第一章 提取與沉淀分離技術(shù)課件

第一章提取與沉淀分離技術(shù)

生物物質(zhì)，尤其是生物大分子物質(zhì)：蛋白質(zhì)（包括酶），核酸，脂類，糖類等生物大分子的制備分四個(gè)階段：選擇材料和預(yù)處理細(xì)胞的破碎及細(xì)胞組分的分離提取和純化濃縮，干燥和保存1第一章提取與沉淀分離技術(shù)生物大分子物質(zhì)及其性質(zhì)生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、pH值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷2第一章提取與沉淀分離技術(shù)

動物，植物，微生物都可作為制備生物大分子的原材料，所選用的材料主要依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。

有效成份是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。而有效成分以外的其它物質(zhì)則統(tǒng)稱雜質(zhì)。生物材料的選擇3第一章提取與沉淀分離技術(shù)在動、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般較少；穩(wěn)定性較差，大多數(shù)對酸、堿、高溫和高濃度有機(jī)溶劑等因子較敏感；易被微生物分解變質(zhì)。材料的采集會大大影響實(shí)驗(yàn)的成敗,選用的材料不同，有效成分的含量就不同；同一材料的部位或生長期不同，有效成分的含量也不盡相同?？偟膩碚f，材料選擇應(yīng)遵循的原則是，有效成分含量多、穩(wěn)定性好；來源豐富、保持新鮮；提取工藝簡單、有綜合利用價(jià)值等。4第一章提取與沉淀分離技術(shù)1、動物臟器：冰凍：-10℃冰庫（短期保存）

-70℃低溫冰箱（數(shù)月）干燥：可長期保存2、植物組織：10小時(shí)內(nèi)置-4--30℃冰箱儲藏備用

3、微生物：胞外產(chǎn)物（如發(fā)酵液），低溫短時(shí)儲藏。

胞內(nèi)產(chǎn)物，則應(yīng)收集菌體或細(xì)胞，制成凍干粉于4℃保存（數(shù)月不變質(zhì)）

除了體液和微生物胞外的某些蛋白質(zhì)和多肽以外,大多數(shù)生物大分子都存在于細(xì)胞之內(nèi).為了將細(xì)胞內(nèi)的生物大分子提取和分離,就得將細(xì)胞或組織破碎.生物材料處理5第一章提取與沉淀分離技術(shù)1、動物組織：

選材：必須選擇有效成分含量豐富且易分離的臟器組織為原材料。如磷酸單酯酶，從含量看，雖然在胰臟、肝臟和脾臟中較豐富，但是因其與磷酸二酯酶共存，進(jìn)行提純時(shí)，這兩種酶很難分開。所以實(shí)踐中常選用含磷酸單酯酶少，但幾乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。

脫脂：臟器中含量較高的脂肪，容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料變質(zhì)影響純度操作和制品的率。常用的脫脂方法有：人工剝?nèi)ヅK器外的脂肪組織；浸泡在脂溶性的有機(jī)溶劑（丙酮，乙醚）中脫脂；采用快速加熱（50℃左右），快速冷卻的方法，使溶化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去。

6第一章提取與沉淀分離技術(shù)

保存：對預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存。

冰凍：剝?nèi)ブ竞徒钇さ冉Y(jié)締組織，短期保存：－10℃的冰箱內(nèi)；長期保存：－70℃低溫冰箱內(nèi)。

干燥：對于像腦垂體一類小組織，可置丙酮液中脫水，干燥后磨粉儲存?zhèn)溆?；對于含耐高溫有效成分（如：肝素）的腸粘膜，可在沸水蒸煮處理，烘干后能長期保存。

冰箱的除霜循環(huán)，可能對細(xì)胞造成傷害，要特別小心。解凍時(shí)要越快越好，但避免局部過熱。7第一章提取與沉淀分離技術(shù)2、植物材料：

選材：注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。種子須泡脹或粉碎才可使用。含油脂較多的也要進(jìn)行脫脂處理。

a.提取核DNA：選用黃化苗（生長7－10天小麥，水稻），防止葉綠體DNA的干擾

b.提取RNA：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用生長幼嫩組織為好。

保存：冷凍采樣后盡快放于－4℃――20℃冰箱內(nèi)。

DNA,RNA采樣后，用液氮速凍，至－70℃冰箱。對RNA樣，如不立即使用，冷凍保存尤為重要。8第一章提取與沉淀分離技術(shù)3.微生物：

選材：應(yīng)注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時(shí)有兩種情況：利用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等。一般用離心法收集上清液，上清液只能在低溫下短期保存利用菌體含有的生化物質(zhì)，如：蛋白質(zhì)，核酸和胞內(nèi)酶等。需破碎菌體細(xì)胞分離，濕菌體可低溫短期保存，凍干粉可在4℃保存數(shù)月。

39第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分：肽聚糖磷壁酸脂多糖蛋白質(zhì)等10第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌堅(jiān)韌度較堅(jiān)韌較疏松肽聚糖含量較厚，可達(dá)50層，約占細(xì)胞壁干重的50%以上較薄，約占細(xì)胞壁干重的10%左右磷壁酸有無及含量有，約占細(xì)胞壁干重的50%無外膜（含脂多糖、脂質(zhì)雙層、脂蛋白）有無及含量無約占細(xì)胞壁干重的80%。11第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)外層：甘露聚糖（約占30%，以α-糖苷鍵聯(lián)結(jié)（并非所有酵母菌都有）內(nèi)層：葡聚糖（約占30-40%，由D-葡萄糖以β-糖苷鍵聯(lián)結(jié)）中間層：蛋白質(zhì)（含6-8%，多為酶類）

細(xì)胞壁

壁外成分：有些菌壁外含有由多糖構(gòu)成的類似莢膜的結(jié)構(gòu)。包括異多糖、甘露聚糖和淀粉類物質(zhì)。細(xì)胞壁的少量組分—脂類和幾丁質(zhì)幾丁質(zhì)（chitin)：為聚乙酰氨基葡萄糖幾丁質(zhì)并不是所有的酵母菌中都有，其含量也因種而異。裂殖酵母一般不含幾丁質(zhì)，釀酒酵母含1～2%，有的假菌絲酵母含量超過了2%。12第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)

構(gòu)成細(xì)胞壁的成分中，90%左右是多糖，10%左右是蛋白質(zhì)、酶類以及脂肪酸等。細(xì)胞壁中的多糖主要是纖維素、半纖維素和果膠類，它們是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等聚合而成。次生細(xì)胞壁中還有大量木質(zhì)素。

13第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎動物細(xì)胞結(jié)構(gòu)動物細(xì)胞植物細(xì)胞不同點(diǎn)沒有細(xì)胞壁沒有質(zhì)體有中心體某些低等動物有液泡有細(xì)胞壁有質(zhì)體中心體見于低等植物中有液泡相同點(diǎn)都有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核。細(xì)胞質(zhì)中共有的細(xì)胞器是線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基體等14第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎的方法

酶學(xué)破碎法：外加酶制劑、自溶法。機(jī)械破碎法：高速搗碎法、高速均漿法、高速磨珠法

物理破碎法：溫差法、壓差法、超聲波

化學(xué)破碎法：有機(jī)溶劑法、表面活性劑（SDS等）、金屬螯合劑（Mg2+、Ca2+、EDTA）、化學(xué)變性劑。15第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎1.機(jī)械破碎：(1)研磨法：剪碎的動物組織如鼠肝、兔肝等置研缽中，用研磨棒研碎。為了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。用勻漿器處理，也能破碎動物細(xì)胞。此法較溫和，適宜實(shí)驗(yàn)室使用。但加石英砂時(shí)，要注意其對有效成分的吸附作用。如系大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用電動研磨法。細(xì)菌和植物組織的細(xì)胞破碎均可用此法。16第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎(2)組織搗碎器法：用搗碎器(轉(zhuǎn)速8000-10000r/m)處理30-45s可將植物和動物細(xì)胞完全破碎。如用其破碎酵母菌和細(xì)菌的細(xì)胞時(shí)，須加入石英砂才有效。但是在搗碎期間必須保持低溫，搗碎的時(shí)間不易太長，以防溫度升高引起有效成分變性?，F(xiàn)在多用細(xì)胞破碎儀。(3)超聲波法：借助聲波的震動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。多用于微生物細(xì)胞的破碎，一般輸出功率100-200W，破碎時(shí)間3—15min。如果在細(xì)胞懸浮液中加石英砂則可縮短時(shí)間。為了防止電器長時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生過多的熱量，常采用間歇處理和降低溫度的方法進(jìn)行。17第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎2.溶漲和自溶：

溶漲：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞膜發(fā)生脹破的現(xiàn)象稱溶脹。例如紅血球置清水中會迅速溶脹破裂并釋放出血紅素。

自溶：細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱自溶。應(yīng)用此法時(shí)要特別小心操作，因?yàn)樗饷覆粌H可使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破壞，同時(shí)也可將某些有效成分在自溶時(shí)分解。3.化學(xué)處理：

用脂溶性的溶劑(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性劑(如十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉)處理細(xì)胞時(shí)，可將細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解，進(jìn)而使細(xì)胞釋放出各種酶類或DNA等物質(zhì)，并導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞破碎。18第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎4.生物酶降解：

生物酶(如溶菌酶)有降解細(xì)菌細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，先是細(xì)胞壁消解，隨之而來的是因滲透壓差引起的細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎。例如從某些細(xì)菌細(xì)胞提取質(zhì)粒DNA時(shí)，不少方法都采用了加溶菌酶(來自蛋清)破壞細(xì)胞壁的步驟。當(dāng)有些細(xì)菌對溶菌酶不敏感時(shí)，可加巰基乙醇（ME）或者8mol/L的尿素，以促進(jìn)細(xì)胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K來提高破壁效果。而在破壞酵母菌的細(xì)胞時(shí)，可采用蝸牛酶進(jìn)行。一般對數(shù)期的酵母細(xì)胞對該酶較敏感。將酵母細(xì)胞懸于0.1mol/L檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.4)中，加入1%蝸牛酶，在30℃處理30分鐘，即可使大部分細(xì)胞壁破裂，如同時(shí)加入0.2%巰基乙醇效果更好。19第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎5、壓榨法：是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。用30MPa左右的壓力迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔(＜細(xì)胞直徑的孔)，致使其被擠破、壓碎。6、凍融法：將細(xì)胞置低溫下冰凍一定時(shí)間，然后取出置室溫下(或40℃左右)迅速融化。如此反復(fù)凍融多次，細(xì)胞可在形成冰粒和增高剩余胞液鹽濃度的同時(shí)，發(fā)生溶脹、破碎。20第一章提取與沉淀分離技術(shù)第二節(jié)提取

抽提通常是指用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒◤脑牧现邪延行С煞址蛛x出來的過程。經(jīng)過處理的原材料中的有效成分可用緩沖液、稀酸、稀堿、或有機(jī)溶劑（如丙酮、乙醇）等抽提，有時(shí)還可用蒸餾水抽提。一般理想的抽提液應(yīng)具備下述條件：對有效成分溶解度大，破壞作用??；對雜質(zhì)不溶解或溶解度很??；來源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等。提取的含義21第一章提取與沉淀分離技術(shù)第二節(jié)提取

在抽提階段，pH值、金屬離子、溶劑的濃度和極性等因子，可明顯影響有效成分的性質(zhì)和數(shù)量。因此選擇抽提液必須考慮這些因素。1、pH值：改變?nèi)苜|(zhì)解離狀態(tài)。對蛋白質(zhì)或酶等具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)物質(zhì)，一般選擇抽提液的pH值應(yīng)在偏離等電點(diǎn)的穩(wěn)定范圍內(nèi)。通常堿性蛋白質(zhì)選用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白質(zhì)選用高pH值的溶液抽提，或者用調(diào)至一定pH值的有機(jī)溶劑抽提。注意：當(dāng)用酸，堿控制溶液pH值時(shí)，要邊加邊攪，防止局部出現(xiàn)過高的酸，堿濃度造成蛋白變性。抽提的影響因子22第一章提取與沉淀分離技術(shù)第二節(jié)提取2、溶劑的極性和離子強(qiáng)度：有些生物大分子在極性大、離子強(qiáng)度高的溶液中穩(wěn)定；有些則在極性小、離子強(qiáng)度低的溶液中穩(wěn)定。例如提取刀豆球蛋白A時(shí)，用0.15mol/L甚至更高濃度的NaCl溶液，都可使其從刀豆粉中溶解出來，穩(wěn)定存在。而抽提脾磷酸二酯酶時(shí)，則需用0.2mol/L蔗糖水溶液。一種物質(zhì)溶解度大小與溶劑性質(zhì)密切相關(guān)（相似相溶原理）；離子強(qiáng)度通過影響溶質(zhì)的帶電性也影響溶質(zhì)的溶解度。

降低極性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亞砜，二甲基甲酰氨。抽提的影響因子23第一章提取與沉淀分離技術(shù)第二節(jié)提取

提高離子強(qiáng)度：在水溶液中加中性鹽（KCl,NaCl,NH4Cl,(NH4)2SO4）一般離子強(qiáng)度較低的中性鹽溶液可促進(jìn)蛋白溶解（鹽溶），高離子強(qiáng)度的中性鹽可引起蛋白質(zhì)沉淀，析出（鹽析）。高離子強(qiáng)度使DNA溶解度增加；低離子強(qiáng)度使RNA溶解度增加（核酸分離依據(jù)）。常用的鹽溶液是NaCl溶液，濃度以0.15mol/L為宜。但是在提取核蛋白或細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)時(shí)，為促使蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與細(xì)胞器分離，則宜用高濃度(0.5-2.0mol/L)的鹽溶液。抽提的影響因子24第一章提取與沉淀分離技術(shù)第二節(jié)提取

3、水解酶：細(xì)胞破裂后，許多水解酶釋放出來。水解酶與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸接觸時(shí)，一旦條件適宜，就會發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸分解，而使實(shí)驗(yàn)失敗。為此，必須采用加入抑制劑，調(diào)節(jié)抽提液的pH、離子濃度或極性等方法，使這些酶喪失活性。如：提取，純化胰島素時(shí)，為阻止胰蛋白酶活化，采用68％的乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸調(diào)節(jié)），在13－15℃抽提3h，可得到較高的回收率。因?yàn)?8％乙醇可使胰蛋白酶暫時(shí)失活，草酸可除去蛋白酶的激活劑Ca2+，酸性環(huán)境也抑制酶蛋白活性。

抽提的影響因子25第一章提取與沉淀分離技術(shù)第二節(jié)提取4、溫度：一般認(rèn)為蛋白質(zhì)或酶制品在低溫(如0℃左右)時(shí)最穩(wěn)定。例如：在生產(chǎn)人絨毛膜促性腺激素(HCG，糖蛋白)制品時(shí)，一定要在低溫下進(jìn)行。當(dāng)溫度低于8℃時(shí)，從200公斤孕婦尿中可提取約100克HCG粗品(活力為160u/mg)；當(dāng)溫度高于20℃時(shí)，從400公斤孕婦尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。此外，高溫下制備的HCG粗品很難進(jìn)一步純化至3500u/mg，原因是高溫會使HCG受到微生物和/或糖苷酶的破壞。一般提高溫度，溶解度增加，但易使大分子物質(zhì)變性失活。小分子物質(zhì)：50－70℃；生物大分子：0－10℃，最好控制在0－4℃抽提的影響因子26第一章提取與沉淀分離技術(shù)第二節(jié)提取5、攪拌：

攪拌能促使欲抽提物與抽提液的接觸，并能增加溶解度。但是，一般宜采用溫和的攪拌方法，速度太快時(shí)容易產(chǎn)生泡沫，導(dǎo)致某些酶類變性失活。6、氧化：

一般蛋白質(zhì)都含相當(dāng)數(shù)量的巰基，該基團(tuán)常常是酶和蛋白質(zhì)的必須基團(tuán)，若抽提液中存在氧化劑或氧分子時(shí)，會使巰基形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶(或蛋白質(zhì))失活(或變性)。在提取液中加入巰基乙醇，半胱氨酸。還原性谷胱甘肽等還原劑，可防止巰基發(fā)生氧化，使蛋白，酶失活。抽提的影響因子27第一章提取與沉淀分離技術(shù)第二節(jié)提取7、金屬離子：蛋白質(zhì)的巰基除易受氧化劑作用外，還能和金屬離子如鉛、鐵或銅作用，產(chǎn)生沉淀復(fù)合物。這些金屬離子主要來源于制備緩沖液的試劑中。解決的辦法：①用無離子水或重蒸水配制試劑；②在配制的試劑中加入1-3mmol/L的EDTA(金屬離子絡(luò)合劑)。

8、抽提液與抽提物的比例：在抽提時(shí)，抽提液與抽提物的比例要適當(dāng)，一般以5∶1為宜。如抽提液過多，則有利于有效成分的提取，但不利于純化工序的進(jìn)行。抽提的影響因子28第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離1、鹽析的原理

定義：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；而當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。在同一濃度的鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達(dá)到彼此分離的目的。

原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出。鹽析沉淀法29第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離鹽析沉淀法30第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離鹽能夠改變蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強(qiáng)度有密切關(guān)系。兩者的關(guān)系可用下式表示：

lg（S/So）=-KsI

S為蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為I時(shí)的溶解度(g/L)；So為蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為0時(shí)的溶解度；Ks為鹽析常數(shù)；I為離子強(qiáng)度。在溫度一定的條件下，某一蛋白質(zhì)在某一pH值的水溶液中的溶解度為一常數(shù)So。故上式可改寫為：

lgS=lgSo–KsI=β–KsI

β=lgSo為一常數(shù)β值主要取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)，也與溶液的溫度和pH值有關(guān)；鹽析常數(shù)Ks主要與鹽的性質(zhì)(離子價(jià)數(shù)、平均半徑等)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，Ks越大，鹽析效果越好。鹽析沉淀法31第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離

所以對某一蛋白質(zhì)來說，在溫度和pH值等鹽析條件確定(即β確定)，所采用的鹽確定(即Ks確定)以后，蛋白質(zhì)的溶解度決定于離子強(qiáng)度I,可用下式計(jì)算：

I=1/2∑miZi2

mi:溶液中離子的摩爾濃度

Zi：離子的價(jià)數(shù)

對于多種蛋白質(zhì)或酶的混合液，可采用分段鹽析法進(jìn)行分離純化。鹽析沉淀法32第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離2.鹽的選擇：蛋白質(zhì)的鹽析通常采用中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等，其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨。

硫酸銨是一中性鹽，對蛋白質(zhì)有相當(dāng)好的安定作用。又因?yàn)槠潆x子容積較大，吸走水分子的能力也大，成為有效的鹽析工具。硫酸銨在水中的溶解度大而溫度的影響小(25℃時(shí)溶解度為4.1mol/L，即767g/L;0℃時(shí)溶解度為3.7mol/L，即697g/L)，而且價(jià)廉易得，不易引起蛋白質(zhì)變性，分離效果比其他鹽好。但是，用硫酸銨鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子會干擾蛋白氮的測定，故有時(shí)也要用其他鹽來進(jìn)行鹽析。磷酸鉀和硫酸鈉的鹽析系數(shù)Ks較大，但由于在較低溫度下的溶解度太低,受溫度影響大，故應(yīng)用不廣泛。鹽析沉淀法33第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離3.硫酸銨濃度的計(jì)算與調(diào)整方法

:通常硫酸銨的添加以百分飽和度來表示(不是濃度百分比)，例如大部分蛋白質(zhì)可在80%硫酸銨飽和度下沉淀。因?yàn)榱蛩徜@加入的體積很大，會改變最后的總體積，很難由濃度百分比來計(jì)算，因此使用百分飽和度作為沉淀蛋白質(zhì)的度量。鹽析沉淀法34第一章提取與沉淀分離技術(shù)用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨濃度的調(diào)整方法主要有二種：

1）、加入飽和溶液法要求：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高

V=V0(S2-S1)/（1-S2）

V:所需加進(jìn)的飽和硫酸銨溶液的體積；V0:原溶液體積；S2：所需達(dá)到的硫酸銨飽和度；S1:原溶液的硫酸銨飽和度。

飽和硫酸銨的配制方法：在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱至50－60℃，趁熱濾去沉淀，再在0℃或室溫平衡1－2天，有固體析出時(shí)達(dá)100％飽和度。35第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離2）、加入固體鹽法要求：飽和度高，不增大溶液體積

t=G(S2-S1)/（1-AS2）

S2，S1:分別代表所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原溶液的硫酸銨飽和度；t：將1LS1飽和度的溶液提高到S2飽和度時(shí)所需加進(jìn)的硫酸銨克數(shù)；G,A：常數(shù)，與溫度有關(guān)。實(shí)際使用時(shí)，t可直接查表得到。（注意：0℃，25℃兩張表，室溫用25℃）

鹽析沉淀法36第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離鹽析沉淀法37第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離鹽析沉淀法4.影響蛋白質(zhì)鹽析的因素：1）、蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在25－30g/L。

2）、離子強(qiáng)度和離子類型的影響離子強(qiáng)度增加，溶解度下降，鹽析易發(fā)生不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需離子強(qiáng)度不同，可采用分步鹽析，通過逐步增加離子強(qiáng)度，使不同蛋白分步沉淀出來離子強(qiáng)度相同時(shí)，高價(jià)離子，半徑小的離子鹽析力強(qiáng)38第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離鹽析沉淀法3）、pH的影響大多數(shù)蛋白質(zhì)在等點(diǎn)電時(shí)，在鹽溶液中的溶解度最低。所以鹽析時(shí)溶液pH值調(diào)到等電點(diǎn)效果最好。4）、溫度的影響在低離子強(qiáng)度或純水中，溫度升高，溶解度增加；在高鹽溶液中，溫度升高，溶解度降低。一般在室溫下進(jìn)行鹽析;溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫4℃進(jìn)行;也有個(gè)別酶在低溫時(shí)失活，高溫有活性,如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25℃比0℃時(shí)溶解度低，更容易鹽析。實(shí)際使用：

制備初期：pH，溫度一定，改變鹽濃度（離子強(qiáng)度）（Ks分段鹽析）；純化，結(jié)晶：離子強(qiáng)度一定，改變pH，溫度（β分段鹽析）39第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離鹽析沉淀法5、鹽析時(shí)的注意事項(xiàng)：添加的硫酸銨的純度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不斷攪拌，防止局部過濃，發(fā)生共沉淀；同一溶液中欲分離幾種蛋白質(zhì)時(shí)，可采用分段鹽析的方法。鹽析通常與等電點(diǎn)沉淀法配合使用。選擇好溫度，一般在室溫下進(jìn)行；蛋白濃度不易過高，一般25－30g/L；低濃度鹽析，可用離心分離；高濃度鹽析（70－80％），用過濾（因?yàn)檎扯却?，離心操作慢）；鹽析沉淀得到的蛋白質(zhì)含量較高，純品需經(jīng)脫鹽處理，如透析，凝膠過濾等。40第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離等電沉淀法

利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以及不同的蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)一這特性，對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零，消除了分子間的靜電斥力，但由于水膜的存在，蛋白質(zhì)仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等電沉淀法經(jīng)常與鹽析法或有機(jī)溶劑沉淀法聯(lián)合使用。單獨(dú)使用等電點(diǎn)法主要是用于去除等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。在加酸或加堿調(diào)節(jié)pH的過程中，要一邊攪拌一邊慢慢加入，以防止局部過酸或過堿。

41第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離有機(jī)溶劑沉淀法作用機(jī)理：（1）降低水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)溶解度降低；（2）破壞大分子周圍水膜，使溶解度降低。利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使蛋白質(zhì)分離的方法，稱為有機(jī)溶劑沉淀法。經(jīng)常使用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮。優(yōu)點(diǎn)：

比鹽析法析出的沉淀容易過濾或離心分離，分辨力比鹽析法好，溶劑也容易除去。42第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離有機(jī)溶劑沉淀法缺點(diǎn)：有機(jī)溶劑沉淀法易使蛋白質(zhì)和酶變性，所以操作必須在低溫條件下進(jìn)行。蛋白質(zhì)和酶沉淀分離后，應(yīng)立即用水或緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑濃度，避免變性。中性鹽可減少有機(jī)溶劑引起的蛋白質(zhì)變性，提高分離效果，一般添加0.05mol/L的中性鹽。由于中性鹽會增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度，故中性鹽不宜添加太多。

有機(jī)溶劑沉淀法一般與等電點(diǎn)沉淀法聯(lián)合使用。即操作時(shí)溶液的pH值應(yīng)控制在欲分離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。43第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離有機(jī)溶劑沉淀法注意：（1)低溫操作（2）樣品濃度過大，易變性，共沉淀作用大，分離效果差；過小，易產(chǎn)生變性，回收率低。（3）樣品穩(wěn)定結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)，選擇溶解度最低處的pH，與等電點(diǎn)共沉淀結(jié)合使用。（4)注意離子強(qiáng)度，離子種類的影響。44第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離選擇性變性沉淀法

選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法稱為選擇性變性沉淀法。例如：利用加熱，改變pH或加進(jìn)某些重金屬離子等使雜蛋白變性沉淀而除去。應(yīng)用此法，應(yīng)對欲提純蛋白質(zhì)和雜蛋白的理化性質(zhì)有較全面的了解。45第一章提取與沉淀分離技術(shù)第三節(jié)沉淀分離非離子多聚物沉淀法

聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸鈉等非離子多聚物可以沉淀蛋白質(zhì)和細(xì)菌。沉淀機(jī)理：空間位置排斥效應(yīng)。試劑溶解度大，在水中占據(jù)大部分空間，將需沉淀物相互靠近，增加碰撞機(jī)率。優(yōu)點(diǎn)：（1）操作條件溫和，不易引起變性；（2）具有極高的沉淀效率；（3）沉淀后多聚物容易除去。應(yīng)用：沉淀分離細(xì)菌，病毒蛋白；質(zhì)粒純化（做洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)）。

46第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離

核酸類化合物都溶于水而不溶于有機(jī)溶劑。所以核酸可用水溶液提取，而用有機(jī)溶劑沉淀法沉淀分離。從生物材料中分離出的DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白質(zhì)（DNP）或RNA-蛋白質(zhì)（RNP）復(fù)合物形式存在。因此，要制備初步純化的核酸時(shí)，首先要分離出DNP或RNP，再將復(fù)合物解聚，除去蛋白質(zhì)，然后通過沉淀法得到核酸。核酸提取與沉淀分離47第一章提取與沉淀分離技術(shù)在0.14mol/L的氯化鈉溶液中，RNP的溶解度相當(dāng)大，而DNP的溶解度僅為在水中溶解度的1%；當(dāng)氯化鈉的濃度達(dá)到1mol/L的時(shí)候，RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。所以，常選用0.14mol/L的氯化鈉溶液提取RNP，而選用1mol/L的氯化鈉溶液提取DNP。48第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離

主要采用加入去污劑、有機(jī)溶劑和蛋白水解酶等試劑來實(shí)現(xiàn)。去污劑：在破碎細(xì)胞的溶液中，加入適量的陰離子去污劑SDS、TritonX-100、Tween40和NP-40等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，將DNP/RNP復(fù)合物解聚，進(jìn)而釋放出核酸。有機(jī)溶劑：苯酚、氯仿等是蛋白質(zhì)的變性劑。根據(jù)抽提液中蛋白質(zhì)的含量和溶劑的純度，用變性劑反復(fù)處理抽提液，直到離心后，上層水相（含核酸）和下層有機(jī)相之間的界面處無變性蛋白為止。蛋白水解酶：用此法除去復(fù)合物中的蛋白質(zhì)的操作比較溫和，常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶DNP/RNP復(fù)合物的解聚49第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離

采用動物或植物作材料提取核酸時(shí)，動物在宰殺前饑餓12h，植物在取材前暗室培養(yǎng)數(shù)天，其體內(nèi)的糖原和淀粉類物質(zhì)均會減少?；祀s于核酸提取液中的多糖類物質(zhì)，一般可用選擇性沉淀劑如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）可達(dá)到分離目的?；蛴玫润w積的2.5mol/L磷酸緩沖液和等體積的乙二醇甲醚處理，離心后，多糖位于中部，核酸存在上層乙二醇甲醚中。多糖的消除50第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離

tRNA(約占細(xì)胞內(nèi)RNA的15%)的相對分子質(zhì)量較小，在細(xì)胞破碎以后溶解在水溶液中，濾液用酸處理，調(diào)節(jié)到pH5得到的沉淀的中可分離得到tRNA。

mRNA占細(xì)胞RNA的5%左右，很不穩(wěn)定，提取條件要嚴(yán)格控制。

rRNA約占細(xì)胞內(nèi)RNA的80%，一般提取的RNA主要是rRNA。由于RNA是基因表達(dá)過程中非常重要的生物分子，如mRNA攜帶了DNA為蛋白質(zhì)編碼的信息。RNA的分離是研究基因功能的重要基礎(chǔ)之一，在分子生物學(xué)中占有重要的地位。

RNA的提取方法主要有稀鹽溶液提取和苯酚溶液提取。RNA的提取51第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離稀鹽溶液提?。?/p>

將細(xì)胞破碎制成細(xì)胞勻漿，然后用0.14mol/L的氯化鈉溶液反復(fù)抽提，得到核糖核蛋白提取液，再進(jìn)一步與脫氧核糖核蛋白、蛋白質(zhì)、多糖等分離，可得RNA。苯酚溶液提?。?/p>

在細(xì)胞破碎制成勻漿后，用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚/氯仿在一定條件下振蕩一定時(shí)間，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA，將RNA與蛋白質(zhì)分開。RNA的提取52第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離

從細(xì)胞中提取DNA，一般在細(xì)胞破碎后用濃鹽法提取。即用1mol/L的氯化鈉溶液從細(xì)胞勻漿中提取脫氧核糖核蛋白，再與含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質(zhì)。或者先以0.14mol/L氯化鈉溶液(也可用0.1mol/LNaCl加上0.05mol/L檸檬酸代替)反復(fù)洗滌除去核糖核蛋白后，再用1mol/L氯化鈉溶液提取脫氧核糖核蛋白，經(jīng)氯仿戊醇(辛醇)或水飽和酚處理，除去蛋白質(zhì)，而得到DNA。DNA的提取53第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離核酸分離純化應(yīng)維持在0-4℃的低溫度條件下，以防止核酸的變性和降解。為防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羥基喹啉、檸檬酸鈉等以抑制核酸酶的活性。常用的沉淀分離法有：有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法鈣鹽沉淀法選擇性溶劑沉淀法核酸的沉淀分離54第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離（1）有機(jī)溶劑沉淀法：由于核酸都不溶于有機(jī)溶劑，所以可在核酸提取液中加入乙醇、異丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下來。核酸沉淀的形狀與其相對分子質(zhì)量密切相關(guān)，相對分子質(zhì)量>106Da的雙鏈DNA可以絲狀纖維纏繞在玻棒上；相對分子質(zhì)量稍小的雙鏈DNA或單鏈DNA、RNA則以凝膠形式存在，這些核酸經(jīng)離心后存在于沉淀中，用70%乙醇洗滌，除去其它鹽和小分子物質(zhì)，干燥后即為核酸制品。(2)等電點(diǎn)沉淀法：脫氧核糖核蛋白的等電點(diǎn)為pH4.2；核糖核蛋白的等電點(diǎn)力pH2.0-2.5；tRNA的等電點(diǎn)為pH5。所以將核酸提取液調(diào)節(jié)到一定的pH，就可使不同的核酸或核蛋白分別沉淀而分離。核酸的沉淀分離55第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離(3)鈣鹽沉淀法：在核酸提取液中加入一定體積比(一般為1/10)的10%氯化鈣溶液，使DNA和RNA均成為鈣鹽形式，再加進(jìn)1/5體積的乙醇，DNA鈣鹽即形成沉淀析出。(4)選擇性溶劑沉淀法：選擇適宜的溶劑，使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀而與核酸分離，這種方法稱為選擇性溶劑沉淀法。在核酸提取液中加入氯仿/異戊醇或氯仿/辛醇，振蕩一段時(shí)間，使蛋白質(zhì)在氯仿/水界面上形成凝膠狀沉淀而離心除去，核酸仍留在水溶液中。在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都進(jìn)入水層，而蛋白質(zhì)沉淀于苯酚層中被分離除去。在DNA與RNA的混合液中，用異丙醇選擇性地沉淀DNA而與留在溶液中的RNA分離。核酸的沉淀分離56第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離核酸提取注意事項(xiàng)：盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞；減少化學(xué)因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4-10的條件下進(jìn)行；減少物理因素對核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌，使溶液快速地通過狹長的孔道，細(xì)胞突然置于低滲液中，細(xì)胞爆炸式破裂以及DNA樣本的反復(fù)凍貯。高溫如長時(shí)間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的有些化學(xué)鍵也有破壞作用。防止核酸的生物降解，細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)，其中DNA酶，需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，使用EDTA、檸檬酸鹽螯合金屬二價(jià)離子，基本可以抑制DNA酶活性。而RNA酶不但分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿、不易失活，所以是生物降解RNA提取過程的主要危害因素。57第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離技術(shù)1：基因組總DNA的大量提取本方法通過液氮研磨粉碎動植物組織、裂解液裂解細(xì)胞、有機(jī)溶劑抽提，使進(jìn)入水相的核酸與蛋白成分分開，在RNA酶作用下，降解RNA，得純度較高的DNA樣品。

儀器：

高速冷凍離心機(jī)、臺式離心機(jī)、恒溫水浴、低溫冰箱或冰柜、冷凍真空干燥器、取液器、電泳儀、水平電泳槽、紫外分光光度計(jì)。試劑：細(xì)胞裂解液（100mMTris-HCl5mMEDTA500mMNaCl1%SDSpH7.5）；飽和酚；氯仿/異戊醇；異丙醇；70%及無水乙醇；3MNaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE緩沖液；載樣緩沖液核酸提取技術(shù)58第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離操作：動植物材料10g(鮮組織)0.5g(干凍組織)液氮，研碎10ml裂解液(含1/10體積酚),(65℃預(yù)熱)(加入等體積氯仿)(65℃，30min間隔5－10min輕搖一次)離心(12000-15000rpm,15min)上清液(0.6體積冷異丙醇)(0.1體積3MpH5,2乙酸鈉）59第一章提取與沉淀分離技術(shù)2mlTE(或水)＋10ulRNase，65℃,10-30分復(fù)溶和除RNA挑取絮狀體（70%冷乙醇洗滌,真空干燥）（5000RPM，5min）等體積酚/氯仿,氯仿抽提（輕輕混勻、冰浴沉淀5min）2倍無水乙醇、1/10體積醋酸鈉上清液第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離60第一章提取與沉淀分離技術(shù)(10000RPM,10min)(-80℃，30min)(70％冷乙醇洗)沉淀基因組DNA干粉(真空干燥)保存：干粉-20℃保存，或復(fù)溶于0.5-1mlTE或水中,分裝成小體積,-20℃或4℃保存

第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離61第一章提取與沉淀分離技術(shù)第四節(jié)核酸的提取與沉淀分離注意:裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進(jìn)DN