論基于溶膠－凝膠固定技術(shù)的生物組織傳感器

基于溶膠凝膠固定技術(shù)的生物組織傳感器宣俊 陳利興 許長(zhǎng)流（中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院2000級(jí)，廣州）指導(dǎo)老師：蔡沛祥教授摘要：報(bào)道一個(gè)關(guān)于制備生物組織傳感器的新技術(shù)，將溶膠凝膠與植物液汁按一定比例結(jié)合，使天然植物中的多酚氧化酶被固定于溶膠凝膠中，將其滴涂于預(yù)先涂有一層Nafion膜的鉑盤電極表面，構(gòu)成帶有Nafion溶膠凝膠植物液汁的復(fù)合修飾膜的生物傳感器，用于測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺。采用循環(huán)伏安法和線性掃描伏安法考察了傳感器的電化學(xué)特性,比較了不同植物品種、不同組織位置的生物催化活性，研究了乙醇用量、水酯比、植物液汁用量等因素的影響，考察了Nafion膜的防干擾功能。采用差示脈沖伏安法對(duì)多巴胺進(jìn)行定量分析，線性范圍為210-6110-4mol/L,檢出限為8.010-7mol/L。與傳統(tǒng)的組織電極相比，本傳感器具有一系列特點(diǎn)。關(guān)鍵詞： 溶膠-凝膠，固定化技術(shù)，植物組織傳感器，多巴胺1、前言多巴胺（DA）是人體一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其濃度的大小可直接引發(fā)起人體的一些精神性疾病。如：抑郁癥、老年癡呆、帕金森等。因此，為了更準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)多巴胺濃度的大小，人們從多方面對(duì)其進(jìn)行研究。生物傳感器是化學(xué)傳感器的一個(gè)分支。生物傳感器成功的關(guān)鍵是生物材料固定技術(shù)。組織電極（包括植物組織電極、動(dòng)物組織電極）是生物傳感器的一種。植物組織電極問(wèn)世于八十年代初，是利用天然植物中存在的酶直接作為生物催化劑的一種生物傳感器。從文獻(xiàn)可以看到，以往人們對(duì)植物組織電極的研究，從電極結(jié)構(gòu)來(lái)看，主要有切片組織電極和碳糊電極兩種類型。切片的組織電極采用夾心面包式的物理固定法將植物組織切片固定，需要特定的基礎(chǔ)電極（如O2電極、NH3電極等）作為轉(zhuǎn)換器，組裝時(shí)還需要在組織片與基礎(chǔ)電極之間設(shè)置透氣膜，在組織片外加上保護(hù)網(wǎng)等，電極的制作比較繁瑣。碳糊電極的制作比較簡(jiǎn)單。只要將植物組織磨成漿，按一定的比例與石墨粉混合調(diào)成碳糊，填入電極桿下端，磨平后即可使用。雖然碳糊電極制作簡(jiǎn)單，但是生物活性物質(zhì)易從電極表面流失，而且碳糊在溶液中浸泡時(shí)容易松散脫落，更經(jīng)不起攪拌時(shí)溶液的沖擦。基于以上兩種電極的存在問(wèn)題，我們提出了關(guān)于植物組織電極固定生物材料的新技術(shù)溶膠凝膠技術(shù)。溶膠凝膠玻璃是由烷氧基硅烷(如Si(OCH3)4)或類似的有機(jī)金屬烷氧化物(如異丙氧基鈦或異丙氧基鋁)在常溫下水解和縮聚而成的透明的玻璃狀物質(zhì)。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的硅烷聚合物能包埋各種生物活性物質(zhì)，并能讓它們?cè)诳紫吨凶杂傻匾苿?dòng)或與孔隙內(nèi)表面的硅醇基團(tuán)進(jìn)行某種程度上的相互作用。溶膠凝膠材料具有物理剛性、化學(xué)惰性、高熱穩(wěn)定性和輕微溶脹性，它的低溫聚合過(guò)程的特點(diǎn)更是有利于生物材料的固定。實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)不同植物組織汁進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各種植物組織中，以蘋果內(nèi)部組織最好，且用同一根生物電極可多次重復(fù)檢測(cè)不同濃度的待測(cè)樣品，具有較好的實(shí)驗(yàn)研究?jī)r(jià)值。2、研究?jī)?nèi)容2.1 儀器和試劑CHI 750A型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），超聲波清洗器（明珠電器有限公司），三電極系統(tǒng)：所研制的多巴胺傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。正硅酸乙酯（TEOS，Aldrich公司），Triton X-100（Research公司），Nafion-117（5%的乙醇溶液，F(xiàn)luka公司），鹽酸多巴胺（DA，Sigma公司），鹽酸多巴胺注射液（江蘇林海藥業(yè)有限公司制造分公司），鹽酸腎上腺素注射液（EP，廣州明興制藥廠），抗壞血酸（維生素C藥片，AA，廣東華南制藥廠）。以0.1mol/L Na2HPO4-0.1mol/L KH2PO4緩沖溶液（PBS，pH=7.4）為測(cè)試底液。試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。2.2 二氧化硅溶膠凝膠的制備將60LTEOS、410L水、12L0.1mol/L HCL和2滴 Triton X-100混合，室溫下超聲振蕩1h，使其形成均勻澄清的溶膠，然后在電冰箱中放置23h。使用前用0.01mol/L NaOH中和約等于pH=7.4。2.3 多巴胺傳感器的制備將鉑盤電極（1mm）在金相砂紙上打磨拋光，依次在HNO3（1:1）、丙酮和雙蒸水中超聲清洗15min，清洗后的電極置于室溫下晾干備用。用微量注射器將5L含體積分?jǐn)?shù)為5% Nafion的乙醇溶液滴涂于電極表面，室溫下晾干備用。將100L蘋果汁加到已制好的二氧化硅溶膠中，充分振蕩均勻。用微量注射器吸取5L蘋果汁溶膠-凝膠，滴涂于已經(jīng)用Nafion修飾的干燥的鉑盤電極表面，室溫下晾干待測(cè)。2.4 實(shí)驗(yàn)方法電化學(xué)測(cè)量采用三電極系統(tǒng)，以所研制的植物電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。0.1mol/L Na2HPO4-0.1mol/L KH2PO4緩沖溶液（PBS，pH=7.4）為測(cè)試底液。采用循環(huán)伏安法（CV）研究傳感器的電化學(xué)特性，采用示差脈沖伏安法（DPV）對(duì)DA進(jìn)行定量分析。除另有說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)所用的多巴胺溶液的濃度為CDA=1.0510-3mol/L。2.5 實(shí)驗(yàn)原理許多植物組織中都含有多酚氧化酶，它能催化多巴胺，在電極上氧化成醌式產(chǎn)物。而氧化產(chǎn)物又能在電極上還原，當(dāng)對(duì)電極進(jìn)行電位循環(huán)掃描時(shí)可以獲得多巴胺的氧化和還原電流峰。實(shí)驗(yàn)表明用蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極對(duì)多巴胺溶液進(jìn)行循環(huán)伏安法電位掃描時(shí)，得到氧化還原電流峰（圖1，a,b），而不含植物組織的溶膠凝膠電極和裸電極所產(chǎn)生的CV曲線顯得平緩(圖1，c,d)。又用蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極對(duì)PBS底液進(jìn)行循環(huán)伏安法電位掃描，得到的CV曲線顯得平緩（圖1，e）。從修飾電極對(duì)多巴胺溶液的循環(huán)伏安響應(yīng)曲線可以看到，它的陽(yáng)極峰電位是0.337V，陰極峰電位是0.154V。證明蘋果汁中的酶對(duì)多巴胺的電極過(guò)程起了催化氧化的作用。圖1 多巴胺伏安圖a Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極對(duì)DA的響應(yīng)b蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極對(duì)DA的響應(yīng)c不含植物組織的溶膠-凝膠電極對(duì)DA的響應(yīng)d裸電極對(duì)DA的響應(yīng) e Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極在PBS底液中3、實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化、選擇及討論3.1 植物組織的選擇(一) 植物種類的選擇分別提取蘋果、番茄、土豆、白菜、紫荊花、龍船花和琵琶果的液汁加入溶膠凝膠里面制成傳感器，以循環(huán)伏安法觀察響應(yīng)電流，發(fā)現(xiàn)由以上各種植物制得的傳感器都有響應(yīng)電流，說(shuō)明各種植物都含有能對(duì)多巴胺起催化作用的氧化酶。測(cè)量數(shù)據(jù)如表1：表1 不同植物品種的催化效果比較植物種類 ipc/A番茄 2.588E-07紫荊花 3.475E-07白菜 3.926E-07琵琶果 4.218E-07土豆 6.358E-07龍船花 1.147E-06蘋果 1.385E-06從響應(yīng)電流峰的高低來(lái)看，蘋果和龍船花的提取液較適合作為研究對(duì)象，其他植物的提取液響應(yīng)不夠靈敏，而且有些植物（如土豆）提取不夠方便，液汁中淀粉質(zhì)過(guò)多，不利于溶膠凝膠對(duì)液汁中酶的包埋，影響修飾電極的使用。而龍船花提取液雖然響應(yīng)較好，但收集原料較困難，因此決定以蘋果作為研究對(duì)象。(二) 蘋果種類部位的選擇取兩種不同種類的蘋果：香蕉蘋果和紅富士蘋果，分別取其外、中、內(nèi)層果肉做對(duì)比實(shí)驗(yàn)（表2）。表2 蘋果中不同部位催化效果比較蘋果的不同部位 ipc/A香蕉蘋果外層 5.194E-07香蕉蘋果中層 8.915E-07香蕉蘋果內(nèi)層 1.096E-06富士蘋果外層 7.953E-07富士蘋果中層 8.917E-07富士蘋果內(nèi)層 2.383E-06紅富士蘋果提取液制得的修飾電極的響應(yīng)峰電流普遍比香蕉蘋果的高；而外、中、內(nèi)層果肉提取液的修飾電極的響應(yīng)依次增大，決定以紅富士蘋果的內(nèi)層果肉作為植物組織液汁的來(lái)源。3.2 溶膠凝膠配比的選擇(一) 乙醇加入量的選擇在配制溶膠凝膠時(shí)加入乙醇量的多少與響應(yīng)電流峰高低有關(guān)，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，得到表3數(shù)據(jù)。表3 乙醇加入量對(duì)傳感器性能的影響乙醇加入量/L ipc/A0 2.412E-0720 1.402E-0740 1.474E-07乙醇量加得少，響應(yīng)峰電流比較高，不加乙醇時(shí)的響應(yīng)峰電流最高。因此決定在配制溶膠凝膠時(shí)不加乙醇。原因是乙醇會(huì)損害酶的活性。（二） 水酯比R的確定水酯比R指凝膠中水和硅酯類量的比值。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，水與硅酯的比值大于4時(shí)，能加速硅酯鍵的水解，易形成分子量大的網(wǎng)狀聚合物，聚合物的空隙度和比表面積較大。這類聚合物對(duì)生物活性物質(zhì)的包埋與固定有利。當(dāng)比值小于4時(shí)，硅酯鍵水解不充分，易形成分子量小、鏈狀的聚合物。此時(shí)聚合物的網(wǎng)孔較小，不利于酶或蛋白質(zhì)的固定。當(dāng)水酯比R在610的范圍內(nèi)，R值越大，酶的固定越好。分別配置水酯比R為510的溶膠凝膠，制成傳感器作平行測(cè)量對(duì)比如表4。表4 水酯比對(duì)傳感器性能的影響R ipc/A4 7.637E-075 8.811E-076 1.042E-067 1.291E-068 1.184E-069 1.357E-0610 9.634E-07可見(jiàn)當(dāng)R9時(shí)峰電流最大，決定采用這個(gè)比例。（三）、溶膠凝膠中植物液汁包埋量的選擇向溶膠凝膠中加入蘋果汁量的多少也會(huì)影響測(cè)定多巴胺的效果，蘋果汁加入量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5。表5 蘋果汁用量對(duì)傳感器性能的影響蘋果汁加入量（占溶膠的比例） ipc/A二分之一 5.580E-07三分之一 7.329E-07四分之一 8.578E-07五分之一 1.039E-06六分之一 1.779E-06八分之一 1.234E-06十分之一 9.668E-07在一定比例范圍內(nèi)，相應(yīng)修飾電極的峰電流隨蘋果汁加入量的增多而增大，但蘋果汁加得過(guò)多的時(shí)候相應(yīng)的峰電流反而下降。根據(jù)峰電流的高低決定蘋果汁的加入量（V/V）為1/6（即若最后配得的溶膠凝膠體積為600單位，則所含蘋果汁的量為100單位）。3.3 電位掃描條件的確定(一) 掃描速度的選擇討論修飾電極工作時(shí)多巴胺在電極上的富集過(guò)程是靠擴(kuò)散控制還是受吸附控制（因?yàn)槿糁苽潆姌O時(shí)所用蘋果汁含淀粉質(zhì)比較多時(shí)會(huì)出現(xiàn)吸附富集的現(xiàn)象）。兩種情況下掃描速度對(duì)峰電流的影響有所不同。在不同的掃描速度下測(cè)得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。表6掃描速度的影響 v/V s-1v1/2峰電流/A0.0500.223611.22E-060.0750.273861.32E-060.1000.316231.45E-060.1250.353551.65E-060.1500.387301.85E-060.1750.418332.10E-060.2000.447212.33E-06可見(jiàn)峰電流與掃描速度的平方根的關(guān)系并不是正比關(guān)系，也就是說(shuō)，多巴胺在電極上的富集是由吸附控制的。本實(shí)驗(yàn)所選擇的實(shí)驗(yàn)掃描速度為100mV/s。(二) 停留時(shí)間的影響在進(jìn)行陰極掃描之前，于0.6V下，停留時(shí)間對(duì)響應(yīng)峰電流的峰高有影響。設(shè)定不同停留時(shí)間（2s,5s,10s,15s,20s,25s）,分別測(cè)定同一多巴胺樣品得表7數(shù)據(jù)。表7 靜止時(shí)間對(duì)傳感器性能影響靜止時(shí)間/sipc/A26.059E-0756.469E-07107.214E-07157.507E-07207.551E-07257.004E-07停留時(shí)間對(duì)響應(yīng)電流的影響也進(jìn)一步證實(shí)了電極過(guò)程具有吸附特性。當(dāng)停留20s時(shí)，多巴胺的響應(yīng)峰電流響應(yīng)較高，決定停留時(shí)間定為20s。（三）、電位掃描范圍的選擇確定起始電位為-0.2v，在不同的上限電位下掃描峰電位也有較大影響。如表8，分別采用不同的上限電位測(cè)量同一樣品得到的結(jié)果。 表8 上限電位對(duì)傳感器性能影響上限電位/vipc/A0.42.915E-070.66.531E-070.89.184E-071.01.586E-061.22.263E-06可見(jiàn)峰電流隨上限電位增加而趨于增大，考慮到窄電位掃描可排除某些物質(zhì)的干擾，最后將掃描電位定在-0.2v -0.6v。4、多巴胺傳感器的選擇性4.1 抗壞血酸(AA)干擾消除 AA的消除：由于抗壞血酸(AA) 的氧化電位與DA接近，嚴(yán)重干擾測(cè)量。對(duì)此，我們?cè)谥参锶苣z凝膠電極上修飾一層Nafion膜。因?yàn)樵谏韕H條件下，(本實(shí)驗(yàn)用PBS緩沖液) ，DA為陽(yáng)離子，而AA為陰離子，利用Nafion膜磺酸根陰離子與AA陰離子的排斥作用，可以較好地消除AA對(duì)DA的測(cè)量，如圖3。 圖3修飾電極對(duì)AA的響應(yīng)a-蘋果汁-溶膠-凝膠電極對(duì)AA的響應(yīng)b-Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠電極對(duì)AA的響應(yīng)如圖4: 曲線a為普通植物電極對(duì)DA的響應(yīng)曲線，曲線b為沒(méi)加Nafion膜電極所測(cè)得DA與AA混合溶液的響應(yīng)曲線，可見(jiàn)AA對(duì)DA起了很大的干擾。對(duì)此，利用Nafion膜后，在DA與AA混合溶液中測(cè)量得曲線c，結(jié)果表明，加了Nafion膜后可較好地消除AA對(duì)DA干擾。圖4 修飾電極在DA、DA與AA混合溶液的響應(yīng)a-蘋果汁-溶膠-凝膠電極對(duì)DA的響應(yīng) b-蘋果汁-溶膠-凝膠電極在DA和AA混合溶液中的響應(yīng)c-Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠電極在DA和AA混合溶液中4.2 腎上腺素干擾消除由于腎上腺素（EP）和DA都是常存在于生物體內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)此我們向DA溶液加進(jìn)一定量的腎上腺素，考察其對(duì)DA有沒(méi)有干擾（圖5）。結(jié)果表明添加了Nafion膜的組織電極能排除EP對(duì)DA的干擾。 圖5 Nafion膜對(duì)EP干擾的排除a-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極在EP中b-Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極在EP中c-Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極在DA和EP混標(biāo)中5、分析應(yīng)用配制一系列濃度的多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用示差脈沖伏安法及利用Nafion-蘋果汁溶膠凝膠修飾電極對(duì)多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制工作曲線（圖6）。結(jié)果表明，多巴胺濃度在210-6 mol/L110-4 mol/L范圍內(nèi)響應(yīng)電流呈良好的線性關(guān)系。吸取多巴胺針劑溶液30L，用PBS定容配成25mL（即多巴胺濃度為6.3310-5 mol/L）。用本傳感器進(jìn)行定量分析，測(cè)得多巴胺的濃度為6.5810-5 mol/L，實(shí)驗(yàn)誤差為3.9%。參考文獻(xiàn)1 蔡沛祥，黃昊，余新志，聶兵，“對(duì)多巴胺敏感的植物組織碳糊生物電極的改進(jìn)”， 傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，1996,3, (1)：75-782 唐尹平，成鳳桂，“Sol-Gel固定法制作生物傳感器應(yīng)用及發(fā)展”，中南民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，3，19(1):89-933 何星存，李平，莫金垣，“用修飾電極導(dǎo)數(shù)伏安法同時(shí)測(cè)定多巴胺和腎上腺素”，分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2000，1，19(1):19-214 汪振輝，郟建波，李工安，周漱萍，“多巴胺在聚茶堿Nafion雙層修飾玻碳電極上的電化學(xué)行為”，分析化學(xué)，2000,5,28(5):568-5725 鄧家祺，方躍，“植物組織電極”，化學(xué)傳感器，1990，10(3)：5-106 沈國(guó)勵(lì)，陳光焰，水冰，“土豆組織膜兒茶酚電極的研究”，分析化學(xué)，1990，18(4)：315-319A Tissue Biosensor Based On Sol-gel Immobilization TechniqueXuan Jun, Chen Lixing, Xu Changliu(Class 2000, School of Chemistry and Chemical Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou )Advisor: Cai Peixiang, ProfessorAbstract：In this paper, a new technique on preparation of biosensor is reported. SiO2 sol-gel and plant juice are mixed a certain proportion to make the enzyme from nature plant immobilized in the SiO2 sol-gel film. The dopamine biosensor is prepared from a platinum electrode coated with a Nafion film and then the midified SiO2 sol-gel layer.Cyclic voltammetry(CV) and Linear scan voltammetry are used to investigate the electrochemical characteristics of the sensor. The catalysis eff