DB23T-玉米線蟲矮化病原長嶺發(fā)墊刃線蟲鑒定技術(shù)規(guī)程

DB××/T××××—××××PAGEIIPAGE1DBFORMTEXT232021-XX-2021-XX-XX實施2021-XX-XX發(fā)布玉米線蟲矮化病原長嶺發(fā)墊刃線蟲鑒定技術(shù)規(guī)程征求意見稿主要起草單位：中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)業(yè)技術(shù)中心聯(lián)系人：潘鳳娟聯(lián)系電話子郵箱：panfj@黑龍江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB23/TXXXX—XXXX黑龍江省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS65.020.20B05DB23/TXXXX—XXXX前言本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2020的編寫規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由黑龍江省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)業(yè)技術(shù)中心起草和先正達（中國）投資有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：潘鳳娟、李峰、胡巖峰、劉聃、陸欣春、嚴君、鄒文秀。PAGE2玉米線蟲矮化病原長嶺發(fā)墊刃線蟲鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了玉米田長嶺發(fā)墊刃線蟲（Trichotylenchuschanglingensis）田間調(diào)查的土壤取樣、分離和鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米田的玉米線蟲矮化病原田間調(diào)查和鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。長嶺發(fā)墊刃線蟲Trichotylenchuschanglingensis屬于線蟲門（Nemata）、側(cè)尾腺綱（Secernentea）、墊刃目（Tylenchida）、錐科（Dolichodoridae）、發(fā)墊刃屬（Trichotylenchus），引起玉米線蟲矮化病。玉米線蟲矮化病玉米苗期由長嶺發(fā)墊刃線蟲侵染玉米根部引起的一種玉米病害。感病植株4-5葉期癥狀明顯，葉片上出現(xiàn)沿著葉脈方向黃色或白色失綠條紋，隨植株的生長發(fā)育，莖基部組織呈縱向或橫向開裂狀，呈“蟲道”狀，大部分植株莖節(jié)縮短膨大，矮縮或叢生，不結(jié)果穗或果穗瘦小，發(fā)病輕植株后期恢復(fù)后，果穗也發(fā)育不良。取樣取樣時期在玉米4-5葉期至收貨前取樣。取樣方法選取玉米線蟲矮化病植株，先去除1cm～2cm表土，用土壤取樣器采集發(fā)病植株根圍的土壤，取樣深度0-15cm。采用對角線五點取樣法，每個玉米地塊取5個樣點，每個樣點由6個玉米根圍土樣混合而成，土樣不少于500g，寫好標(biāo)簽，將樣品裝入取樣袋中，4℃～8℃條件下保存。取樣時應(yīng)在土壤濕潤時進行，避免在土壤過干或浸水時取樣。參照DB23/T2374—2019規(guī)定執(zhí)行。儀器用具儀器生物顯微鏡（100×℃1000×）、生物體視顯解剖鏡、-80℃冰箱、水浴鍋、PCR儀、電泳儀、高速離心機、純水儀、制冰機、凝膠成像系統(tǒng)。用具挑針、玻片、移液槍和500目土樣篩。線蟲分離淺盤分離法應(yīng)嚴格按照SN/T1141中對線蟲分離的要求進行線蟲分離。線蟲鑒定形態(tài)學(xué)鑒定標(biāo)本制作參見SN/T1141中的附錄C。線蟲形態(tài)觀察在顯微鏡下，對線蟲標(biāo)本進行形態(tài)觀察，應(yīng)嚴格按照規(guī)定執(zhí)行。長嶺發(fā)墊刃線蟲形態(tài)特征參見附錄A。分子生物學(xué)鑒定將顯微鏡下確定的長嶺發(fā)墊刃線蟲，再采用分子生物學(xué)技術(shù)進行鑒定。線蟲DNA提取將線蟲置于滅菌去離子水中清洗，挑取單條線蟲放入10μL裂解緩沖液[1×PCRBuffer(Mg2+）和6μg蛋白酶K)中，65℃水浴1min，液氮冷凍2min，反復(fù)凍融，60℃水浴30min，95℃10min，12000r/min離心10min，取上清DNA提取液，-20℃保存?zhèn)溆?。線蟲rDNA-ITS區(qū)測序采用線蟲通用引物D2A/D3B擴增線蟲的28S區(qū)。PCR反應(yīng)體系：44μLPCRMix，上游引物和下游引物各2μL，DNA模板2μL。反應(yīng)條件95℃4min，94℃30s，50℃45s，72℃45s，40個循環(huán)；72℃10min，16℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收克隆后送生物公司進行測序。測序結(jié)果與NCBI上已知的結(jié)果進行