實(shí)驗(yàn)細(xì)胞骨架的觀察.ppt

實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞骨架的觀察,一、考馬斯亮蘭R250染色法,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握用考馬斯亮藍(lán)R250（Coomassie blue R250）染色法觀察植物細(xì)胞骨架的方法。,【實(shí)驗(yàn)原理】,細(xì)胞骨架是指存在于真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系。其概念具有狹義和廣義之分：狹義的細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)骨架包括微絲、微管和中間纖維；廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)。核骨架、核纖層與中間纖維在結(jié)構(gòu)上相互連接，貫穿于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的網(wǎng)架體系。,【實(shí)驗(yàn)原理】,細(xì)胞骨架(Cytoskeleton) 組成：主要包括微管、微絲和中間纖維以及核骨架-核纖層體系。微管主要分布在核周圍，呈放射狀向四周擴(kuò)散，微絲主要分布于細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)，而中間纖維則分布在整個細(xì)胞中。 細(xì)胞骨架作用：具有維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性、參與細(xì)胞運(yùn)動、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞和細(xì)胞分裂等重要功能。 細(xì)胞骨架的研究方法：考馬斯亮蘭R250染色法、熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色法、間接免疫熒光法等。,考馬斯亮蘭R250染色法的原理：考馬斯亮藍(lán)R250可以對各種蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。細(xì)胞骨架有一個特性，即用非離子去垢劑（如Triton X-100）處理時，可以保持非溶解狀態(tài)。當(dāng)用這類試劑處理細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)其它可溶性的物質(zhì)和膜成分都被抽提出來，只留下細(xì)胞骨架?？捡R斯亮藍(lán)R250雖不能對微絲進(jìn)行特異性染色，但當(dāng)其它蛋白成分被抽提后，就能清晰地顯示微絲束的形態(tài)。,Triton X-100,SDS,實(shí)驗(yàn)器材、材料和試劑,光學(xué)顯微鏡；燒杯、吸管、鑷子、玻片染色缸、載玻片、蓋玻片； 新鮮洋蔥;,6mM磷酸鹽緩沖液（pH6.8）、M緩沖液、1%Triton X-100、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250、3%戊二醛。,3%戊二醛用PBS配制,實(shí)驗(yàn)步驟,1、撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮(約1平方厘米)置于35ml pH6.8 磷酸緩沖液中待其下沉(燒杯1) ；對照無PBS處理； 2、用35ml 1%Triton X-100處理20 min(燒杯2) ；對照無1%Triton X-100的M緩沖液處理20min; 3、吸去Triton X-100，用M緩沖液35ml洗2次，每次5 min (燒杯3) ；對照無M緩沖液處理; 4、 35ml 3%戊二醛固定20 min(燒杯4) ； 5、pH6.8磷酸緩沖液35ml洗2次，每次5 min，濾紙吸去殘液(燒杯1) ； 6、 35ml 0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色15和30分鐘，然后用蒸餾水小心沖洗12次(燒杯5) ；做染色時間的