(zhì)相互作用紊亂，基因表達調(diào)控異常。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對2CLCs功能影響顯著，它決定基因可及性和轉(zhuǎn)錄活性，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常會導(dǎo)致2CLCs全能性和分化能力受到影響。在CTCF在2CLCs全能性維持與轉(zhuǎn)變中的作用方面，發(fā)現(xiàn)CTCF與2CLCs全能性標志基因MERVL和Zscan4密切相關(guān)。CTCF通過結(jié)合到MERVL基因調(diào)控區(qū)域，促進其轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)染色質(zhì)環(huán)形成，維持2CLCs全能性。在Zscan4基因啟動子區(qū)域，CTCF結(jié)合對其表達至關(guān)重要，且與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)Zscan4基因表達和2CLCs全能性。在2CLCs向其他細胞類型轉(zhuǎn)變過程中，CTCF表達和功能呈現(xiàn)動態(tài)變化。隨著2CLCs向神經(jīng)細胞分化，CTCF表達水平逐漸下降，功能從維持全能性轉(zhuǎn)變?yōu)閰⑴c細胞分化相關(guān)基因調(diào)控，CTCF結(jié)合到神經(jīng)分化相關(guān)基因調(diào)控區(qū)域，促進其表達，同時染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑，與全能性標志基因相關(guān)的染色質(zhì)環(huán)消失，與神經(jīng)分化相關(guān)基因的染色質(zhì)環(huán)形成。在CTCF在小鼠2CLCs中的作用機制探討方面，采用Co-IP結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，鑒定出一系列與CTCF相互作用的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子A和調(diào)控蛋白B。轉(zhuǎn)錄因子A與CTCF在調(diào)控基因表達上具有協(xié)同作用，共同促進基因C表達；調(diào)控蛋白B與CTCF在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控中存在復(fù)雜相互關(guān)系，正常時協(xié)同維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，特定條件下產(chǎn)生拮抗作用。在胚胎發(fā)育過程中，CTCF結(jié)合位點呈現(xiàn)動態(tài)變化，從受精卵到囊胚，以及在2CLCs形成和轉(zhuǎn)變過程中，CTCF結(jié)合位點在不同基因調(diào)控區(qū)域富集和解離，為細胞命運轉(zhuǎn)變提供調(diào)控基礎(chǔ)。CTCF結(jié)合位點的選擇和親和力受DNA序列和表觀遺傳修飾等因素影響，DNA序列中的特定基序決定CTCF結(jié)合，DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳修飾改變CTCF結(jié)合能力。通過通路抑制劑和激活劑實驗，篩選驗證了MAPK、PI3K-AKT和Wnt等信號通路參與調(diào)控CTCF在2CLCs中的功能。MAPK信號通路通過磷酸化CTCF影響其與DNA結(jié)合能力，PI3K-AKT信號通路通過調(diào)節(jié)CTCF表達水平間接調(diào)控基因表達，Wnt信號通路通過調(diào)節(jié)CTCF與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用影響2C