人胸腺肽β4基因在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)、純化及促血管生成生物活性研究

人胸腺肽β4基因在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)、純化及促血管生成生物活性研究〔作者:___________單位:___________:___________〕

【摘要】目的：在大腸桿菌中克隆和表達(dá)人源胸腺肽〔thymosinβ4，TB4〕基因并進(jìn)行別離純化及促血管生成生物活性鑒定。方法：人工設(shè)計(jì)TB4基因片段，其密碼子為大腸桿菌所偏愛(ài)，將合成的寡核苷酸片段經(jīng)分子克隆拼接成TB4基因片段，與pET28a(+)載體連接成重組表達(dá)質(zhì)粒pET28aTB4，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21〔DE3〕，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)帶His6Tag的融合蛋白His6TB4，通過(guò)鎳柱親和層析純化，采用SDSPAGE分析鑒定，由CAM試驗(yàn)進(jìn)行重組蛋白活性的生物活性鑒定。結(jié)果：經(jīng)DNA序列分析鑒定，重組質(zhì)粒pET28aTB4構(gòu)建成功，IPTG誘導(dǎo)后的融合蛋白His6TB4在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，并經(jīng)一步鎳柱親和層析即獲得純化。CAM試驗(yàn)證明其有促進(jìn)毛細(xì)血管生成的活性。結(jié)論：獲得高效表達(dá)的、高純度的His6TB4融合蛋白，為T(mén)B4的進(jìn)一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定了根底。

【關(guān)鍵詞】人胸腺肽β4表達(dá)鎳柱純化雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)

胸腺肽β4〔thymosinβ4,TB4〕是從胸腺素組分5〔F5〕中別離得到的，是生物體內(nèi)豐度最高且高度保守的一種βthymosin。它不僅存在于胸腺中，還存在機(jī)體眾多組織中，在參與調(diào)節(jié)免疫及細(xì)胞生理活動(dòng)等一系列過(guò)程中呈現(xiàn)功能多樣性，因此引起了研究者的廣泛關(guān)注[12]。TB4是由43個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，相對(duì)分子質(zhì)量約5000，等電點(diǎn)5.1，以前多認(rèn)為其定位于細(xì)胞漿中，目前有報(bào)道說(shuō)它也有細(xì)胞核的定位[3]。最近報(bào)道說(shuō)明，TB4可以促進(jìn)毛細(xì)血管生成和創(chuàng)傷愈合，降低炎癥反響，抑制一些上皮細(xì)胞的凋亡，在醫(yī)學(xué)治療疾病中大有潛力[46]。本研究設(shè)計(jì)并合成TB4的編碼基因，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)它的高效表達(dá)，進(jìn)行別離純化，并進(jìn)行其促毛細(xì)血管生成活性初步鑒定，旨在為今后對(duì)TB4蛋白功能的進(jìn)一步研究和藥物開(kāi)發(fā)打下根底。

1材料和方法

1.1試劑、質(zhì)粒及菌株

pET28a(+)質(zhì)粒、大腸桿菌Top10、BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；PCR試劑、限制性內(nèi)切酶、Klenow酶、T4連接酶等酶類(lèi)購(gòu)自大連TaKaRa公司；IPTG購(gòu)自華美生物工程公司；3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技；MicroBCAKit購(gòu)自PIERCEChemical公司；NiIDA填料由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1TB4目的基因片段的獲得TB4基因序列來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷摹ＴO(shè)計(jì)5個(gè)基因片段，由上海英駿〔Invitrogen〕公司合成。

1.2.1.2TB4基因的拼接將合成的基因片段1〔5′ATGTCTGACAAACCGGACATGGCTGAAATCGAAAAATTCGACAAATCCAAACTGAAG3′〕和基因片段2〔5′TTTGGACGGCAGCGGGTTTTTTTCCTGAGTTTCAGTCTTCTTCAGTTTGGATTT3′〕退火，利用Klenow酶延伸補(bǔ)平；相同的方法將基因片段3〔5′AACCCGCTGCCGTCCAAAGAAACTATCGAACAGGAAAAACAGGCTGGTGAATCCTAG3′〕和基因片段4〔5′GGCGAGCTCTAGGATTCACCAGCCTG3′〕退火補(bǔ)平。兩次退火得到2個(gè)DNA大片段〔A和B〕，將DNA大片段A和B退火延伸即得到TB4基因。

1.2.1.3PCR擴(kuò)增TB4基因以退火得到的TB4基因?yàn)槟０澹蚱?〔5′GGAATTCCATATGGACGACGACGACAAGATGTCTGACAAACCGGAC3′〕和基因片段4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增〔圖1〕。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性40s，58℃復(fù)性40s，72℃延伸40s,循環(huán)28次；末次延伸為72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠純化試劑盒純化。

圖1TB4目的基因合成過(guò)程示意圖

1.2.1.4pET28aTB4重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序鑒定將純化后得到的TB4基因片段用NdeI和SacI雙酶切，用T4連接酶連接于已同樣酶切的pET28a(+)質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，卡那霉素抗性板篩選陽(yáng)性克隆，挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆送上海英駿〔Invitrogen〕公司測(cè)序鑒定。

1.2.2融合蛋白His6TB4在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒pET28aTB4轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，挑單克隆于1L含卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中37℃搖菌培養(yǎng)，當(dāng)其A600到達(dá)0.8時(shí)，參加終濃度為1mmol·L-1IPTG，誘導(dǎo)35h；離心收獲菌體，進(jìn)行SDSPAGE分析。將表達(dá)菌體重懸于60mlBufferB〔0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.01mol·L-1imidazole,pH8.0〕，進(jìn)行超聲破碎細(xì)菌，然后離心取上清，上樣由BufferB平衡過(guò)的NiIDA親和層析柱，再用BufferC〔0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.05mol·L-1imidazole,pH8.0〕洗層析柱去除雜蛋白，最后通過(guò)BufferD〔0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.25mol·L-1imidazole,pH8.0〕洗脫，收集目的蛋白洗脫峰。

1.2.3雞胚尿囊膜血管生成實(shí)驗(yàn)〔choriollantoicmembraneassay，CAM實(shí)驗(yàn)〕

我們用CAM模型檢測(cè)His6TB4對(duì)體內(nèi)血管生成的作用[7８]。取材孵育7d的活受精雞胚，在蛋殼上開(kāi)窗暴露尿囊膜，將滅菌圓形濾紙片〔約7mm2〕放置于尿囊膜毛細(xì)血管新生區(qū)，用微量加樣器將200μg·ml-1過(guò)濾除菌的融合蛋白溶液〔PBS配制〕和PBS緩沖液〔對(duì)照〕各50μl加于濾紙片上，用滅菌的濾紙和膠布封閉窗口，60h后揭開(kāi)濾紙片觀察毛細(xì)血管生長(zhǎng)的情況。

2結(jié)果

2.1TB4基因的克隆和重組

我們按照大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子，人工合成了TB4基因片段，然后拼裝成TB4全基因。經(jīng)電泳鑒定，成功拼裝獲得與預(yù)期長(zhǎng)度大小一致的TB4基因片段,約135bp〔圖2〕。獲得的TB4基因片段經(jīng)過(guò)NdeI和SacI雙酶切，將目的片段插入pET28a(+)質(zhì)粒中，pET28aTB4質(zhì)粒圖譜如圖3。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性克隆，經(jīng)DNA測(cè)序證明目的基因序列完全正確。設(shè)計(jì)的TB4基因全序列如下：5′ATGTCTGACAAACCGGACATGGCTGAAATCGAAAAATTCGACAAATCCAAACTGAAGAAGACTGAAACTCAGGAAAAAAACCCGCTGCCGTCCAAAGAAACTATCGAACAGGAAAAACAGGCTGGTGAATCCTAG3′。

２．２融合蛋白His6TB4的誘導(dǎo)表達(dá)和別離純化

經(jīng)SDSPAGE分析說(shuō)明，重組蛋白在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，其中融合有His6Tag的TB4蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為8000，與理論值相符。由于TB4蛋白N端融合有HisTag，融合蛋白可利用鎳柱親和層析一步純化獲得目的蛋白，純化過(guò)程簡(jiǎn)單、高效。經(jīng)SDSPAGE掃描分析，His6TB4重組蛋白的表達(dá)量約占菌體總蛋白的40%，一步親和層析純化后樣品的純度可到達(dá)93.5%左右，見(jiàn)圖4。

2.3CAM試驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白活性

與對(duì)照相比，TB4對(duì)毛細(xì)血管生成有促進(jìn)作用，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道吻合，如圖5所示。給藥部位較周邊的毛細(xì)血管生成有所促進(jìn)，并且有所增粗，而對(duì)照組的濾紙片及其周邊的毛細(xì)血管生成根本沒(méi)有改變。

圖5重組TB4對(duì)雞胚尿囊膜的促血管生成作用

3討論

胸腺肽是一種應(yīng)用較早的免疫藥物，由于近年來(lái)發(fā)現(xiàn)胸腺肽β家族成員的功能不僅限于與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，而且在免疫、血管生成、神經(jīng)再生、腫瘤浸潤(rùn)、創(chuàng)傷愈合和炎癥反響等多方面均有作用，同時(shí)，也為一些疾病的診斷和治療提供了新的研究思路，從而越來(lái)越多地引起眾多研究者的注意[12，10]。采用基因工程方法生產(chǎn)重組TB4蛋白，可以防止從生物原材料中直接提取率低或直接化學(xué)合成本錢(qián)代價(jià)高等缺點(diǎn)。國(guó)內(nèi)陳妍柯等[11]也曾報(bào)道過(guò)在大腸桿菌中克隆表達(dá)了TB4，其表達(dá)水平占菌體總蛋白的30%，但其純化步驟較為復(fù)雜，分別經(jīng)過(guò)了硫酸銨鹽析、SourceRPC反相層析柱和QSepharoseHP陰離子交換柱來(lái)純化目的蛋白，他們主要側(cè)重于研究TB4的免疫學(xué)活性。本研究中，我們?cè)诖竽c桿菌中高效表達(dá)了His6TB4，表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的40%，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)一步鎳柱親和層析即可獲得別離純化，方法簡(jiǎn)易、獲得的TB4重組蛋白純度為93.5%。CAM實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，我們獲得的His6TB4具有很好的促血管生成的生物活性。我們建立了TB4大腸桿菌基因工程高效表達(dá)菌株，表達(dá)水平高，別離純化工藝簡(jiǎn)便、本錢(qián)低，為以后的TB4作為促進(jìn)血管生成藥物的開(kāi)發(fā)和深入研究奠定了堅(jiān)實(shí)的根底。

【參考文獻(xiàn)】

[1]CHENC,LIM,YANGH,etal.Rolesofthymosinsincancersandotherorgansystems[J].WorldJSurg,2005,29(3):264270.

[2]HUFFT,MULLERCS,OTTOAM,etal.Betathymosins,smallacidicpeptideswithmultiplefunctions[J].IntJBiochemCellBioL,2001,33(3):205220.

[3]HUFFT,ROSORIUSO,OTTOAM,etal.NuclearlocalisationoftheGactinsequesteringpeptidethymosinbeta4[J].JCellSci,2004,117(Pt22):53335341.

[4]BOCKMARQUETTEI,SAXENALA,WHITEMD,etal.Thymosinbeta4activatesintegrinlinkedkinaseandpromotescardiaccellmigration,survivalandcardiacrepair[J].Nature,2004,432(7016):466472．

[5]CHAHJ,JEONQMJ,KLEINMANHK.Roleofthymosinbeta4intumormetastasisandAngiogenesis[J].JNatlCancerInst,2003,95(22):16741680.

[6]PHILPD,GOLDSTEINAL,KLEINMANHK.Thymosinbeta4promotesangiogenesis,woundhealing,andhairfollicledevelopment[J].MechAgeingDev,2004,125(2):113115.

[7]HEHIRKM,BAGUISIA,PENNINGTONSE,etal.Apotentialantitumorpeptidetherapeuticderivedfromantineoplasticurinaryprotein[J].Peptides,2004,25(4):543549.

[8]顏明,華子春.人快速收縮骨骼肌肌鈣蛋白Ⅰ在大腸桿菌中的表達(dá)及建立其快速?gòu)?fù)性方法[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2005,24(1):3638.

[9]KOUTRAFOURIV,LEONDIADISL,AVGOUSTA