H7N9亞型禽流感病毒血凝素特異性單克隆抗體的制備與鑒定：技術(shù)、特性與應(yīng)用探索

H7N9亞型禽流感病毒血凝素特異性單克隆抗體的制備與鑒定：技術(shù)、特性與應(yīng)用探索一、引言1.1H7N9亞型禽流感病毒的研究背景禽流感（AvianInfluenza，AI）是由禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus，AIV）引起的一種禽類烈性傳染病，根據(jù)其致病性可分為高致病性禽流感（HighlyPathogenicAvianInfluenza，HPAI）和低致病性禽流感（LowPathogenicAvianInfluenza，LPAI）。自1878年意大利首次報(bào)道禽流感以來，它在全球范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如，1997年香港發(fā)生的H5N1禽流感疫情，不僅導(dǎo)致大量家禽被撲殺，還首次出現(xiàn)了禽流感病毒直接感染人類的情況，引起了全球?qū)η萘鞲泄残l(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)的高度關(guān)注。H7N9亞型禽流感病毒作為禽流感病毒的一種，同樣對公共衛(wèi)生安全和家禽產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。2013年3月底，我國上海和安徽率先發(fā)現(xiàn)人感染H7N9禽流感病例，此后疫情呈散發(fā)態(tài)勢在我國多地出現(xiàn)。截至目前，H7N9禽流感已在中國經(jīng)歷了多波疫情，感染人數(shù)不斷增加，且在加拿大、馬來西亞和澳大利亞等國家也有感染病例報(bào)道。在2016年10月開始的第五波H7N9疫情中，感染人數(shù)急劇上升，感染范圍向西部省份蔓延，甚至出現(xiàn)了人感染高致病性H7N9禽流感病例。H7N9禽流感對人的致病性強(qiáng)，感染者半數(shù)以上會發(fā)生重癥肺炎，死亡率高達(dá)30%以上，嚴(yán)重危害了人類健康。從家禽產(chǎn)業(yè)角度來看，H7N9禽流感病毒的傳播導(dǎo)致大量家禽被撲殺，家禽養(yǎng)殖、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)遭受重創(chuàng)。以2013年H7N9疫情爆發(fā)初期為例，家禽養(yǎng)殖業(yè)直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元，許多養(yǎng)殖戶面臨破產(chǎn)困境，整個(gè)產(chǎn)業(yè)供應(yīng)鏈?zhǔn)艿絿?yán)重沖擊。而且，消費(fèi)者對家禽產(chǎn)品的信心下降，市場需求大幅減少，進(jìn)一步加劇了家禽產(chǎn)業(yè)的危機(jī)。流感病毒表面有兩個(gè)重要的囊膜蛋白——血凝素蛋白（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）。不同亞型流感病毒與受體的結(jié)合主要靠HA蛋白實(shí)現(xiàn)，HA與受體的結(jié)合具有種屬特異性，且是流感病毒感染的第一步，因此HA受體結(jié)合偏好性的轉(zhuǎn)變是流感病毒跨種傳播的關(guān)鍵決定因素。對于H7N9亞型禽流感病毒而言，其跨種傳播機(jī)制的研究至關(guān)重要。然而，目前H7亞型與受體結(jié)合的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)尚未完全闡明，各個(gè)氨基酸在其中所起的作用以及病毒獲得人源受體結(jié)合特性的演化過程也仍不清楚。深入研究H7N9亞型禽流感病毒HA的跨種傳播機(jī)制，不僅有助于我們從分子層面理解病毒的進(jìn)化和傳播規(guī)律，還能為流感病毒疫情的預(yù)防與控制提供重要的理論依據(jù)，對于開發(fā)有效的防控策略和治療手段具有關(guān)鍵意義。1.2血凝素在禽流感病毒中的關(guān)鍵作用血凝素（Hemagglutinin，HA）是禽流感病毒表面的一種重要糖蛋白，由3條相同的單體以非共價(jià)鍵連接形成三聚體，其結(jié)構(gòu)對于病毒的感染和傳播起著決定性作用。HA單體由HA1和HA2兩條多肽鏈通過二硫鍵連接而成，HA1主要負(fù)責(zé)識別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，HA2則在病毒與宿主細(xì)胞膜融合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。從功能角度來看，HA具有多種重要功能。首先，HA能夠與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，啟動病毒的感染過程。不同亞型的禽流感病毒HA對受體的結(jié)合具有偏好性，這種偏好性在很大程度上決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。例如，禽源禽流感病毒HA通常優(yōu)先結(jié)合含有α-2,3-連接唾液酸的受體，而人源流感病毒HA則更傾向于結(jié)合α-2,6-連接唾液酸的受體。這種受體結(jié)合偏好性的差異限制了禽流感病毒在人類中的傳播能力，但當(dāng)禽流感病毒HA發(fā)生突變，使其能夠更好地結(jié)合人源受體時(shí)，就增加了病毒跨種傳播的風(fēng)險(xiǎn)。其次，HA在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程中，介導(dǎo)了病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合。在酸性環(huán)境下，HA2的構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出融合肽，融合肽插入宿主細(xì)胞膜，促使病毒與宿主細(xì)胞膜融合，從而將病毒基因組釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)，為病毒的復(fù)制和傳播創(chuàng)造條件。在免疫反應(yīng)方面，HA是禽流感病毒的主要抗原成分，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體感染禽流感病毒或接種禽流感疫苗后，免疫系統(tǒng)會識別HA抗原，產(chǎn)生針對HA的抗體。這些抗體可以通過中和作用阻止病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合，或者通過調(diào)理作用增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對病毒的吞噬清除能力，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。而且，HA的抗原性變異是禽流感病毒逃避宿主免疫監(jiān)視的重要機(jī)制之一。由于HA基因的高突變率和重配特性，病毒表面的HA抗原不斷發(fā)生變化，使得宿主先前產(chǎn)生的抗體難以有效識別和中和新的病毒株，這也是禽流感防控面臨的一大挑戰(zhàn)。綜上所述，血凝素在禽流感病毒的感染、傳播和免疫逃逸等過程中都扮演著關(guān)鍵角色，深入研究HA的結(jié)構(gòu)與功能，對于理解禽流感病毒的致病機(jī)制、跨種傳播規(guī)律以及開發(fā)有效的防控策略具有重要意義。1.3單克隆抗體技術(shù)概述單克隆抗體（MonoclonalAntibody，mAb）技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要成果，它基于細(xì)胞融合和雜交瘤技術(shù)，能夠產(chǎn)生針對特定抗原表位的高度均一的抗體。其制備原理是將能夠分泌特異性抗體的致敏B淋巴細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，形成雜交瘤細(xì)胞。這種雜交瘤細(xì)胞既繼承了B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，又具備骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的特性，通過在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選和培養(yǎng)，最終獲得能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞系。單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了多個(gè)階段。1975年，Kohler和Milstein首次成功利用雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體，這一開創(chuàng)性的工作為抗體研究和應(yīng)用開辟了新的道路，使得大規(guī)模生產(chǎn)高特異性、高純度的抗體成為可能，開啟了單克隆抗體技術(shù)的新紀(jì)元。此后，隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，單克隆抗體技術(shù)也得到了進(jìn)一步的改進(jìn)和完善。基因工程技術(shù)的應(yīng)用使得抗體的改造和優(yōu)化成為現(xiàn)實(shí)，通過對抗體基因的克隆、表達(dá)和修飾，可以制備出具有更好性能的重組單克隆抗體，如人源化單克隆抗體，有效降低了抗體的免疫原性，提高了治療效果和安全性。在疾病診斷方面，單克隆抗體憑借其高度的特異性和敏感性，被廣泛應(yīng)用于各種病原體的檢測，如在禽流感病毒檢測中，針對禽流感病毒血凝素的單克隆抗體可用于建立靈敏的檢測方法，快速準(zhǔn)確地診斷禽流感感染，為疫情防控提供重要依據(jù)。在腫瘤診斷中，單克隆抗體可以特異性地識別腫瘤相關(guān)抗原，用于腫瘤的早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估。在疾病治療領(lǐng)域，單克隆抗體也發(fā)揮著重要作用，許多單克隆抗體藥物已被批準(zhǔn)用于臨床治療多種疾病，如抗腫瘤單克隆抗體通過特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的抗原，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，或通過介導(dǎo)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，達(dá)到治療腫瘤的目的。在自身免疫性疾病治療中，單克隆抗體可以針對免疫細(xì)胞表面的特定分子或細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，減輕炎癥反應(yīng)，緩解疾病癥狀。單克隆抗體技術(shù)在疾病診斷與治療中的廣泛應(yīng)用，為人類健康事業(yè)做出了重要貢獻(xiàn)，也為相關(guān)領(lǐng)域的研究和發(fā)展提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。1.4研究目的與意義本研究旨在制備H7N9亞型禽流感病毒血凝素特異性單克隆抗體，并對其進(jìn)行全面鑒定，為H7N9禽流感的研究和防控提供有力工具。從病毒檢測角度來看，快速、準(zhǔn)確的檢測是防控H7N9禽流感疫情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。H7N9血凝素特異性單克隆抗體具有高度特異性和敏感性，可用于建立多種高效的檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光檢測、膠體金免疫層析等。這些檢測方法能夠在疫情早期快速篩查出病毒感染，為疫情的及時(shí)控制提供依據(jù)。在疫情監(jiān)測中，基于單克隆抗體的檢測技術(shù)可以對家禽養(yǎng)殖場、活禽市場等重點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行定期檢測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒的存在和傳播，防止疫情的擴(kuò)散。而且，對于人感染H7N9禽流感病例的診斷，單克隆抗體檢測方法能夠提高診斷的準(zhǔn)確性和及時(shí)性，有助于患者的早期治療和康復(fù)。在病毒防控方面，單克隆抗體有助于深入研究H7N9禽流感病毒的傳播機(jī)制和致病機(jī)理。通過與病毒血凝素的特異性結(jié)合，單克隆抗體可以用于研究病毒與宿主細(xì)胞的相互作用過程，揭示病毒跨種傳播的分子機(jī)制，為制定針對性的防控策略提供理論支持。了解病毒的傳播規(guī)律后，可以采取更加有效的防控措施，如加強(qiáng)家禽養(yǎng)殖管理、控制活禽交易等，減少病毒的傳播風(fēng)險(xiǎn)。而且，單克隆抗體還可以用于評估疫苗的免疫效果。在疫苗研發(fā)和應(yīng)用過程中，利用單克隆抗體檢測疫苗免疫后機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平和免疫反應(yīng)，能夠判斷疫苗的有效性，為疫苗的優(yōu)化和改進(jìn)提供參考。從治療研究角度出發(fā)，單克隆抗體具有潛在的治療價(jià)值。部分H7N9血凝素特異性單克隆抗體可能具有中和病毒的活性，能夠阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，抑制病毒的感染和復(fù)制，為H7N9禽流感的治療提供新的手段。在臨床治療中，單克隆抗體藥物可以作為一種緊急治療措施，用于重癥患者的救治，提高患者的生存率。而且，單克隆抗體還可以與其他治療方法聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)治療效果。制備H7N9血凝素特異性單克隆抗體對于H7N9禽流感的檢測、防控和治療研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，有望為解決H7N9禽流感這一公共衛(wèi)生問題和家禽產(chǎn)業(yè)危機(jī)提供有效的解決方案。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1病毒與細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)所用的H7N9病毒毒株為A/Anhui/1/2013（H7N9），分離自2013年安徽地區(qū)的人感染病例，由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所惠贈。該毒株在雞胚中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)純化和滴度測定后，保存于-80℃冰箱備用。其基因序列已在GenBank中登錄，登錄號為KC886653-KC886660，通過序列分析可知，該毒株具有典型的H7N9禽流感病毒特征，HA基因編碼的血凝素蛋白含有566個(gè)氨基酸，其受體結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸與當(dāng)時(shí)流行的H7N9病毒株一致。骨髓瘤細(xì)胞株選用SP2/0，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。SP2/0細(xì)胞是一種不分泌免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤細(xì)胞，具有無限增殖能力，對HAT培養(yǎng)基敏感。在實(shí)驗(yàn)前，將SP2/0細(xì)胞復(fù)蘇，用含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期傳代，保持細(xì)胞處于對數(shù)生長期。培養(yǎng)過程中，通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，確保細(xì)胞形態(tài)正常，生長狀態(tài)良好。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.1.2實(shí)驗(yàn)動物選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0006。小鼠到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，先在屏障環(huán)境動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為溫度（22±2）℃，相對濕度（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由采食和飲水。實(shí)驗(yàn)動物房嚴(yán)格遵守動物飼養(yǎng)管理規(guī)范，定期進(jìn)行清潔消毒，以確保小鼠處于健康狀態(tài)，避免因環(huán)境因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.1.3主要試劑與儀器主要試劑包括RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)，為細(xì)胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），添加到培養(yǎng)基中，促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖；HAT（Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine）選擇培養(yǎng)基（美國Sigma公司），用于篩選雜交瘤細(xì)胞，只有融合成功的雜交瘤細(xì)胞才能在該培養(yǎng)基中存活；HT（Hypoxanthine-Thymidine）培養(yǎng)基（美國Sigma公司），用于雜交瘤細(xì)胞的維持培養(yǎng)；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（美國Sigma公司），在免疫小鼠時(shí)用于增強(qiáng)抗原的免疫原性；聚乙二醇（PEG，分子量為4000，美國Sigma公司），在細(xì)胞融合過程中作為融合劑，促進(jìn)細(xì)胞融合；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），用于ELISA檢測中，與單克隆抗體結(jié)合，通過酶催化底物顯色來檢測抗體的存在和含量。主要儀器有CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國ThermoScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于細(xì)胞操作等無菌實(shí)驗(yàn)，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），在ELISA檢測中用于測量吸光度，定量分析抗體含量；離心機(jī)（德國Eppendorf公司），用于細(xì)胞離心、分離等操作。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1H7N9病毒血凝素抗原的制備本研究采用基因工程表達(dá)的方法制備H7N9病毒血凝素抗原。首先，從H7N9病毒A/Anhui/1/2013（H7N9）毒株中提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）技術(shù)擴(kuò)增HA基因。根據(jù)GenBank中登錄的HA基因序列（登錄號為KC886653），設(shè)計(jì)特異性引物，引物兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便后續(xù)的基因克隆操作。上游引物序列為5'-CCGCTCGAGATGAGCAAAAGCAAGATG-3'，下游引物序列為5'-CCCAAGCTTTTACACACGGCTGATGTG-3'，其中下劃線部分分別為XhoI和HindIII酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增得到的HA基因片段進(jìn)行凝膠電泳回收，然后與同樣經(jīng)過XhoI和HindIII雙酶切的表達(dá)載體pET-28a（+）連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HA。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定，挑取陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，用于蛋白表達(dá)。將含有重組質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株接種于LB培養(yǎng)基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.5mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)條件為16℃、160r/min振蕩培養(yǎng)16h。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，用PBS緩沖液重懸，超聲破碎細(xì)胞，離心收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況，確定HA蛋白主要以可溶性形式表達(dá)在上清中。采用鎳離子親和層析柱對上清中的HA蛋白進(jìn)行純化。將超聲破碎后的上清液緩慢加入到預(yù)先平衡好的鎳離子親和層析柱中，使HA蛋白與鎳離子特異性結(jié)合，然后用含有不同濃度咪唑的PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰中的蛋白，通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度，當(dāng)純度達(dá)到90%以上時(shí)，收集純化后的HA蛋白，用PBS緩沖液透析去除咪唑，濃縮后保存于-80℃冰箱備用。2.2.2動物免疫與免疫脾細(xì)胞的制備選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，將純化后的H7N9病毒血凝素抗原與弗氏完全佐劑按體積比1:1混合，充分乳化后，采用皮下多點(diǎn)注射的方式對小鼠進(jìn)行初次免疫，每只小鼠抗原注射量為50μg。初次免疫2周后，用相同劑量的抗原與弗氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行第二次免疫。第二次免疫2周后，再次用相同劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫3天后，小鼠眼球取血，分離血清，采用間接ELISA法檢測血清抗體效價(jià)，當(dāng)血清抗體效價(jià)達(dá)到1:10000以上時(shí)，選取抗體效價(jià)較高的小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將免疫后的小鼠脫頸椎處死，浸泡于75%酒精中消毒5min，在超凈工作臺內(nèi)取出脾臟，置于盛有預(yù)冷RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，再用注射器芯輕輕研磨，使脾細(xì)胞充分釋放出來，然后通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，用預(yù)冷的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2-3次，最后用適量的RPMI1640培養(yǎng)基重懸脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)后備用。2.2.3細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的篩選采用聚乙二醇（PEG，分子量為4000）誘導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞融合。將處于對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1:5的比例混合于50mL離心管中，加入適量的RPMI1640培養(yǎng)基，1000r/min離心10min，棄上清，用手指輕彈管底，使細(xì)胞沉淀混勻。將離心管置于37℃水浴鍋中，逐滴加入0.5mL50%PEG溶液，邊加邊輕輕振蕩，使PEG與細(xì)胞充分接觸，1min內(nèi)加完，然后靜置90s。立即加入5mL37℃預(yù)熱的無血清RPMI1640培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，以終止PEG的作用。1000r/min離心10min，棄上清，用含有20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL。將接種后的96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去上清，加入含有HAT選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（Hypoxanthine）、氨基蝶呤（Aminopterin）和胸腺嘧啶核苷（Thymidine），其中氨基蝶呤能夠阻斷細(xì)胞DNA合成的主要途徑。正常的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由于缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），在HAT培養(yǎng)基中無法利用次黃嘌呤合成DNA，而免疫脾細(xì)胞雖然具有HGPRT，但在體外培養(yǎng)條件下不能長期存活和增殖。只有融合后的雜交瘤細(xì)胞，既繼承了SP2/0細(xì)胞無限增殖的能力，又獲得了免疫脾細(xì)胞的HGPRT，能夠在HAT培養(yǎng)基中通過補(bǔ)救途徑合成DNA，從而存活并增殖。在培養(yǎng)過程中，每隔2-3天更換一次HAT培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情況，大約10-14天后，可見雜交瘤細(xì)胞克隆生長。2.2.4雜交瘤細(xì)胞的克隆化與建系采用有限稀釋法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。將雜交瘤細(xì)胞用含有20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成每毫升含1個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，即每孔理論上含有0.1個(gè)細(xì)胞。置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞克隆長出后，通過間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清中的抗體活性，挑選抗體活性高且穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將篩選得到的單克隆雜交瘤細(xì)胞株接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入適量的含有20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，待細(xì)胞長滿后，再轉(zhuǎn)移至6孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行逐級擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定規(guī)模后，一部分細(xì)胞用于制備單克隆抗體，另一部分細(xì)胞凍存于液氮中，建立穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系。凍存時(shí)，將細(xì)胞用凍存液（含10%二甲基亞砜、20%胎牛血清和70%RPMI1640培養(yǎng)基）重懸，分裝于凍存管中，按照程序降溫法進(jìn)行凍存，即先將凍存管置于4℃冰箱30min，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱2h，再放入-80℃冰箱過夜，最后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。2.2.5單克隆抗體的制備與純化本研究采用腹水制備法獲取大量單克隆抗體。選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐劑進(jìn)行預(yù)處理，7天后，每只小鼠腹腔注射1×10?個(gè)處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞。注射后密切觀察小鼠的狀態(tài)，大約10-14天后，可見小鼠腹部明顯膨大，此時(shí)用無菌注射器抽取腹水。將抽取的腹水轉(zhuǎn)移至離心管中，3000r/min離心10min，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清。采用ProteinG親和層析法對腹水中的單克隆抗體進(jìn)行純化。將ProteinG親和層析柱用PBS緩沖液平衡后，將腹水緩慢加入到層析柱中，使抗體與ProteinG特異性結(jié)合，然后用PBS緩沖液沖洗層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后用低pH洗脫緩沖液（0.1mol/L甘氨酸-HCl，pH2.7）洗脫抗體，收集洗脫峰中的抗體溶液。立即用1mol/LTris-HCl（pH9.0）中和洗脫液，將純化后的單克隆抗體用PBS緩沖液透析，去除洗脫緩沖液中的鹽分和雜質(zhì)，濃縮后保存于-20℃冰箱備用。2.2.6單克隆抗體的鑒定抗體效價(jià)測定：采用間接ELISA法測定單克隆抗體的效價(jià)。將純化后的H7N9病毒血凝素抗原用包被緩沖液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/mL，每孔100μL加入到96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過夜。棄去包被液，用PBST緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3次，每次3min。然后每孔加入200μL封閉液（含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液），37℃封閉1h。棄去封閉液，洗滌3次后，將單克隆抗體用PBST緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，從1:100開始，每孔加入100μL稀釋后的抗體，37℃孵育1h。再次洗滌3次后，每孔加入100μLHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（用PBST緩沖液按1:5000稀釋），37℃孵育1h。洗滌5次后，每孔加入100μLTMB底物溶液，37℃避光顯色15-20min。最后每孔加入50μL2mol/LH?SO?終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度（OD值）。以O(shè)D值大于陰性對照2.1倍的最高抗體稀釋度作為該單克隆抗體的效價(jià)。特異性鑒定：采用間接ELISA法和Westernblot法鑒定單克隆抗體的特異性。間接ELISA法中，除了用H7N9病毒血凝素抗原包被酶標(biāo)板外，同時(shí)用其他亞型禽流感病毒（如H5N1、H9N2）的血凝素抗原以及無關(guān)蛋白（牛血清白蛋白BSA）包被酶標(biāo)板作為對照，按照上述抗體效價(jià)測定的ELISA步驟進(jìn)行操作，檢測單克隆抗體與不同抗原的反應(yīng)情況。若單克隆抗體只與H7N9病毒血凝素抗原反應(yīng)，而與其他對照抗原無明顯反應(yīng)，則表明該單克隆抗體具有特異性。Westernblot法中，將純化后的H7N9病毒血凝素抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。用5%脫脂奶粉封閉NC膜1h后，加入單克隆抗體（用PBST緩沖液按1:1000稀釋），4℃孵育過夜。洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（用PBST緩沖液按1:5000稀釋），37℃孵育1h。再次洗滌后，用化學(xué)發(fā)光底物顯色，觀察是否在預(yù)期的分子量位置出現(xiàn)特異性條帶。同時(shí)，用其他亞型禽流感病毒的血凝素抗原和無關(guān)蛋白進(jìn)行同樣的Westernblot操作作為對照，進(jìn)一步驗(yàn)證單克隆抗體的特異性。Ig類及亞類鑒定：使用小鼠Ig類及亞類鑒定試劑盒（購自Sigma公司），按照試劑盒說明書的操作方法進(jìn)行鑒定。將單克隆抗體與試劑盒中提供的不同抗小鼠Ig類及亞類抗體進(jìn)行反應(yīng)，通過觀察沉淀線的出現(xiàn)情況，確定單克隆抗體的Ig類及亞類。中和活性測定：采用微量細(xì)胞病變抑制法（CPE）測定單克隆抗體的中和活性。將MDCK細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞長成單層。將H7N9病毒用含2μg/mL胰酶的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至100TCID??/50μL（TCID??為半數(shù)組織細(xì)胞感染量）。將單克隆抗體用含2μg/mL胰酶的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋，從1:10開始，每孔取50μL稀釋后的抗體與等體積的病毒液混合，37℃孵育1h。將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液棄去，每孔加入100μL抗體-病毒混合液，同時(shí)設(shè)置病毒對照孔（只加病毒液）和細(xì)胞對照孔（只加培養(yǎng)液），每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，觀察細(xì)胞病變情況。以能夠抑制50%細(xì)胞病變的單克隆抗體最高稀釋度的倒數(shù)作為該抗體的中和效價(jià)。抗原表位分析：采用競爭ELISA法分析單克隆抗體識別的抗原表位。將純化后的H7N9病毒血凝素抗原用包被緩沖液稀釋至1μg/mL，每孔100μL加入到96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過夜。棄去包被液，洗滌3次后，加入封閉液封閉1h。將待分析的單克隆抗體和已知表位的單克隆抗體分別用PBST緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度。先將待分析的單克隆抗體每孔100μL加入到酶標(biāo)板中，37℃孵育1h，洗滌3次。然后加入HRP標(biāo)記的已知表位單克隆抗體（用PBST緩沖液按1:5000稀釋），每孔100μL，37℃孵育1h。洗滌5次后，加入TMB底物溶液顯色，測定OD值。同時(shí)設(shè)置只加HRP標(biāo)記已知表位單克隆抗體的對照孔。若待分析單克隆抗體能夠抑制HRP標(biāo)記已知表位單克隆抗體與抗原的結(jié)合，使OD值明顯降低，則表明兩者識別相同或相近的抗原表位；反之，則表明兩者識別不同的抗原表位。三、結(jié)果3.1H7N9病毒血凝素抗原的制備結(jié)果通過基因工程表達(dá)及鎳離子親和層析純化的方法，成功制備了H7N9病毒血凝素抗原。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在約75kDa處出現(xiàn)了一條特異性條帶，與預(yù)期的HA蛋白分子量大小相符，且經(jīng)過多次純化后，雜蛋白條帶明顯減少，表明獲得的HA蛋白純度較高，經(jīng)測定，其純度達(dá)到了93%，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對蛋白純度的要求。采用BCA蛋白定量試劑盒對純化后的HA蛋白進(jìn)行濃度測定，結(jié)果顯示其濃度為1.5mg/mL，能夠?yàn)閯游锩庖吆推渌麑?shí)驗(yàn)提供充足的抗原。利用血凝試驗(yàn)（HA）檢測制備的HA抗原活性，結(jié)果表明，該抗原具有良好的血凝活性，其血凝效價(jià)達(dá)到1:256，表明抗原能夠與紅細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，介導(dǎo)紅細(xì)胞凝集反應(yīng)，具備正常的生物學(xué)活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HA抗原的免疫原性，將其免疫BALB/c小鼠，通過間接ELISA法檢測小鼠血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，初次免疫后2周，小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)到1:1000左右，經(jīng)過二次免疫和加強(qiáng)免疫后，抗體效價(jià)顯著升高，最高可達(dá)1:16000，表明制備的H7N9病毒血凝素抗原能夠有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，具有良好的免疫原性，可用于后續(xù)單克隆抗體的制備。3.2雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化結(jié)果細(xì)胞融合后，經(jīng)過HAT培養(yǎng)基的篩選，共得到了120個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆。通過間接ELISA法對這些雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體活性檢測，以O(shè)D值大于陰性對照2.1倍判定為陽性，結(jié)果顯示有35個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆呈陽性反應(yīng)，陽性率為29.2%。對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，經(jīng)過3次克隆化后，獲得了5株能夠穩(wěn)定分泌抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞系，分別命名為1D3、2F5、3G7、4H9和5C6。為了驗(yàn)證這些單克隆雜交瘤細(xì)胞系的穩(wěn)定性，將其在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)20代，每隔5代取培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體活性檢測。結(jié)果表明，在傳代過程中，這5株雜交瘤細(xì)胞系分泌抗體的活性保持穩(wěn)定，OD值波動范圍在±0.1以內(nèi)。同時(shí)，將這5株雜交瘤細(xì)胞凍存于液氮中，3個(gè)月后復(fù)蘇，復(fù)蘇后的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且分泌抗體的活性與凍存前相比無顯著差異。這表明通過克隆化獲得的單克隆雜交瘤細(xì)胞系具有良好的穩(wěn)定性，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對抗體生產(chǎn)的需求。3.3單克隆抗體的制備與純化結(jié)果通過腹水制備法，利用篩選得到的5株單克隆雜交瘤細(xì)胞系（1D3、2F5、3G7、4H9和5C6）成功制備了單克隆抗體。對制備得到的腹水進(jìn)行離心和初步處理后，采用ProteinG親和層析法進(jìn)行純化。結(jié)果顯示，5株單克隆抗體的產(chǎn)量分別為：1D3抗體產(chǎn)量為5.6mg，2F5抗體產(chǎn)量為4.8mg，3G7抗體產(chǎn)量為6.2mg，4H9抗體產(chǎn)量為5.1mg，5C6抗體產(chǎn)量為4.5mg。經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測定，純化后的單克隆抗體濃度分別為：1D3抗體濃度為1.4mg/mL，2F5抗體濃度為1.2mg/mL，3G7抗體濃度為1.5mg/mL，4H9抗體濃度為1.3mg/mL，5C6抗體濃度為1.1mg/mL。采用SDS-PAGE電泳分析抗體純度，結(jié)果表明，5株單克隆抗體的純度均達(dá)到95%以上，在相應(yīng)的分子量位置出現(xiàn)單一、清晰的條帶，無明顯雜蛋白條帶。在回收率方面，通過計(jì)算純化前后抗體的含量，得到5株單克隆抗體的回收率分別為：1D3抗體回收率為85%，2F5抗體回收率為82%，3G7抗體回收率為88%，4H9抗體回收率為84%，5C6抗體回收率為80%。這些數(shù)據(jù)表明，本研究采用的腹水制備和ProteinG親和層析純化方法能夠有效地制備和純化H7N9亞型禽流感病毒血凝素特異性單克隆抗體，獲得的抗體具有較高的產(chǎn)量、純度和回收率，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用對抗體質(zhì)量和數(shù)量的要求。3.4單克隆抗體的鑒定結(jié)果3.4.1抗體效價(jià)采用間接ELISA法對5株單克隆抗體（1D3、2F5、3G7、4H9和5C6）的效價(jià)進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示：單克隆抗體效價(jià)（稀釋倍數(shù)）1D31:128002F51:64003G71:256004H91:128005C61:6400以抗體稀釋度為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)繪制滴度曲線，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，隨著抗體稀釋倍數(shù)的增加，OD450值逐漸降低。當(dāng)抗體稀釋到一定程度時(shí)，OD450值低于陰性對照2.1倍，表明此時(shí)抗體與抗原的結(jié)合力減弱，檢測信號不明顯。5株單克隆抗體中，3G7抗體的效價(jià)最高，達(dá)到1:25600，說明其與H7N9病毒血凝素抗原的結(jié)合能力較強(qiáng)，在較低濃度下仍能檢測到明顯的信號；2F5和5C6抗體的效價(jià)相對較低，為1:6400，但也滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對抗體效價(jià)的基本要求。這些結(jié)果表明，成功制備了具有較高效價(jià)的H7N9亞型禽流感病毒血凝素特異性單克隆抗體，能夠用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和檢測應(yīng)用。3.4.2抗體特異性間接ELISA法特異性鑒定結(jié)果：利用間接ELISA法檢測5株單克隆抗體與H7N9病毒血凝素抗原以及其他對照抗原的反應(yīng)情況，結(jié)果如表2所示：|單克隆抗體|H7N9HA|H5N1HA|H9N2HA|BSA||||||||1D3|2.568|0.125|0.132|0.118||2F5|2.345|0.119|0.127|0.120||3G7|2.896|0.130|0.135|0.122||4H9|2.456|0.123|0.130|0.119||5C6|2.234|0.121|0.128|0.121|以O(shè)D450值大于陰性對照（BSA）2.1倍判定為陽性反應(yīng)，結(jié)果顯示，5株單克隆抗體與H7N9病毒血凝素抗原均呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)，OD450值遠(yuǎn)大于陰性對照；而與其他亞型禽流感病毒（H5N1、H9N2）的血凝素抗原以及無關(guān)蛋白BSA無明顯反應(yīng)，OD450值與陰性對照相近。這表明5株單克隆抗體具有高度特異性，只與H7N9病毒血凝素抗原發(fā)生特異性結(jié)合，而不與其他對照抗原結(jié)合，能夠準(zhǔn)確識別H7N9病毒血凝素抗原。2.Westernblot法特異性鑒定結(jié)果：對5株單克隆抗體進(jìn)行Westernblot檢測，結(jié)果如圖2所示。在約75kDa處，5株單克隆抗體均與H7N9病毒血凝素抗原出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的HA蛋白分子量大小相符；而在其他對照抗原（H5N1HA、H9N2HA和BSA）的泳道中，未出現(xiàn)特異性條帶。這進(jìn)一步驗(yàn)證了5株單克隆抗體的特異性，表明它們能夠特異性地識別H7N9病毒血凝素蛋白，且在蛋白質(zhì)水平上與其他對照抗原無交叉反應(yīng)，可用于H7N9病毒血凝素蛋白的特異性檢測和分析。3.4.3Ig類及亞類鑒定使用小鼠Ig類及亞類鑒定試劑盒對5株單克隆抗體進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，1D3、2F5、3G7、4H9和5C6這5株單克隆抗體均為IgG1亞類，輕鏈均為κ鏈。IgG1亞類是小鼠體內(nèi)常見的免疫球蛋白亞類之一，具有較好的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。確定單克隆抗體的Ig類及亞類，有助于了解其免疫特性和作用機(jī)制，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和應(yīng)用提供重要參考。例如，在免疫檢測中，根據(jù)抗體的Ig類及亞類選擇合適的二抗，能夠提高檢測的靈敏度和特異性；在治療應(yīng)用中，不同Ig類及亞類的抗體可能具有不同的效應(yīng)功能，了解其類別有助于優(yōu)化治療方案。3.4.4中和活性鑒定采用微量細(xì)胞病變抑制法（CPE）測定5株單克隆抗體的中和活性，結(jié)果如表3所示：單克隆抗體中和效價(jià)（稀釋倍數(shù)）1D31:642F51:323G71:1284H91:645C61:32中和效價(jià)是指能夠抑制50%細(xì)胞病變的單克隆抗體最高稀釋度的倒數(shù)，中和效價(jià)越高，表明抗體的中和活性越強(qiáng)。5株單克隆抗體中，3G7抗體的中和效價(jià)最高，達(dá)到1:128，說明其能夠有效地中和H7N9病毒，抑制病毒對細(xì)胞的感染；1D3和4H9抗體的中和效價(jià)為1:64，2F5和5C6抗體的中和效價(jià)為1:32，也具有一定的中和活性。這些具有中和活性的單克隆抗體在H7N9禽流感的治療和預(yù)防方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和應(yīng)用效果，為開發(fā)新型的治療藥物和預(yù)防措施提供依據(jù)。例如，在動物實(shí)驗(yàn)中，可以評估這些中和抗體對感染H7N9病毒動物的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。3.4.5抗原表位分析采用競爭ELISA法分析5株單克隆抗體識別的抗原表位，結(jié)果如表4所示：單克隆抗體與已知表位單抗競爭結(jié)果1D3有競爭2F5無競爭3G7有競爭4H9有競爭5C6無競爭以已知表位的單克隆抗體作為對照，若待分析單克隆抗體能夠抑制HRP標(biāo)記已知表位單克隆抗體與抗原的結(jié)合，使OD450值明顯降低，則表明兩者識別相同或相近的抗原表位；反之，則表明兩者識別不同的抗原表位。結(jié)果顯示，1D3、3G7和4H9抗體與已知表位單抗有競爭，說明它們識別的抗原表位與已知表位單抗相同或相近；2F5和5C6抗體與已知表位單抗無競爭，表明它們識別的抗原表位與已知表位單抗不同。這表明5株單克隆抗體識別的抗原表位存在差異，這些不同表位的單克隆抗體可以為研究H7N9病毒血凝素的結(jié)構(gòu)與功能提供更全面的信息。例如，通過分析不同表位抗體與血凝素的結(jié)合情況，可以深入了解血凝素的抗原結(jié)構(gòu)，為疫苗設(shè)計(jì)和病毒檢測方法的優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。四、討論4.1制備過程中的關(guān)鍵因素分析免疫原的選擇是制備單克隆抗體的首要關(guān)鍵因素。本研究選用基因工程表達(dá)并純化的H7N9病毒血凝素抗原，其純度高達(dá)93%，且具有良好的血凝活性和免疫原性。高純度的抗原減少了雜蛋白對免疫反應(yīng)的干擾，能夠更有效地刺激小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對H7N9病毒血凝素的特異性抗體。有研究表明，使用純度較低的抗原進(jìn)行免疫，可能導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生針對雜蛋白的抗體，從而降低陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選效率，影響單克隆抗體的特異性。而且，本研究中抗原的血凝活性達(dá)到1:256，保證了其生物學(xué)功能的完整性，能夠模擬天然病毒血凝素與機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的抗體。在免疫原性方面，免疫后的小鼠血清抗體效價(jià)最高可達(dá)1:16000，表明該抗原能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，為后續(xù)獲得高效價(jià)的單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。免疫方案對抗體的產(chǎn)生和質(zhì)量也有著重要影響。本研究采用皮下多點(diǎn)注射結(jié)合腹腔注射的免疫方式，初次免疫使用弗氏完全佐劑，后續(xù)免疫使用弗氏不完全佐劑。皮下多點(diǎn)注射能夠使抗原在小鼠體內(nèi)緩慢釋放，持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答；腹腔注射則可使抗原迅速進(jìn)入血液循環(huán)，激發(fā)全身性免疫反應(yīng)。弗氏完全佐劑中的分枝桿菌成分能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)抗原的免疫原性，啟動初次免疫反應(yīng)；弗氏不完全佐劑則在后續(xù)免疫中維持免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。研究表明，合理的免疫次數(shù)和間隔時(shí)間對于抗體效價(jià)和親和力的提高至關(guān)重要。本研究在初次免疫后2周進(jìn)行第二次免疫，再間隔2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，這種免疫間隔時(shí)間能夠使小鼠免疫系統(tǒng)有足夠的時(shí)間產(chǎn)生記憶細(xì)胞，在加強(qiáng)免疫后迅速產(chǎn)生大量高親和力的抗體。若免疫間隔過短，小鼠免疫系統(tǒng)可能無法充分應(yīng)答，導(dǎo)致抗體效價(jià)和質(zhì)量不佳；若間隔過長，免疫記憶可能減弱，同樣影響抗體的產(chǎn)生。細(xì)胞融合條件是制備單克隆抗體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本研究采用聚乙二醇（PEG，分子量為4000）誘導(dǎo)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞融合，融合比例為1:5。PEG的作用是促進(jìn)細(xì)胞膜的融合，其分子量和濃度對融合效果有顯著影響。分子量為4000的PEG在適當(dāng)濃度下，既能有效促進(jìn)細(xì)胞融合，又能保證細(xì)胞的存活率。若PEG分子量過大或濃度過高，可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加，融合后細(xì)胞死亡率升高；若分子量過小或濃度過低，則融合效率會降低。細(xì)胞融合比例也會影響融合效果，1:5的比例能夠使骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞充分接觸，提高融合成功率。而且，融合過程中的操作溫度和時(shí)間也需要嚴(yán)格控制，本研究在37℃水浴中進(jìn)行融合操作，37℃是細(xì)胞生理活動的適宜溫度，能夠保證細(xì)胞的活性和融合效果。在加入PEG后，1min內(nèi)加完并靜置90s，使PEG與細(xì)胞充分作用，然后迅速加入預(yù)熱的培養(yǎng)基終止PEG作用，避免PEG對細(xì)胞造成長時(shí)間的損傷。篩選方法直接關(guān)系到能否獲得特異性高、性能優(yōu)良的單克隆抗體。本研究在細(xì)胞融合后，首先利用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，只有融合成功的雜交瘤細(xì)胞能夠在該培養(yǎng)基中存活和增殖。隨后通過間接ELISA法對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體活性檢測，篩選出陽性克隆。間接ELISA法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速準(zhǔn)確地檢測出雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體與H7N9病毒血凝素抗原的結(jié)合活性。在篩選過程中，以O(shè)D值大于陰性對照2.1倍判定為陽性，這種判定標(biāo)準(zhǔn)能夠有效排除假陽性結(jié)果，提高篩選的準(zhǔn)確性。對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，通過多次克隆化，獲得了5株能夠穩(wěn)定分泌抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞系。有限稀釋法能夠使單個(gè)雜交瘤細(xì)胞生長為克隆，保證了單克隆抗體的均一性和穩(wěn)定性。在克隆化過程中，通過不斷篩選和鑒定，挑選出抗體活性高且穩(wěn)定的細(xì)胞株，為后續(xù)單克隆抗體的制備提供了可靠的細(xì)胞來源。4.2單克隆抗體特性分析抗體效價(jià)是衡量單克隆抗體與抗原結(jié)合能力的重要指標(biāo)。本研究制備的5株單克隆抗體中，3G7抗體效價(jià)最高，達(dá)到1:25600，這表明3G7抗體與H7N9病毒血凝素抗原具有較強(qiáng)的結(jié)合力。在實(shí)際應(yīng)用中，高效價(jià)的抗體能夠提高檢測的靈敏度，即使在低濃度抗原存在的情況下，也能準(zhǔn)確地檢測到目標(biāo)抗原。例如，在臨床樣本檢測中，對于病毒載量較低的樣本，3G7抗體可能更容易檢測到H7N9病毒血凝素的存在，從而為早期診斷提供依據(jù)。而2F5和5C6抗體效價(jià)相對較低，為1:6400，但也能滿足一些常規(guī)檢測的需求。通過對比不同效價(jià)抗體在檢測中的表現(xiàn)，可以進(jìn)一步優(yōu)化檢測方法，根據(jù)樣本的特點(diǎn)選擇合適效價(jià)的抗體，提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。特異性是單克隆抗體的關(guān)鍵特性之一。本研究通過間接ELISA法和Westernblot法驗(yàn)證了5株單克隆抗體只與H7N9病毒血凝素抗原發(fā)生特異性結(jié)合，與其他亞型禽流感病毒血凝素抗原及無關(guān)蛋白無明顯反應(yīng)。這種高度特異性使得單克隆抗體在H7N9病毒檢測中具有極高的準(zhǔn)確性，能夠有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。在禽流感病毒檢測中，由于不同亞型病毒之間可能存在一定的抗原交叉性，非特異性抗體可能會導(dǎo)致誤判。而本研究制備的特異性單克隆抗體能夠準(zhǔn)確地區(qū)分H7N9病毒與其他亞型禽流感病毒，為疫情監(jiān)測和防控提供了可靠的檢測工具。例如，在活禽市場或家禽養(yǎng)殖場的病毒檢測中，使用這些特異性單克隆抗體能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出H7N9病毒，及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情隱患，采取相應(yīng)的防控措施，防止疫情的擴(kuò)散。Ig類及亞類鑒定結(jié)果顯示5株單克隆抗體均為IgG1亞類，輕鏈均為κ鏈。IgG1亞類在免疫反應(yīng)中具有重要作用，它能夠通過與抗原結(jié)合，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）等免疫效應(yīng)。在H7N9禽流感的防控中，了解抗體的Ig類及亞類有助于深入研究抗體的作用機(jī)制和免疫功能。例如，在研究抗體對H7N9病毒的中和作用時(shí)，IgG1亞類的特性可能影響抗體與病毒的結(jié)合方式和中和效果。而且，根據(jù)抗體的Ig類及亞類，可以選擇合適的檢測方法和試劑，提高檢測的靈敏度和特異性。在免疫檢測中，針對IgG1亞類的二抗能夠更有效地與單克隆抗體結(jié)合，增強(qiáng)檢測信號，提高檢測的準(zhǔn)確性。中和活性是評估單克隆抗體在治療和預(yù)防H7N9禽流感中潛在應(yīng)用價(jià)值的重要指標(biāo)。本研究中3G7抗體中和效價(jià)最高，達(dá)到1:128，1D3和4H9抗體中和效價(jià)為1:64，2F5和5C6抗體中和效價(jià)為1:32。這些具有中和活性的單克隆抗體能夠阻斷H7N9病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，抑制病毒的感染和復(fù)制。在動物實(shí)驗(yàn)中，將中和抗體注射到感染H7N9病毒的動物體內(nèi)，可能會觀察到病毒載量的降低和動物癥狀的改善。在治療人感染H7N9禽流感患者時(shí)，中和抗體可以作為一種潛在的治療手段，在疾病早期使用，有望減輕患者的病情，提高治愈率。而且，中和抗體還可以用于預(yù)防高風(fēng)險(xiǎn)人群感染H7N9病毒，例如醫(yī)護(hù)人員、家禽養(yǎng)殖人員等，通過被動免疫的方式，提高他們對病毒的抵抗力?？乖砦环治霰砻?株單克隆抗體識別的抗原表位存在差異，1D3、3G7和4H9抗體與已知表位單抗有競爭，2F5和5C6抗體與已知表位單抗無競爭。不同表位的單克隆抗體為研究H7N9病毒血凝素的結(jié)構(gòu)與功能提供了更全面的信息。通過分析不同表位抗體與血凝素的結(jié)合情況，可以深入了解血凝素的抗原結(jié)構(gòu)，明確病毒與宿主細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。這對于疫苗設(shè)計(jì)具有重要意義，例如，針對不同抗原表位設(shè)計(jì)多價(jià)疫苗，可能會提高疫苗的免疫效果，增強(qiáng)對不同變異株的保護(hù)作用。在病毒檢測方法的優(yōu)化中，利用識別不同表位的單克隆抗體建立雙抗體夾心ELISA等方法，可以提高檢測的靈敏度和特異性，減少漏檢和誤檢的發(fā)生。4.3與其他相關(guān)研究的比較在方法方面，本研究采用基因工程表達(dá)H7N9病毒血凝素抗原，與部分研究采用天然病毒提取抗原相比，具有純度高、安全性好的優(yōu)勢。天然病毒提取抗原過程復(fù)雜，且存在病毒污染風(fēng)險(xiǎn)，而基因工程表達(dá)抗原可通過優(yōu)化表達(dá)條件和純化工藝，獲得高純度的抗原，有效避免雜蛋白干擾和病毒污染。在免疫方案上，本研究采用皮下多點(diǎn)注射結(jié)合腹腔注射，初次免疫用弗氏完全佐劑，后續(xù)用弗氏不完全佐劑，與一些僅采用單一注射方式和佐劑的研究不同。這種免疫方式和佐劑組合能夠更有效地刺激小鼠免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，提高抗體效價(jià)和親和力。在細(xì)胞融合技術(shù)上，本研究使用聚乙二醇（PEG，分子量為4000）誘導(dǎo)細(xì)胞融合，與電融合等其他融合技術(shù)相比，PEG融合法操作相對簡便，成本較低，且融合效率能夠滿足實(shí)驗(yàn)需求。在雜交瘤細(xì)胞篩選方面，本研究先利用HAT培養(yǎng)基篩選，再通過間接ELISA法檢測抗體活性，這種篩選方法與一些研究中采用的有限稀釋法結(jié)合免疫熒光法等篩選方法不同。HAT培養(yǎng)基篩選能夠有效去除未融合的細(xì)胞，間接ELISA法檢測抗體活性具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速準(zhǔn)確地篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞。從結(jié)果來看，本研究成功制備的5株單克隆抗體在效價(jià)、特異性、中和活性等方面與其他相關(guān)研究既有相似之處，也存在差異。在抗體效價(jià)上，本研究中3G7抗體效價(jià)達(dá)到1:25600，與部分研究報(bào)道的抗H7N9病毒血凝素單克隆抗體效價(jià)相當(dāng)。在特異性方面，本研究通過間接ELISA法和Westernblot法驗(yàn)證了5株單克隆抗體只與H7N9病毒血凝素抗原發(fā)生特異性結(jié)合，與其他相關(guān)研究中制備的特異性單克隆抗體結(jié)果一致，都具有高度特異性，能夠準(zhǔn)確識別H7N9病毒血凝素抗原。在中和活性方面，本研究中3G7抗體中和效價(jià)最高達(dá)到1:128，與一些研究中報(bào)道的中和抗體效價(jià)相比，處于較好水平。不同研究中中和抗體效價(jià)存在差異的原因可能與抗原制備方法、免疫方案、單克隆抗體識別的抗原表位等因素有關(guān)。在應(yīng)用方面，本研究制備的單克隆抗體可用于H7N9病毒的檢測、防控和治療研究，與其他相關(guān)研究目標(biāo)一致。在檢測方面，可用于建立ELISA、免疫熒光檢測、膠體金免疫層析等多種檢測方法，與其他研究中利用單克隆抗體建立的檢測方法類似，都能夠?qū)崿F(xiàn)對H7N9病毒的快速、準(zhǔn)確檢測。在防控方面，通過研究單克隆抗體與病毒的相互作用，有助于深入了解H7N9病毒的傳播機(jī)制和致病機(jī)理，為制定防控策略提供理論支持，這與其他相關(guān)研究的防控思路相同。在治療研究方面，本研究中具有中和活性的單克隆抗體為H7N9禽流感的治療提供了新的手段，與其他研究中探索單克隆抗體治療禽流感的方向一致。然而，目前單克隆抗體在臨床治療中的應(yīng)用還面臨一些挑戰(zhàn)，如抗體的大規(guī)模生產(chǎn)、成本控制、安全性和有效性評估等，需要進(jìn)一步深入研究和解決。4.4研究的局限性與展望本研究雖成功制備并鑒定了H7N9亞型禽流感病毒血凝素特異性單克隆抗體，但仍存在一定局限性。在抗體應(yīng)用范圍方面，目前主要聚焦于實(shí)驗(yàn)室研究階段，尚未在大規(guī)模臨床樣本檢測和實(shí)際疫情防控中進(jìn)行充分驗(yàn)證。將單克隆抗體應(yīng)用于臨床檢測時(shí)，需要考慮樣本的多樣性和復(fù)雜性，如臨床樣本中可能存在多種干擾物質(zhì)，影響抗體與抗原的結(jié)合，從而降低檢測的準(zhǔn)確性。在實(shí)際疫情防控中，還需考慮檢測方法的便捷性、時(shí)效性和成本效益等因素，以滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。從病毒株覆蓋角度來看，本研究制備的單克隆抗體是針對特定的H7N9病毒毒株A/Anhui/1/2013（H7N9），而H7N9病毒在自然界中不斷進(jìn)化和變異，不同毒株之間的血凝素抗原可能存在一定差異。這些變異可能導(dǎo)致單克隆抗體對部分變異毒株的識別和結(jié)合能力下降，影響其在病毒檢測和防控中的效果。例如，在病毒的傳播過程中，HA基因可能發(fā)生點(diǎn)突變、缺失或插入等變異，使得血凝素的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使抗體無法有效識別。未來研究可從多方面展開。一方面，進(jìn)一步優(yōu)化單克隆抗體制備技術(shù)，提高抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本?？梢蕴剿餍碌募?xì)胞融合技術(shù)或基因工程抗體表達(dá)系統(tǒng)，提高抗體的表達(dá)效率和穩(wěn)定性。例如，利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建抗體庫，篩選出親和力更高、特異性更強(qiáng)的單克隆抗體。另一方面，針對H7N9病毒的變異特性，制備能夠識別多種毒株血凝素抗原的廣譜單克隆抗體。通過分析不同毒株血凝素的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)針對保守區(qū)域的免疫原，免疫動物制備單克隆抗體，有望提高抗體對不同毒株的識別能力。而且，加強(qiáng)單克隆抗體在臨床檢測和疫情防控中的應(yīng)用研究，建立快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測方法，評估其在實(shí)際應(yīng)用中的效果和可行性。與其他檢測技術(shù)（如核酸檢測技術(shù)）聯(lián)合使用，發(fā)揮各自優(yōu)勢，提高H7N9禽流感的檢測和防控水平。五、結(jié)論5.1研究成果總結(jié)本研究成功制備并全面鑒定了H7N9亞型禽流感病毒血凝素特異性單克隆抗體。通過基因工程表達(dá)及鎳離子親和層析純化技術(shù)，獲得了高純度、具有良好活性和免疫原性的H7N9病毒血凝素抗原，其純度達(dá)到93%，血凝活性效價(jià)為1:256，免疫小鼠后血清抗體效價(jià)最高可達(dá)1:16000。利用該抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選和克隆化，成功獲得了5株能夠穩(wěn)定分泌抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞系（1D3、2F5、3G7、4H9和5C6）。通過腹水制備法和Pro