基因組學(xué)考試重點(diǎn)1

第一章大規(guī)模基因組測序的原理與方法

1.基因組學(xué)是要揭示下述四種整合體系的相互關(guān)系：

（1）基因組作為信息載體（堿基對、重復(fù)序列的整體守恒與局部不平衡的關(guān)系）

（2）基因組作為遺傳物質(zhì)的整合體（基因作為功能和結(jié)構(gòu)單位與遺傳學(xué)機(jī)制的關(guān)系）

（3）基因組作為生物化學(xué)分子的整合體（基因產(chǎn)物作為功能分子與分子、細(xì)胞機(jī)制的關(guān)

系）

（4）物種進(jìn)化的整合體（物種在地理與大氣環(huán)境中的自然選擇）

2.為什么說基因組學(xué)是一門大科學(xué)？

（1）“界門綱目科屬種”，地球上現(xiàn)存物種近億，所有生生滅滅的生物，無一例外，都

有個(gè)基因組。

（2）基因組作為信息載體，它所儲(chǔ)存的信息是最基本的生物學(xué)信息之一；既是生命本質(zhì)

研究的出發(fā)點(diǎn)之一，又是生物信息的歸宿。

（3）基因組學(xué)研究包括對基因產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄子組和蛋白質(zhì)組）的系統(tǒng)生物學(xué)研究。

（4）基因多態(tài)性的規(guī)模化研究就是基因組多態(tài)性的研究。

（5）基因組學(xué)的研究必然要上升到細(xì)胞機(jī)制、分子機(jī)制和系統(tǒng)生物學(xué)的水平。

（6）基因組的起源與進(jìn)化和物種的起源與進(jìn)化一樣是一個(gè)新的科學(xué)領(lǐng)域。

（7）基因組信息正在以天文數(shù)字計(jì)算，規(guī)?；胤e累，它的深入研究必將形成一個(gè)嶄新

的學(xué)科。

（8）基因組的信息是用來發(fā)現(xiàn)和解釋具有普遍意義的生命現(xiàn)象和它們的變化、內(nèi)在規(guī)律、

和相互關(guān)系。

（9）基因組的信息含量高?；蚪M學(xué)的研究又在于基因組間的比較。

（10）基因組學(xué)的復(fù)雜性必然導(dǎo)致多學(xué)科的引進(jìn)和介入（各生物學(xué)科、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、計(jì)算

機(jī)科學(xué)、化學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)、電子工程學(xué)、考古學(xué)等）。

（11）基因組學(xué)研究的手段和技術(shù)已經(jīng)走在生命科學(xué)研究的最前沿。

（12）基因組信息來自于高效率和規(guī)?；a(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

（13）人類基因組計(jì)劃證明了基因組研究的迫切性和可行性。

3.大規(guī)?；蚪M測序的幾個(gè)支撐技術(shù)是什么？

（1）雙脫氧末端終止法

雙脫氧終止法，即測序法，是根據(jù)在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終

止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A.T、C.G結(jié)束的四組不同長度的一系列

片段，然后在尿素變性的膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得可見的堿基序列。通俗點(diǎn)說，就是

通過電泳的方法將一系列片段從小到大排列起來，由于每條片段末尾都含有熒光標(biāo)記的

堿基，通過放射性自顯影，即可讀出這些堿基的種類，這些堿基的排列順序，就是待測

的序列。

（2）技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（）是體外酶促合成特異片段的一種方法，由變性、低溫退火（復(fù)性）與

適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的得以迅速擴(kuò)增，具有強(qiáng)、靈敏度高、

操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于

疾病的診斷或任何有的地方.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（，簡稱）乂稱無分子克隆或特異性序列

體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。

（3）自動(dòng)測序儀的發(fā)展

序列測定分手工測序和自動(dòng)測序，手工測序包括雙脫氧鏈終止法和化學(xué)降解法。自動(dòng)化測

序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今序列分析的主流。美國公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700

和3100型等測序儀，其中310型是臨床檢測實(shí)驗(yàn)室中使用最多的一種型號(hào)?。本實(shí)驗(yàn)介紹

的是310型測序儀的測序原理和操作規(guī)程。

（4）生物信息學(xué)分析軟件硬件設(shè)備

4.大規(guī)模基因組測序的兩種策略是什么？二者有何區(qū)別？

（1）逐步克隆法（）

（2）全基因組霰彈法（）

（3）二者的策略

比較：

全基因組霰彈法逐步克隆法

項(xiàng)目

需要（需構(gòu)建精確的物理圖

遺傳背景不需要

譜）

速度快慢

費(fèi)用低高

高（以全基因組為單位進(jìn)行拼

計(jì)算機(jī)性能低（以為單位進(jìn)行拼接）

接）

適用范圍工作框架圖精細(xì)圖

代表測序物

果蠅、水稻人、線蟲

種

5.人類基因組計(jì)劃所構(gòu)建的四張圖是什么？

（1）遺傳圖譜：又稱為連鎖圖譜（）,指基因或標(biāo)志在染色體上的相對位置與遺傳距離。

（2）物理圖譜：以定位的標(biāo)記序列如作為路標(biāo)，以實(shí)際長度即、、為圖距的基因組圖譜。

（3）轉(zhuǎn)錄圖譜：利用（表達(dá)序列標(biāo)簽）作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜。

（4）序列圖譜：通過基因組測序得到的，以A.T、G、C為標(biāo)記單位的基因組序列。

6.的定義，原理、要滿足的條件與其來源。

（1）序列標(biāo)記位點(diǎn)（）是一段短的序列，通常長度在100到500,易于識(shí)別，僅存在于待研

究的染色體或基因組中。作一套圖譜需要收集來自單條染色體或一個(gè)完整基因組的重疊的

片段。在圖1中，從單條染色體中制備一組片段，使染色體上每一點(diǎn)平均有5條片段對應(yīng)。

收集作圖必需的數(shù)據(jù)時(shí)，須排列每一，了解哪些片段包含有哪些。這可以通過雜交分析來

完成：但通常使用方法，因?yàn)楦旖?，更易于自?dòng)化，兩個(gè)共存于同一個(gè)片段的機(jī)率依

賴于它們在基因組中的相近程度。如果它們相當(dāng)接近、它們存在于同一片段的機(jī)會(huì)就相當(dāng)

大；而如果它們位置相對分開，有時(shí)它們會(huì)在同一片段上，有時(shí)則不會(huì)（圖1）,因此，這

些資料可用來計(jì)算兩個(gè)標(biāo)記間的距離，其方式與計(jì)算連鎖分析中計(jì)算圖距的方式相同；在

連鎖分析中，兩個(gè)標(biāo)記間的圖距是根據(jù)它們的交換頻率來計(jì)算的。作圖與其相比、不同之

處僅在于兩個(gè)標(biāo)記間的圖距是根據(jù)分離頻率來計(jì)算的。

（2）這些片段覆蓋染色體的全長，染色體上每一點(diǎn)平均有五條片段相對應(yīng)，染色體圖譜

上兩個(gè)接近的標(biāo)記共同存在于一條片段的可能性就高，相隔較遠(yuǎn)的標(biāo)記位于同一條片段

中的可能性就較小。

（3）一個(gè)序列要成為，須滿足兩個(gè)前提。首先它的序列必須是己知的，以便于用方法檢

測在不同片段中存在與否。第二個(gè)要求是必須在待研究的染色體上有唯一的定位，或當(dāng)片

段群覆蓋全基因組時(shí)，在整個(gè)基因組中具有唯一的定位位點(diǎn)。如果序列具有多個(gè)定位點(diǎn)，

那么作圖數(shù)據(jù)將會(huì)模糊不清。因此需要確保不包含重熨的序列。

（4）上述兩個(gè)前提易于滿足，因此可以通過多種途徑獲得，最常見的來源是：

①表達(dá)序列標(biāo)記：表達(dá)序列際記（，E5T）是通過互補(bǔ)?？寺》治霁@得的短序列。制備互

補(bǔ)是將轉(zhuǎn)化成雙鏈.由于細(xì)胞中來自于編碼蛋白的基因，故此代表了來源的細(xì)胞中表達(dá)的

基因序列。被看做獲得重要基因序列的快捷途徑。即使其序列不完整，也仍然有價(jià)值。如

果來自于單一序列，不是基因家族中的某一成員，它也可以被用作。而所謂基因家族是指

一組具有相同或相近序列的基因。

②遺傳標(biāo)記序列：如微衛(wèi)星標(biāo)記。

③隨機(jī)基因組序列可以通過對克隆的基因組的隨機(jī)小片段進(jìn)行測序或在數(shù)據(jù)庫中搜尋貯

存序列獲得。

7、逐步克隆法包括哪幾個(gè)步驟？

（1）物理圖譜的構(gòu)建一一序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖

①確定各序列與其在基因組中的位置；

②大插入片段基因組文庫的構(gòu)建；（文庫的構(gòu)建P25）

③以特定為標(biāo)記篩選并定位克隆；

④含有的克隆在基因組中的排序。

經(jīng)過這幾個(gè)步驟，以定位的標(biāo)記序列（）作為路標(biāo)，以實(shí)際長度即、、為圖距的基因組圖

譜便構(gòu)建完成了。此時(shí)我們?nèi)匀徊恢谰唧w的序列信息。只知道的序列和位置，以與間的

距離。

（2）大片段克隆的篩選（P36；反應(yīng)池方案P27）

該步驟包括克隆的篩選和延伸克隆的篩選。前者可使相互間具有重疊片段的克隆根據(jù)

信息組裝成，并定位與基因組上。后者主要是補(bǔ)充基因組中未被文庫覆蓋的克隆序列，常

用方法有指紋圖譜法和末端序列步行法。經(jīng)過這一步，我們得到了覆蓋整個(gè)基因組全序列

的克隆，以備測序。

（3）霰彈法測序與“工作框架圖”的構(gòu)建

用霰彈法對篩選到的克隆進(jìn)行測序，得到大量隨機(jī)片段。組裝這些片段，可能會(huì)出現(xiàn)如下

問題：低堿基質(zhì)量區(qū)、單鏈區(qū)、序列缺口、未組裝區(qū)。通過重測序等手段對這些區(qū)域進(jìn)行

補(bǔ)充，即所說的，便可得到高質(zhì)量的全序列。

（4）序列的全組裝與“完成圖”構(gòu)建

對測序后的克隆序列進(jìn)行拼接，完成該基因組的序列圖譜。

8、全基因組霰彈法的測序流程？

全基因組霰彈法測序的整個(gè)流程如下圖所示

（1）從頭組裝流程：&454（P31）

（2）流程：454（P31-32）

（3）和基于的組裝

（4）粗測序的預(yù)處理P32

①意義和目的；②流程；③圖像分析和堿基讀出；④質(zhì)量控制

（5）數(shù)據(jù)評價(jià)P33

①質(zhì)量分布；②文庫插入大??；③；④二聚體評價(jià)

（6）用估計(jì)基因組大小

（7）基因組混合拼接驗(yàn)證與結(jié)構(gòu)變異檢測流程

（8）重復(fù)序列注釋流程

（9）基因結(jié)構(gòu)與功能注釋技術(shù)路線（）

9、介紹

（1）定義：就是一個(gè)長度為K的序列，K通常取17。

（2）用途：糾正測序錯(cuò)誤，估計(jì)基因組大小、雜合率、重復(fù)序列的含量。

（3）分布圖，同樣數(shù)據(jù)量的情況下，峰位決定基因組大小，峰位越靠左，基因組越大。

峰值表示大部分都出現(xiàn)在這個(gè)深度。

（4）峰位高低的影響因素-：a、錯(cuò)誤率，錯(cuò)誤率越高，起始峰位越高，主峰相對越低;

b、重復(fù)序列，重復(fù)序列越多，主峰下降越慢。

（5）雜合率越高，則雜合峰越高，雜合峰出現(xiàn)在主峰的一半處，按照雜合峰大小估計(jì)

基因組大小，基因組大小等于二倍雜合峰。

（6）假設(shè)一條長45,17,則每個(gè)產(chǎn)生的數(shù)=45-17+1若測序深度為10X,則實(shí)際覆

蓋深度=10*（45-17+1）/45

（7）基因組大小：若在主峰頂端對應(yīng)的次數(shù)為15,實(shí)際測序量為100G,則基因組大小

=100*（45-17+1）/45/15

（8）不能直接根據(jù)雜合峰和主峰的高度估計(jì)基因組的雜合率大小，只能通過模擬數(shù)據(jù),

再用實(shí)際數(shù)據(jù)與模擬數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，找出最接近的一個(gè)，來推測基因組的雜合率大小。

（9）測序深度越低，雜合峰與主峰越接近y軸，隨著測序深度的增加，會(huì)格雜合峰和

主峰展開，容易看出雜合峰與主峰的關(guān)系。

（10）純下降的圖，原因可以能是數(shù)據(jù)量不夠；若開始下降后來有峰的圖，前面下降的地

方可能是測序錯(cuò)誤。

（11）當(dāng)數(shù)據(jù)量超過最高值（255M）時(shí)，則無峰。

第二章新一代測序技術(shù)

一、第一代測序技術(shù)簡介

※測序法（雙脫氧核糖核甘酸末端終止法）的原理？

法是根據(jù)核甘酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿

基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A.T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核甘酸：然后在尿

素變性的膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得可見的堿基序列。法測序的原理就是，每個(gè)反應(yīng)

含有所有四種脫氧核甘酸三磷酸（）使之?dāng)U增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核昔三磷

酸0使之終止。由于缺乏延伸所需要的3'基團(tuán)，使延長的寡聚核甘酸選擇性地在G、A.T

或C處終止，終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種和的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)

得到一組長幾個(gè)至千以上個(gè)，相差一個(gè)堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止

在不同的的核甘酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后

可用光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。二、第二代測序技術(shù)

1.概述

測序（）作為一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。早在雙螺旋結(jié)構(gòu)

（,1953）被發(fā)現(xiàn)后不久就有人報(bào)道過測序技術(shù)，但是當(dāng)時(shí)的操作流程復(fù)雜，沒能形成

規(guī)模。隨后在1977年發(fā)明了具有里程碑意義的末端終止測序法，同年和發(fā)明了化學(xué)降解

法。法因?yàn)榧群啽阌挚焖伲⒔?jīng)過后續(xù)的不斷改良，成為了迄今為止測序的主流。然而隨

著科學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的測序己經(jīng)不能完全滿足研究的需要，對模式生物進(jìn)行基因組重測

序以與對一些非模式生物的基因組測序，都需要費(fèi)用更低、通量更高、速度更快的測序技

術(shù)，第二代測序技術(shù)（）應(yīng)運(yùn)而生。第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序（）,即

通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括454、和。

這三個(gè)技術(shù)平臺(tái)各有優(yōu)點(diǎn)，454的測序片段比較長，高質(zhì)量的讀長（）能達(dá)到400；測序

性價(jià)比最高，不僅機(jī)器的售價(jià)比其他兩種低，而且運(yùn)行成本也低，在數(shù)據(jù)量兩同的情況

下，成本只有454測序的1/10；測序的準(zhǔn)確度高，原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%,而

在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%,是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。雖

然第二代測序技術(shù)的工作一般都由專業(yè)的商業(yè)公司來完成，但是了解測序原理、操作流程

等會(huì)對后續(xù)的數(shù)據(jù)分析有很重要的作用，下文將以測序?yàn)槔?，簡述第二代測序技術(shù)的

基本原理.、操作流程等方面。

2.基本原理

測序的基本原理是邊合成邊測序。在等測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色

的熒光標(biāo)記四種不同的，當(dāng)聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種就會(huì)釋放出不同的熒光,

根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測的序列信息。

3.操作流程

（1）測序文庫的構(gòu)建（）

首先準(zhǔn)備基因組（雖然測序公司要求樣品量要達(dá)到200,但是系統(tǒng)所需的樣品量可低至

100,能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)中）,然后將隨機(jī)片段化成兒百堿基或更短的小片段，

并在兩頭加上特定的接頭（）o如果是轉(zhuǎn)錄組測序，則文庫的構(gòu)建要相對麻煩些，片段化

之后需反轉(zhuǎn)成，然后加上接頭，或者先將反轉(zhuǎn)成，然后再片段化并加上接頭。片段的大小

（）對于后面的數(shù)據(jù)分析有影響，可根據(jù)需要來選擇。對于基因組測序來說，通常會(huì)選

擇幾種不同的，以便在組裝O的時(shí)候獲得更多的信息。

（2）錨定橋接（）

測序的反應(yīng)在叫做的玻璃管中進(jìn)行，又被細(xì)分成8個(gè)，每個(gè)的內(nèi)表面有無數(shù)的被固定的

單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結(jié)合形

成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。

（3）預(yù)擴(kuò)增（）

添加未標(biāo)記的和普通酶進(jìn)行固相橋式擴(kuò)增，單鏈橋型待測片段被擴(kuò)增成為雙鏈橋型片

段。通過變性，釋放出互補(bǔ)的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環(huán)，將會(huì)在的

固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。

（4）單堿基延伸測序（

在測序的中加入四種熒光標(biāo)記的、聚合酶以與接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)測序簇延

伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的就能釋放出相對應(yīng)的熒光，測序儀通過捕獲熒光

信號(hào)，并通過計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。從熒光

信號(hào)獲取待測片段的序列信息的過程叫做，公司所用的軟件是'so讀長會(huì)受

到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。隨著讀長的增加，錯(cuò)誤率

也會(huì)隨之上升。

（5）數(shù)據(jù)分析（）

這一步嚴(yán)格來講不能算作測序操作流程的一部分，但是只有通過這一步前面的工作才顯

得有意義。測序得到的原始數(shù)據(jù)是長度只有幾十個(gè)堿基的序列，要通過生物信息學(xué)工具將

這些短的序列組裝成長的甚至是整個(gè)基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因

組或者相近物種基因組序列上，并進(jìn)一步分析得到有生物學(xué)意義的結(jié)果。

4.二代測序技術(shù)總結(jié)

（1）需熒光或者化學(xué)放光物質(zhì)；（2）需聚合酶或者連接酶；（3）較昂貴的求劑耗材和

光學(xué)系統(tǒng)；（4）強(qiáng)大的圖像分析計(jì)算能力。

三、454技術(shù)平臺(tái)簡介（焦磷酸測序法）

1.化學(xué)原理

焦磷酸測序是由聚合酶、三磷酸腺甘硫酸化酶（）、熒光素酶（）和雙磷酸酶（）4種酶

催化同一反應(yīng)體系的酶級(jí)朕化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)底物5,-磷酰硫酸（）和熒光素。反應(yīng)體

系還包括待測序單鏈和測序引物。

在每一輪測序反應(yīng)中，加入1種，若該與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并

釋放等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)Oo硫酸化酶催化和形成，后者驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素

向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與量成正比的可見光信號(hào)，并由軟件轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值，其高

度與反應(yīng)中摻入的核甘酸數(shù)目成正比。根據(jù)加入類型和熒光信號(hào)強(qiáng)度就可以實(shí)時(shí)記錄模板

的核甘酸序列。

2.測序技術(shù)流程

（1）文庫構(gòu)建

①基因組片段化（）與評估；

②片段末端平齊化（）：為接頭的添加反應(yīng)做準(zhǔn)備；

③接頭連接：添加接頭A和B。

④文庫固定化：片段通過接頭連接到微珠上。

⑤補(bǔ)充反應(yīng)（）：修補(bǔ)連接到微珠上的片段的鏈缺口。

⑥雙鏈分離，片段以單鏈形式結(jié)合在微珠上。

XP39末端配對文庫制備兩張圖詳細(xì)介紹了文庫構(gòu)建步驟。

（2）文庫模板擴(kuò)增

.......在得到僅有銜接子單鏈的模板后，此模板可與過量不做珠子退火結(jié)合，并被

吸附到一種用于反應(yīng)的有水混合物小滴上，此混合物包含了反應(yīng)所必需的各種試劑，在

合適條件進(jìn)行擴(kuò)增，最后可對結(jié)合的大量鏈的珠子進(jìn)行富集。

（3）測序反應(yīng)

（4）成像：信號(hào)強(qiáng)度圖譜。

（5）測序數(shù)據(jù)的處理

3.454測序技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)

四、測序技術(shù)平臺(tái)（聚合酶合成測序）

1.技術(shù)原理與流程

（1）文庫制備

將基因組打成兒百個(gè)堿基（或更短）的小片段，在片段的兩個(gè)末端加上接頭（）。

（2）產(chǎn)生簇

利用專利的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，片段變成單鏈后通過與芯片表面的引物

堿基互補(bǔ)被一端“固定”在芯片上。另外一端（5'或3'）隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互

補(bǔ)，也被“固定”住，形成“橋（）”。反復(fù)30輪擴(kuò)增，每個(gè)單分子得到了1000倍擴(kuò)增，

成為單克隆簇。簇產(chǎn)生之后，擴(kuò)增子被線性化，測序引物隨后雜交在目標(biāo)區(qū)域一側(cè)的通用

序列上。

（3）測序

系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測序（）的原理。加入改造過的聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的。這

些核苜酸是“可逆終止子”，因?yàn)?,羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循

環(huán)摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上

去的核甘酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核甘酸。

如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信

號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板片段的序列。目前的配對末端讀長可達(dá)到2X50,更長的讀

長也能實(shí)現(xiàn)，但錯(cuò)誤率會(huì)增高。讀長會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記

的不完全切割。

（4）數(shù)據(jù)分析

自動(dòng)瀆取堿基，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)移到自動(dòng)分析通道進(jìn)行二次分析。

2.測序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)P42

3.技術(shù)應(yīng)用

4.測序相關(guān)數(shù)據(jù)處理軟件

五、測序（）

1.工作流程

（1）文庫制備

系統(tǒng)能支持兩種測序模板：片段文庫（）或配對末端文庫（）。使用哪一種文庫取決于你的

應(yīng)用與需要的信息。片段文庫就是將基因組打斷，兩頭加上接頭，制成文庫。如果你想要

做轉(zhuǎn)錄組測序、定量、探索、重測序、3',5'、甲基化分析、測序等，就可以用它。如

果你的應(yīng)用是全基因組測序、分析、結(jié)構(gòu)重排/拷貝數(shù)，則需要用配對末端文庫。配對末

端文庫是將基因組打斷后，與中間接頭連接，再環(huán)化，然后用15酶切，使中間接頭兩端

各有27的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫。

（2）乳液微珠富集

在微反應(yīng)器中加入測序模板、反應(yīng)元件、微珠和引物，進(jìn)行乳液（）。完成之后，變性

模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板經(jīng)過3,修飾，可以與

玻片共價(jià)結(jié)合。看到這里，是不是有一種似曾相識(shí)的感覺呢？那就對了，此步驟與454

的基本相同。不過系統(tǒng)的微珠要小得多，只有1。

乳液最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到

油"基本過程是在反應(yīng)前，將包含所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面,

水溶液瞬間形成無數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的反應(yīng)空間。理

想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)模板和一個(gè)P1磁珠，由于水相中的P2引物和盛珠表面的

P1引物所介導(dǎo)的反應(yīng)，這個(gè)模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增加，反應(yīng)結(jié)束后，P1磁珠表面就

固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源模板擴(kuò)增產(chǎn)物。

（3）微珠沉積

3'修飾的微珠沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、

4個(gè)或8個(gè)測序區(qū)域。系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)

中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。

(4)連接測序

這一步可就是的獨(dú)門秘笈了。它的獨(dú)特之處在于沒有采用慣常的聚合酶，而用了連接

酶。連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)

規(guī)則與單鏈模板鏈配對。探針的5'末端分別標(biāo)記了5.、3.6這4種顏色的熒光染料。探

針3'端1?5位為隨機(jī)堿基，可以是四種堿基中的任何一種堿基，其中第1.2位構(gòu)成的堿

基對是表征探針染料類型的編碼區(qū)，下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)18種堿基對

和4種探針顏色的對應(yīng)關(guān)系，而3?5位的“n”表示隨機(jī)堿基，6?8位的“z”指的是可

以和任何堿基配對的特殊堿基。

單向測序包括五輪測序反應(yīng)，每輪測序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)。第一輪測序的第一次連接

反應(yīng)由連接引物“n”介導(dǎo)，由于每個(gè)磁珠只含有均質(zhì)單鏈模板，所以這次連諼反應(yīng)摻入

一種8堿基熒光探針，測序儀記錄下探針第L2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學(xué)處理斷裂

探針3'端第5.6位堿基間的化學(xué)鍵，并除去6~8位堿基與5'末端熒光基團(tuán)，暴露探針

第5位堿基5,磷酸，為下一次連接反應(yīng)作準(zhǔn)備。因?yàn)榈谝淮芜B接反應(yīng)使合成鏈多了5個(gè)

堿基，所以第二次連接反應(yīng)得到模板上第6.7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應(yīng)

得到的是第11.12位堿基序列的顏色信息……

幾個(gè)循環(huán)之后，引物重置，開始第二輪的測序。由于第二輪連接引物1比第一輪錯(cuò)開一位，

所以第二輪得到以0,1位起始的若干堿基對的顏色信息。五輪測序反應(yīng)反應(yīng)后，按照第0、

1位，第1、2位..?…的順序把對應(yīng)于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0,1,2,

3…”組成的原始顏色序列。

(5)數(shù)據(jù)分析

測序完成后，獲得了由顏色編碼組成的原始序列。理論上來說，按照“雙堿基編碼矩

陣”，只要知道所測序列中任何一個(gè)位置的堿基類型，就可以將原始顏色序列“解碼”成

堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的簡并特性（一種顏色對應(yīng)4種堿

基對），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個(gè)錯(cuò)誤顏色編碼就會(huì)

引起“連鎖解碼錯(cuò)誤"，改變錯(cuò)誤顏色編碼之后的所有堿基。

和其它所有測序儀一樣，測序錯(cuò)誤在所難免，關(guān)鍵是對測序錯(cuò)誤的評價(jià)和后續(xù)處理。由于

系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù)，在測序過程中對每個(gè)堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)

誤，提供內(nèi)在的校對功能。這樣，雙保險(xiǎn)確保了系統(tǒng)原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%,

而在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%,是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高

的。

為避免“連鎖解碼錯(cuò)誤”的發(fā)生，數(shù)據(jù)分析軟件不直接將原始顏色序列解碼成堿基序列，

而是依靠序列進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。序列分析軟件首先杈據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把堿基序列

轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列，然后與原始顏色序列進(jìn)行比較，來獲得原始顏色序列在的位置，

與兩者的匹配性信息。轉(zhuǎn)換而成的顏色編碼序列和原始序列的不完全匹配主要有兩種情況:

“單顏色不匹配”和“兩連續(xù)顏色不匹配”。由于每個(gè)堿基都被獨(dú)立地檢測兩次，且位點(diǎn)

將改變連續(xù)的兩個(gè)顏色編碼，所以一般情況下將單顏色不匹配處理成測序錯(cuò)誤，這樣一

來，分析軟件就完成了該測序錯(cuò)誤的自動(dòng)校正；而連續(xù)兩顏色不匹配也可能是連續(xù)的兩次

測序錯(cuò)誤，分析軟件將綜合考慮該位置顏色序列的一致性與質(zhì)量值來判斷該位點(diǎn)是否為。

2.優(yōu)勢和劣勢

3.測序法的應(yīng)用

（1）測序和重測序

（2）全基因表達(dá)圖譜分析

芯片大概是目前應(yīng)用最廣泛的從全局角度分析基因表達(dá)整體模式的方法。然而，基于雜交

技術(shù)的微陣列技術(shù)只限用于已知序列，無法檢測新的；而且雜交技術(shù)靈敏度有限，難以檢

測低豐度的目標(biāo)（需要更多的樣品量），難以檢測重復(fù)序列；也無法捕捉到目的基因表達(dá)

水平的微小變化而這恰恰是研究在刺激下或環(huán)境變化時(shí)的生物反應(yīng)所必需的。

與芯片技術(shù)相比，基于測序的高靈敏技術(shù)可對單個(gè)細(xì)胞和癌癥樣品中存在的痕量進(jìn)行整

體的全基因組表達(dá)圖譜分析，每次運(yùn)行能定位高達(dá)2億4千萬個(gè)標(biāo)簽（的相對表達(dá)水平可

通過系統(tǒng)產(chǎn)生的序列標(biāo)簽數(shù)目來計(jì)算），可檢測低至每個(gè)細(xì)胞中10-40的總，即使表達(dá)水

平很低，系統(tǒng)也能夠無偏向性地分析樣品中存在的已知和未知，從而定量特定的差異表

達(dá)模式。起始樣品比微陣列技術(shù)要少得多，尤其適用于來源極為有限的生物樣品分析，如

癌癥干細(xì)胞分析其基因和非編碼的表達(dá)圖譜有助于有助于加速發(fā)掘潛在的生物標(biāo)志物，

從而更準(zhǔn)確區(qū)分不同的疾病類型以與識(shí)別疾病易感性，幫助于研究人員更好地了解病變

細(xì)胞的特性。

（3）更多研究

除了單細(xì)胞基因表達(dá)圖譜分析，系統(tǒng)在方面的其他應(yīng)用還包括利用來發(fā)現(xiàn)和篩選小

分子，實(shí)現(xiàn)在無需預(yù)先知道序列信息的情況下高通量發(fā)現(xiàn)新的分子。這個(gè)方案有望顯著地

提高講究人員鑒別小分子的能力，將過去不可能完成的實(shí)驗(yàn)變?yōu)榭赡堋Ｄ壳耙寻l(fā)現(xiàn)的還非

常有限，可在不知道目標(biāo)分子序列的情況下進(jìn)行檢測和定量小的分子，可將樣品制備工

作從常規(guī)方法的四天縮短為僅需一天，是分析在生物樣品中表達(dá)的已知和未知與其它小

分子的有效工具。利用還可以探索和鑒定全轉(zhuǎn)錄本。無可比擬的高通量和測序數(shù)據(jù)的

高精確性使得可以用短序列讀長即可測序整個(gè)轉(zhuǎn)錄組。了解轉(zhuǎn)錄組對有助于解開導(dǎo)致復(fù)雜

疾病的分子通路的秘密。這一系列應(yīng)用補(bǔ)充使研究人員能在單個(gè)超高通量平臺(tái)上開展綜合

的研究。

（4）分析

盡管絕大多數(shù)的人類遺傳信息在所有人中都相同，但是研究人員通常更感興趣的是研究

個(gè)體之間微小的遺傳差異。這種差異包括單堿基變異，以與被稱為結(jié)構(gòu)變異的各種較大片

段序列變異。結(jié)構(gòu)變異包括片段的插入、缺失、倒位和易位，結(jié)構(gòu)變異的片段范圍可從幾

個(gè)堿基對到數(shù)百萬個(gè)堿基對，可能對基因產(chǎn)生重要影響，并導(dǎo)致人類疾病的發(fā)生。流程獲

得的嚴(yán)密的片段范圍，使研究人員可以鑒別出很寬范圍內(nèi)的插入和缺失片段，結(jié)構(gòu)重排

也能很容易鑒別出來。這個(gè)平臺(tái)的超高通量使研究人員可輕而易舉地獲得高度基因組覆蓋

率的數(shù)據(jù)，精確鑒定個(gè)體基因組中存在的數(shù)百萬個(gè)單堿基多態(tài)性，揭示大量此前未知、具

有潛在醫(yī)學(xué)價(jià)值的遺傳變異，從而促進(jìn)我們對正常/疾病狀態(tài)下結(jié)構(gòu)變異的了解，以與在

更高的分辨率下對結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行深入分析，解釋個(gè)體之間的易感性差異和對疾病治療應(yīng)

答的差異，最終實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療。

（5）甲基化分析

甲基化是自然發(fā)生的化學(xué)修飾的一種。已知抑癌基因的失活與序列特定區(qū)域的甲基化有關(guān)。

而去甲基化則可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和表達(dá)模式變化。甲基化區(qū)域可能作為基因在癌癥過

程中的標(biāo)記。研究人員一直致力研究從正常到癌變過程中甲基化模式如何變化的，原癌基

因異常甲基化模式在癌變過程中扮演怎樣的角色。系統(tǒng)運(yùn)行通量非常驚人，很快就可以做

多個(gè)樣本全基因組甲基化模式檢測，使得研究人員可以鑒別基因組中對應(yīng)元件的甲基化

狀態(tài)，從而幫助研究人員檢測甲基化模式是否可以作為癌癥的生物標(biāo)識(shí)，以與更好了解

甲基化在癌變過程中扮演的隹色。

六、文庫構(gòu)建策略比較

1.文庫構(gòu)建

2.文庫構(gòu)建策略

3.文庫測序策略

4.文庫構(gòu)建策略

七、第三代測序技術(shù)展望

1.非光學(xué)顯微鏡成像

2.納米孔技術(shù)

3.半導(dǎo)體技術(shù)

第三章基因轉(zhuǎn)錄組的測定與分析

一、大規(guī)模表達(dá)序列標(biāo)簽（）測定與分析

1.什么是？

（）是從已建好的庫中隨機(jī)取出一個(gè)克隆，從5,末端或3,末端對插入的片段進(jìn)行一

輪單向自動(dòng)測序，所獲得的約60-500的一段序列。

2、的應(yīng)用？

（1）基因識(shí)別

包括：①在同一物種中搜尋基因家族的新成員；②在大同物種間搜尋功能相同的基因；③

已知基因的不同剪切模式的搜尋。

（2）基因圖譜的繪制

（3）基因預(yù)測

（4）的發(fā)現(xiàn)

（5）利用大規(guī)模分析基因表達(dá)水平：①癌癥基因組解析計(jì)劃；②基因表達(dá)系列分析；③

微陣列或基因芯片的研究。

3、幾種大規(guī)模分析基因表達(dá)水平的方法？

（1）技術(shù)流程P2-4

（2）基因表達(dá)系列分析（）技術(shù)流程與分析流程P2-5,6,7.

（3）基因芯片或微陣列技術(shù)流程P2-8

幾種大規(guī)模分析基因表達(dá)水平的方法的比較：

4.數(shù)據(jù)的不足有哪些？P3-1

5.序列測定與分析的技術(shù)路線？

（1）文庫的構(gòu)建：種類、常見問題與其原因。P3-4,5,6.

（2）測序方向的選擇：取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

（3）測序與對測序結(jié)果的前處理.：①去除低質(zhì)量序列；②屏蔽度象序列；③去除鑲嵌克

隆；④去除長度小于100的序列。

（4）文庫質(zhì)量檢驗(yàn)、序列質(zhì)量檢驗(yàn)。

（5）的聚類和拼接：①聚類的目的和作用；②不嚴(yán)格的和嚴(yán)格的聚類，有參照的和無參

照的聚類；③常用的拼接軟件。④拼接：即的連接。利用克隆的信息和5-3,端的信息,

不同的可以連接在一起。常用的拼接工具有，和。

（6）基因注釋與功能分類：①基因注釋流程；②基因功能分類（手工分類、計(jì)算機(jī)批量

處理、基因產(chǎn)物直系同源簇的分析（簡稱，如的代謝途徑分析））。

（7）后續(xù)分析：比較基因組學(xué)分析、基因表達(dá)譜分析、新基因研究、基因可變剪切分析、

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（,,,）O

二、利用新一代測序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究

1.轉(zhuǎn)錄組測序（）

（1）測序?qū)ο螅恨D(zhuǎn)錄組測序一般是對用多聚胸腺口密咤O進(jìn)行親和純化的聚合酶轉(zhuǎn)錄生

成的成熟和進(jìn)行高通量測序。

（2）優(yōu)勢：相對于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺(tái)，轉(zhuǎn)錄組測序無需預(yù)先針對已知序列設(shè)計(jì)探針，即

可對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測，提供更精確的數(shù)字化信號(hào)，更高的檢測通量以

與更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強(qiáng)大工具。

（3）轉(zhuǎn)錄組測序與基因表達(dá)漕的區(qū)別：轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是把等用高通量測序技術(shù)把它

們的序列測出來。全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄

木。反映出它們的表達(dá)水平。基因表達(dá)譜指通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織

的非偏性文庫，大規(guī)模測序，收集序列片段、定性、定量分析其群體組成，從而描繪該特定

細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息，這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因

表達(dá)漕。

2.轉(zhuǎn)錄組的定義和組成P7

3.的生物學(xué)重復(fù)和標(biāo)準(zhǔn)P7

4、的流程？

（1）測序文庫制備

對于實(shí)驗(yàn)，從總到最終的文庫制備完成主要包括以下步驟。首先，用⑴寡聚核甘酸從

總中抽取全部帶（A）尾的，其中的主要部分就是編碼基因所轉(zhuǎn)錄的。將所得隨鞏打斷成片

段，再用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶從片段合成片段。然后，對片段進(jìn)行末端修復(fù)并連接測序接

頭（），得到將用于測序的。在以上過程，將隨機(jī)片段化和采用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，都

是為了使所得片段較均勻地取自各個(gè)轉(zhuǎn)錄本。為提高測序效率，一般還需要用電泳切膠法

獲取長度范圍在200（±25）的片段，再通過擴(kuò)增，得到最終的文庫。

在上述文庫制備過程中，如果不是只抽取帶（A）尾的，而是使用全部的，則測得的就是細(xì)

胞中的全部轉(zhuǎn)錄本；如果把帶（A）尾的過濾掉，也可以得到非編碼的轉(zhuǎn)錄本；如果從總中

只提取長度為2廣23個(gè)堿基左右的，則得到全部的（）轉(zhuǎn)錄本，相應(yīng)的方法也稱作。

樣品制備最終得到的是雙鏈文庫。在后續(xù)測序中，測得的每個(gè)讀段（）隨機(jī)地來自雙鏈的

某一條鏈，從讀段序列本身無法得知它是與方向相同還是倒轉(zhuǎn)互補(bǔ)，在后續(xù)的讀段定位

時(shí)需要兩個(gè)方向都考慮。在新基因識(shí)別等應(yīng)用中，轉(zhuǎn)錄本的方向?qū)蜃⑨層葹橹匾?，?/p>

要在文庫制備和測序中保留的方向信息。最近有文獻(xiàn)報(bào)道了保留方向信息的樣品制備方法。

（2）測序平臺(tái)數(shù)據(jù)輸出

將測序文庫加入流動(dòng)槽（）中的各通道（），在橋式擴(kuò)增后，就可以進(jìn)行測序了。測序

過程中，計(jì)算機(jī)軟件同步地對熒光圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過分析熒光信號(hào)來確定被測堿

基，并給出質(zhì)量評分。按照圖像上的位置坐標(biāo)，計(jì)算機(jī)程序?qū)⑼晃恢脺y得的藏基根據(jù)測

序順序連成讀段Oo由于熒光圖像文件所占有的磁盤空間很大，通常平臺(tái)一次實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

就產(chǎn)生上太字節(jié)（）的圖像文件，所以一般情況下不予保留原始的熒光圖像數(shù)據(jù)，而是只

保留程序讀出的讀段數(shù)據(jù)與對應(yīng)的質(zhì)量分值，這就是多數(shù)實(shí)驗(yàn)室委托測序中心進(jìn)行測序

后得到的最原始的數(shù)據(jù)。

（3）數(shù)據(jù)的基本處理

①讀段定位：獲得的原始數(shù)據(jù)后，首先需要將所有測序讀段通過序列映射（）定位到參考

基因組上，這是所有后續(xù)處理和分析的基礎(chǔ)。在讀段定位之前，有時(shí)還需要根據(jù)測序數(shù)據(jù)

情況對其做某些基本的預(yù)處理。例如，過濾掉測序質(zhì)量較差的讀段，對測序讀段數(shù)據(jù)去除

接頭序列等。

②基因表達(dá)水平估計(jì)：

測序數(shù)據(jù)是對提取出的轉(zhuǎn)錄本中隨機(jī)進(jìn)行的短片段測序，如果一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的豐度高，則

測序后定位到其對應(yīng)的基因組區(qū)域的讀段也就多，可以通過對定位到基因外顯子區(qū)的讀

段計(jì)數(shù)來估計(jì)基因表達(dá)水平。很顯然，讀段計(jì)數(shù)除了與基因真實(shí)表達(dá)水平成正比，還與基

因長度成正比，同時(shí)也與測序深度即測序?qū)嶒?yàn)中得到的總讀段數(shù)正相關(guān)。

造成瀆段分布出現(xiàn)偏好的原因可能有多個(gè)方面：在制備文庫時(shí);反轉(zhuǎn)錄所采用的隨機(jī)引

物對序列具有一定的偏好性，使得片段不能夠完全均勻地取自各轉(zhuǎn)錄本；在擴(kuò)增中，擴(kuò)增

效率與序列的含量等特征相關(guān)，可導(dǎo)致含量高的片段在文庫中拷貝數(shù)增加超過其他片段;

舍棄多定位的讀段也可能導(dǎo)致讀段的非均勻分布；等等。如果能對讀段分布的不均勻性進(jìn)

行建模并加以校正，可以提高推斷基因表達(dá)量的準(zhǔn)確度。

③選擇性剪接事件識(shí)別和剪接異構(gòu)體表達(dá)水平推斷：在真核生物中，選擇性剪接現(xiàn)象普

遍存在。基因轉(zhuǎn)錄形成的前體()在剪接過程中因去掉不同的內(nèi)含子區(qū)域或保留不同的外

顯子區(qū)域，可形成不同的剪接異構(gòu)體。根據(jù)原理，只要測序深度足夠深，就能檢測到所有

轉(zhuǎn)錄本的全部序列，包括來自剪接接合區(qū)的序列。利用考慮到接合區(qū)的讀段

定位方法，就有可能系統(tǒng)地研究某一組織或某一條件下的基因選擇性剪接事件。

④新基因的檢測：在對數(shù)據(jù)的分析中，人們發(fā)現(xiàn)往往不是所有讀段都能定位到已有注釋的

基因區(qū)，說明除了轉(zhuǎn)錄噪聲或測序錯(cuò)誤等的影響外，可能還存在尚未被注釋的基因。這里,

我們把這種尚未注釋的基因稱為新基因，包括新的蛋白質(zhì)編碼基因和非編碼基因。能檢測

新基因，尤其是低表達(dá)基因是技術(shù)優(yōu)于基因芯片的特點(diǎn)之一，因?yàn)樗恍枰眉褐?/p>

因注釋來設(shè)計(jì)檢測探針。

⑤讀段的可視化與注釋

5.非編碼注釋的步驟？P10

6.技術(shù)同基因芯片技術(shù)的比較

7、的優(yōu)勢

8、的挑戰(zhàn)

9、的應(yīng)用P21

三、9功能研究

1.數(shù)據(jù)的注釋

2.基因表達(dá)譜的分析

3.內(nèi)含子區(qū)域表達(dá)的分析

4.基因間區(qū)域表達(dá)的分析

5.基因可變剪切的分析

6.反義轉(zhuǎn)錄木的分析

7、差異表達(dá)基因的分析

附：測序原理

（1）測序技術(shù)應(yīng)用獨(dú)特工藝生成高密度、海量平行測序反應(yīng)，可對每個(gè)流動(dòng)槽

中成百至上千萬的模板進(jìn)行單端或?qū)ψx溫暖序。全自動(dòng)的簇，每個(gè)簇含

有單個(gè)模板分子的500-1000克隆拷貝。通過儀器在流動(dòng)槽表面對生成的

高密度序列模板進(jìn)行測序。采用專有的熒光標(biāo)記的可逆終止子核甘酸，可

對樣本邊合成邊測序。對讀測序時(shí)，完成首次讀取后，簇進(jìn)行原位改良，

再生成對讀所用模板。然后應(yīng)用第二個(gè)測序引物對同一簇測序，生成第二

次數(shù)據(jù)

（2）為什么要研究表觀遺傳學(xué)？

答：

表觀遺傳學(xué)主要通過的甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼調(diào)控等方式

控制基因表達(dá)。表觀遺傳學(xué)是近幾年興起的而且發(fā)展迅速的一個(gè)研究遺傳的分支

學(xué)科，其研究和應(yīng)用不僅對基因表達(dá)、調(diào)控、遺傳有重要作用，而且在腫瘤、免

疫等許多疾病的發(fā)生和防治以與干細(xì)胞定向分化研究、基因芯片中亦具有十分重

要的意義。表觀遺傳學(xué)補(bǔ)充了“中心法則”忽略的兩個(gè)問題，即哪些因素決定了

基因的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯以與核酸并不是存儲(chǔ)遺傳信息的唯一載體；在分子水平上,

表觀遺傳學(xué)解釋了序列所不能解釋的諸多奇怪的現(xiàn)象。如：同一等位基因可因親

源性別不同而產(chǎn)生不同的基因印記疾病，疾病嚴(yán)重程度也可因親源性別而異。表

觀遺傳學(xué)信息還可直接與藥物、飲食、生活習(xí)慣和環(huán)境因素等聯(lián)系起來，營養(yǎng)狀

態(tài)能夠通過改變表觀遺傳以導(dǎo)致癌癥發(fā)生，尤其是維生素和必需氨基酸。

此外，表觀遺傳學(xué)信息的改變，對包括人體在內(nèi)的哺乳動(dòng)物基因組有廣泛而重要

的效應(yīng)，如轉(zhuǎn)錄抑制、基因組印記、細(xì)胞凋亡、染色體滅活等。甲基化模式的改

變，尤其是某些抑癌基因局部甲基化水平的異常增加，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程

中起到了不容忽視的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞存在廣泛的低甲基化和局部區(qū)域

的高甲基化共存現(xiàn)象，以與總的甲基化能力增高，這3個(gè)特征各以不同的機(jī)制共

同參與甲基化在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。如胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、胰

腺癌等眾多惡性腫瘤都不同程度地存在一個(gè)或多個(gè)腫瘤抑制基因島甲基化。而表

觀遺傳學(xué)改變在本質(zhì)上的可逆性，又為腫瘤的防治提供了新的策略。所以，隨著

表觀遺傳學(xué)研究的深入，肯定會(huì)對人類生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生以與遺傳病的發(fā)病機(jī)

制與其防治做出新的貢獻(xiàn)，也必將在其他領(lǐng)域中展示其不可估量的作用和廣闊的

前景。

（2）表觀遺傳學(xué)涉與到哪些方面？

答：

表觀遺傳學(xué)的研究內(nèi)容主要包括：甲基化、組蛋白的末端修飾和變異體、I高敏

感位點(diǎn)、非編碼、轉(zhuǎn)錄因子與其輔助因子、順式調(diào)控元件和基因組印記等。

（3）什么因素會(huì)影響基因表達(dá)水平？

答：

基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控（甲基化，基因印記，組蛋白共價(jià)修飾，染色質(zhì)重塑）

基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控（基因組中非編碼，微?。ǎ?，反義、內(nèi)含子、核糖開關(guān)等）

1.轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：包括轉(zhuǎn)錄成時(shí)的是否轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄頻率的調(diào)控，的序列決定

了的空間構(gòu)型，的空間構(gòu)型決定了轉(zhuǎn)錄因子是否可以順利的結(jié)合到的調(diào)控序列上,

比如結(jié)合到等序列上。

2.翻譯水平的調(diào)控：翻譯水平的調(diào)控又可以分成翻譯前的調(diào)控和翻譯后的調(diào)控。

a、翻譯前的調(diào)控主要是編輯修飾。

b、翻譯后調(diào)控主要是蛋白的修飾，蛋白修飾后可以成為有功能的蛋白或者有隱藏

功能的蛋白。

在真核和原核細(xì)胞中，從基因表達(dá)到蛋白質(zhì)合成，其間有許多地方受到調(diào)控，這

些調(diào)控點(diǎn)主要可以分成兩個(gè)部分：轉(zhuǎn)錄調(diào)控（）和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（）。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是指

以為模板合成的調(diào)控，所有的細(xì)胞都具有大量序列特異的結(jié)合蛋白，這些蛋白能

準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合到特異的序列，在轉(zhuǎn)錄水平上起著開關(guān)的作用。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是

指在轉(zhuǎn)錄后對基因表達(dá)的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控主要包括：

①加工調(diào)控，它僅在真核細(xì)胞中發(fā)生，由它控制初級(jí)轉(zhuǎn)錄物如何與何時(shí)進(jìn)行剪接

形成可用的，例如，在不同類型的細(xì)胞中從同一基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物可以通過選擇

內(nèi)含子來產(chǎn)生不同的；

②翻譯調(diào)控，通過翻譯調(diào)控確立哪些翻譯成蛋白質(zhì)與什么時(shí)候翻譯，例如通過特

異的結(jié)合蛋白可以抑制翻譯，或者通過位于末端的特異核甘酸序列加速核糖體的

結(jié)合，從而促進(jìn)翻譯；

③降解調(diào)控，這可影響到某些種類的穩(wěn)定性；

④蛋白質(zhì)活性調(diào)控，可選擇性地使某些特異的蛋白分子激活、失活、修改、或區(qū)

域化，從而影響到蛋白質(zhì)怎樣或何時(shí)起作用，例如，某些蛋白質(zhì)只在某個(gè)特殊的

發(fā)育階段的某些細(xì)胞中起作用，而這些蛋白質(zhì)對其它的細(xì)胞有很大的影響，因而

在這些細(xì)胞中必須將其失活或激活后立即將其定位到特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，否則就

會(huì)引起不正常的發(fā)育。

（4）有哪些研究方法？它們各有什么特點(diǎn)？

I

&

?染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（）

?真核生物的基因組以染色質(zhì)的形式存在。因此，研究蛋白質(zhì)與在染色質(zhì)環(huán)境

下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技

術(shù)（，）是目前唯一研究體內(nèi)與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是

在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)一復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的

染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白

結(jié)合的片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與相互作用的

信息。不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的

各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且，與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用

范圍：與基因芯片相結(jié)合建立的方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通

量篩選；與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)；用于研

究在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見，隨著的進(jìn)一步完善，它必將會(huì)在基

因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用

?染色體構(gòu)象捕捉技術(shù)（30,首先將標(biāo)本用甲醛處理，使染色體交互的部分

緊密的連接在一起，然后用特殊的方法是交聯(lián)的兩段序列形成環(huán)狀，最后用

定量或者芯片檢測某兩段序列發(fā)生交聯(lián)的頻率。

?甲基化特異性（）原理是一種簡單、特異、敏感的檢測單基因甲基化的方式。

其基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因組，未甲基化的胞口密咤變成尿口密咤，而

甲基化的胞喀咤不變，然后用3對特異性引物對所測基因的同一核甘酸序列

進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結(jié)果。

?凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（）是一種研究結(jié)合蛋白和其相關(guān)的結(jié)合序列

相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究結(jié)合蛋白，

目前已用于研究結(jié)合蛋白和特定的序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細(xì)

胞粗提液和32p同位素標(biāo)記的或探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳

上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。復(fù)合物或復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。

同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測

如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞

抽提液。在檢測結(jié)合蛋白時(shí).，依據(jù)目的結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純

化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競爭實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的

或片段和寡核甘酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定

或結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的

特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。

熒光原位雜交0：,以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法,

探針首先與某種介導(dǎo)分子.）結(jié)合,雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染

料的基本原理是將（或）探針用特殊的核甘酸分子標(biāo)記,然后將探針直接雜交到染

色體或纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合

來檢測序列在染色體或纖維切片上的定性、定位、相對定量分析具有安全、快速、

靈敏度高、探針能長期保存、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)，不但能顯示中期分裂相,

還能顯示于間期核.同時(shí)在熒光原位雜交基礎(chǔ)上乂發(fā)展了多彩色熒光原位雜交技

術(shù)和染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術(shù).

肖景發(fā)：

簡述藥物基因組學(xué)的定義以與生物信息學(xué)在藥物發(fā)現(xiàn)過程中的主要應(yīng)用。

答：藥物基因?qū)W（1）:是研究遺傳因素對藥物效應(yīng)的影響，確定藥物作用的靶點(diǎn)，

即從表型至基因型的藥物反應(yīng)的個(gè)體多樣性的研究。它將基因的多態(tài)性與藥物效

應(yīng)個(gè)體多樣性緊密聯(lián)系在一起。通過它的研究，將更科學(xué)地評價(jià)各種藥物的療效

和毒性，同時(shí)也對不同患者根據(jù)多態(tài)性的差別選擇高效和低毒的藥物加以治療。

藥物基因?qū)W（2）：綜合藥理學(xué)和遺傳學(xué)、研究個(gè)體基因遺傳因素如何影響機(jī)體對

藥物反應(yīng)的交叉學(xué)科。主要研究基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性與不同藥物反應(yīng)之間關(guān)系，解釋

由于個(gè)體之間差異所表現(xiàn)出藥物的不同治療效果，趨向于用藥個(gè)性化,用藥個(gè)性

化將產(chǎn)生最大的效果和安全性。

生物信息學(xué)在藥物發(fā)現(xiàn)過程中的主要應(yīng)用：

1.答：主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

2.靶點(diǎn)的確定；

生物信息學(xué)可以幫助人們在藥物開發(fā)過程中更早、更快地找到更佳的藥物作用靶

點(diǎn)減少研發(fā)時(shí)間和所需臨床試驗(yàn)的數(shù)量（如抗生素類藥物理想的作用靶點(diǎn)應(yīng)具有

為病原體所特有、在病原體中高度保守在人體中不存在等特點(diǎn)）生物信息學(xué)技

術(shù)就可以通過將病原體基因或基因序列與人類基因與其基因序列進(jìn)行比較分析

篩選出該類藥物理想的作用靶點(diǎn)。

3.靶點(diǎn)的選擇;

?通過生物信息學(xué)的幫助能更好地在靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的早期階段進(jìn)行位點(diǎn)的篩選和確

定。除此之外它還在以下三個(gè)方面有助于對靶點(diǎn)的選擇：

?對靶點(diǎn)的定性如蛋白質(zhì)家族的分類和亞類；

?對靶點(diǎn)的功能等特性的理解如靶點(diǎn)在更大的生化或細(xì)胞環(huán)境中的生物學(xué)行為;

?對靶點(diǎn)的利用與其對有關(guān)內(nèi)容的研究（如預(yù)測針對靶點(diǎn)的藥物在病人體內(nèi)的

攝取或重復(fù)攝取解毒與其以此基因?yàn)榛A(chǔ)的變異）；

4.表達(dá)序列標(biāo)簽；

5.表達(dá)序列標(biāo)簽來自隨機(jī)選取的克隆的末端序列，簡單地說，一個(gè)就是對應(yīng)

于某一種的一個(gè)克隆的一段序列，一般長度大于15的在同源查找和基因作

圖中的作用較大。

6.基因組序列；

生物信息學(xué)在作圖和序列數(shù)據(jù)處理方面為破譯人類基因組的全部10萬個(gè)左右基

因提供了主要的支持。

7.基因多態(tài)性；

作為基因組的標(biāo)志之一與疾病和藥效的變化有很大關(guān)系。在人類基因組中估計(jì)有

300到1000萬個(gè)。對于如此巨大的數(shù)目的只有將生物信息學(xué)手段和計(jì)算機(jī)自動(dòng)識(shí)

別方法相結(jié)合并充分利用信息數(shù)據(jù)庫才能簡便有效價(jià)廉地發(fā)掘出具有應(yīng)用價(jià)值

的。

6.基因表達(dá)；

基因表達(dá)的組織定位是靶點(diǎn)確立中十分重要的一個(gè)方面。基因組研究的啟動(dòng)提供

了大量的可作為研究目標(biāo)的藥物潛在作用靶點(diǎn)，而了解基因在何時(shí)何處表達(dá)對認(rèn)

識(shí)基因的功能將有十分重要的意義。生物信息學(xué)對這個(gè)問題的首要貢獻(xiàn)就是能對

源于不同文庫的進(jìn)行計(jì)數(shù)，這有利于發(fā)現(xiàn)那些只限于在某些特定的組織中大量表

達(dá)的基因。

綜上所述，生物信息學(xué)在基因研究和藥物開發(fā)中發(fā)揮著越來越重要的作用。而生

物信息學(xué)面臨的挑戰(zhàn)是建立更大規(guī)模的能夠綜合多來源知識(shí)和信息、包含多種不

同的混雜數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，以便將生物學(xué)、化學(xué)、臨床等不同領(lǐng)域的數(shù)據(jù)資

料聯(lián)系在一起并建立通用的智能型工具。目前生物信息學(xué)在融合不同的數(shù)據(jù)庫管

理系統(tǒng)圖表和數(shù)據(jù)模型等方面所遇到的困難也反映了藥物開發(fā)本身在融合所涉與

領(lǐng)域的各種信息和觀點(diǎn)方面所面臨的潛在的挑戰(zhàn)。

（補(bǔ)充）藥物基因組學(xué)在個(gè)體化給藥中的應(yīng)用與意義

藥物基因組學(xué)從基因水平給出了遺傳因素（基因變異）與藥物效應(yīng)之間的關(guān)系，基

因的變異與藥物效應(yīng)的差異具有相關(guān)性?；颊邔δ承┧幬锏姆磻?yīng)率與其基因亞型

之間關(guān)系現(xiàn)己揭示,雖然藥物基因組學(xué)并不能改善藥物的效應(yīng)，但這種關(guān)系能輔助

臨床人員在預(yù)測某一特定藥物時(shí),患者屬何種反應(yīng)人群，使醫(yī)生為患者選擇療效最

佳的藥物和確定最佳劑量成為可能。通過對病人的基因檢測,再開出“基因合適”

的藥方即“基因處方”。這種最恰當(dāng)?shù)乃幏?，可使病人得到最佳的治療效果，?/p>

而達(dá)到真正“用藥個(gè)體化”的目的。目前，已有將藥物基因組學(xué)知識(shí)應(yīng)用于高血壓、

哮喘、高血脂、內(nèi)分泌、腫瘤等藥物治療中的成功病例。藥物基因組學(xué)應(yīng)用到臨

床合理用藥中，彌補(bǔ)了只根據(jù)血藥濃度進(jìn)行個(gè)體化給藥的不足，為以前無法解釋

的藥效學(xué)現(xiàn)象找到了答案，為臨床個(gè)體化給藥開辟了一個(gè)新的途徑。

簡述動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法與應(yīng)用

答：動(dòng)態(tài)規(guī)劃是一種算法設(shè)計(jì)方法，它通過組合子問題的解而解決整個(gè)問題，但

它避免了相同問題的重復(fù)計(jì)算，動(dòng)態(tài)規(guī)劃通常應(yīng)用于最優(yōu)化問題，能用動(dòng)態(tài)規(guī)劃

算法求解的問題通常有兩個(gè)很鮮明的特征：最優(yōu)子結(jié)構(gòu)和子問題重疊；所謂的最

優(yōu)子結(jié)構(gòu)問題是指原問題的最優(yōu)解包含了其子問題的最優(yōu)解。問題的最優(yōu)子結(jié)構(gòu)

性質(zhì)提供了該問題可用動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法求解的重要線索。運(yùn)用動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法的最大

難點(diǎn)在于子問題的分解，也即是遞推式的獲得，一旦得到了該問題的遞推式，問

題就相當(dāng)于己經(jīng)解決了，因?yàn)楦鶕?jù)遞推式來寫程序?qū)崿F(xiàn)是一件很容易的事情。

動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法的設(shè)計(jì)通常分為如下步驟：

1.將問題分解成一些規(guī)模更小的子問題，根據(jù)子問題與原問題的關(guān)系描述最優(yōu)解

的結(jié)構(gòu)

2.根據(jù)該關(guān)系遞歸定義最優(yōu)解的值，并運(yùn)用反證法證明該方案的正確性。

3.按自底向上的方式計(jì)算最優(yōu)解的值，在計(jì)算過程中，保存已解決的子問題的答

案。每個(gè)子問題只計(jì)算一次，而在后面需要的時(shí)候只要簡單查一下，從而避免大

量的重復(fù)計(jì)算，最終得到多項(xiàng)式時(shí)間的算法

4.由計(jì)算出的結(jié)果構(gòu)造一個(gè)最優(yōu)解

典型應(yīng)用：

a.序列比對，包括和蛋白質(zhì)序列的比對，全局優(yōu)化比對算法算法和局部比對算

法算法等均是基于此方法。

b.二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測，此算法的依據(jù)是使一段序列形成的，配對數(shù)最大。

c.最長公共子序列。

的基因組學(xué)研究技術(shù)與應(yīng)用

（）是一類廣泛存在于生物體中的非編碼、小分子、單鏈，大約含有18-25,能夠

結(jié)合在靶基因3'區(qū)，通過降解、影響的穩(wěn)定性或抑制蛋白合成，在轉(zhuǎn)錄后水平

上調(diào)控靶基因的表達(dá).

的作用機(jī)制

1.翻譯起始抑制機(jī)制

目前主要有3種觀點(diǎn)：

可能通過抑制全能性核糖體的組裝而阻斷翻譯起始。

抑制要求靶m7G帽子的存在，認(rèn)為可能抑制翻譯起始復(fù)合物的形成

還可能通過阻止結(jié)合蛋白（），與結(jié)合影響翻譯起始.

2.翻譯起始后抑制

?可能引起新生多肽鏈的翻譯同步降解。

?在翻譯延伸過程中，引發(fā)大量的核糖體脫落與高頻次的翻譯提前終止。

3.介導(dǎo)降解

-蛋白定位于細(xì)胞中降解的顆粒（），如P小體（）中，這些顆粒中包含常規(guī)的

降解酶，如脫腺喋吟酶、脫帽酶、核酸外切酶等，提示這些降解酶可能參與介導(dǎo)

的的降解.

4.顆?？垩骸⒔到饣騼?chǔ)存靶？

?胞漿的顆粒，如P小體和（）顆粒，在轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控中具有重要

的作用，它們是細(xì)胞儲(chǔ)存處于翻譯抑制狀態(tài)的場所。

5.正調(diào)控和去抑制

?在靜態(tài)細(xì)胞中（GO期），活化翻譯和上調(diào)基因表達(dá)，而在其他細(xì)胞循環(huán)/增殖期

則繼續(xù)發(fā)揮抑制作用。

?在一些條件下10a也正調(diào)控基因表達(dá)。

一結(jié)合在5'。

?的抑制作用是可逆的。

?逃避抑制。

-3,保守性縮短

在腫瘤治療中的作用

-相關(guān)的腫瘤發(fā)生通常是由于某些特定的低表達(dá)或者不表達(dá)，或者某些特定

的高表達(dá)。

?在抗病毒治療中的應(yīng)用潛力

-與靶序列不完全互補(bǔ)時(shí)也可通過抑制蛋白翻譯起到基因沉默的作用，所以

當(dāng)病毒出現(xiàn)變異時(shí)也可以干擾病毒的復(fù)制。

在抗病毒治療中的應(yīng)用潛力

（3）-與靶序列不完全互補(bǔ)時(shí)也可通過抑制蛋白翻譯起到基因沉默的作用，

所以當(dāng)病毒出現(xiàn)變異時(shí)也可以干擾病毒的復(fù)制。

（4）為什么要研究表觀遺傳學(xué)？

答：

表觀遺傳學(xué)主要通過的甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼調(diào)控等方式

控制基因表達(dá)。表觀遺傳學(xué)是近幾年興起的而且發(fā)展迅速的一個(gè)研究遺傳的分支

學(xué)科，其研究和應(yīng)用不僅對基因表達(dá)、調(diào)控、遺傳有重要作用，而且在腫瘤、免

疫等許多疾病的發(fā)生和防治以與干細(xì)胞定向分化研究、基因芯片中亦具有十分重

要的意義。表觀遺傳學(xué)補(bǔ)充了“中心法則”忽略的兩個(gè)問題，即哪些因素決定了

基因的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯以與核酸并不是存儲(chǔ)遺傳信息的唯一載體；在分子水平上,

表觀遺傳學(xué)解釋了序列所不能解釋的諸多奇怪的現(xiàn)象。如：同一等位基因可因親

源性別不同而產(chǎn)生不同的基因印記疾病，疾病嚴(yán)重程度也可因親源性別而異。表

觀遺傳學(xué)信息還可直接與藥物、飲食、生活習(xí)慣和環(huán)境因素等聯(lián)系起來，營養(yǎng)狀

態(tài)能夠通過改變表觀遺傳以導(dǎo)致癌癥發(fā)生，尤其是維生素和必需氨基酸。

此外，表觀遺傳學(xué)信息的改變，對包括人體在內(nèi)的哺乳動(dòng)物基因組有：泛而重要

的效應(yīng)，如轉(zhuǎn)錄抑制、基因組印記、細(xì)胞凋亡、染色體滅活等。甲基化模式的改

變，尤其是某些抑癌基因局部甲基化水平的異常增加，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程

中起到了不容忽視的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞存在廣泛的低甲基化和局部區(qū)域

的高甲基化共存現(xiàn)象，以與總的甲基化能力增高，這3個(gè)特征各以不同的機(jī)制共

同參與甲基化在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。如胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、胰

腺癌等眾多惡性腫瘤都不同程度地存在一個(gè)或多個(gè)腫瘤抑制基因島甲基化。而表

觀遺傳學(xué)改變在本質(zhì)上的可逆性，又為腫瘤的防治提供了新的策略。所以，隨著

表觀遺傳學(xué)研究的深入，肯定會(huì)對人類生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生以與遺傳病的發(fā)病機(jī)

制與其防治做出新的貢獻(xiàn)，也必將在其他領(lǐng)域中展示其不可估量的作用和廣闊的

前景。

（2）表觀遺傳學(xué)涉與到哪些方面？

答：

表觀遺傳學(xué)的研究內(nèi)容主要包括：甲基化、組蛋白的末端修飾和變異體、I高敏

感位點(diǎn)、非編碼、轉(zhuǎn)錄因子與其輔助因子、順式調(diào)控元件和基因組印記等。

（3）什么因素會(huì)影響基因表達(dá)水平？

答：

基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控（甲基化，基因印記，組蛋白共價(jià)修飾，染色質(zhì)重塑）

基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控（基因組中非編碼，微?。ǎ?，反義、內(nèi)含子、核糖開關(guān)等）

1.轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：包括轉(zhuǎn)錄成時(shí)的是否轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄頻率的調(diào)控，的序列決定

了的空間構(gòu)型，的空間構(gòu)型決定了轉(zhuǎn)錄因子是否可以順利的結(jié)合到的調(diào)控序列上,

比如結(jié)合到等序列上。

2.翻譯水平的調(diào)控：翻譯水平的調(diào)控乂可以分成翻譯前的調(diào)控和翻譯后的調(diào)控。

a、翻譯前的調(diào)控主要是編輯修飾。

b、翻譯后調(diào)控主要是蛋白的修飾，蛋白修飾后可以成為有功能的蛋白或者有隱藏

功能的蛋白。

在真核和原核細(xì)胞中，從基因表達(dá)到蛋白質(zhì)合成，其間有許多地方受到調(diào)控，這

些調(diào)控點(diǎn)主要可以分成兩個(gè)部分：轉(zhuǎn)錄調(diào)控（）和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（）。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是指

以為模板合成的調(diào)控，所有的細(xì)胞都具有大量序列特異的結(jié)合蛋白，這些蛋白能

準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合到特異的序列，在轉(zhuǎn)錄水平上起著開關(guān)的作用。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是

指在轉(zhuǎn)錄后對基因表達(dá)的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控主要包括：

①加工調(diào)控，它僅在真核細(xì)胞中發(fā)生，由它控制初級(jí)轉(zhuǎn)錄物如何與何時(shí)進(jìn)行剪接

形成可用的，例如，在不同類型的細(xì)胞中從同一基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物可以通過選擇

內(nèi)含子來產(chǎn)生不同的；

②翻譯調(diào)控，通過翻譯調(diào)控確立哪些翻譯成蛋白質(zhì)與什么時(shí)候翻譯，例如通過特

異的結(jié)合蛋白可以抑制翻譯，或者通過位于末端的