高效液相色譜HPLC簡(jiǎn)介.ppt

高效液相色譜（HPLC）簡(jiǎn)介,盛 衛(wèi) 堅(jiān),目 錄,1, 液相色譜分析法的發(fā)展 2, 高效液相色譜的特點(diǎn) 3, 高效液相色譜儀簡(jiǎn)介 4, 液相色譜法介紹 5, 分析方法的選擇 6, 實(shí)際分析操作過(guò)程,1、液相色譜分析法的發(fā)展,20世紀(jì)初： 俄國(guó)植物學(xué)家茨維特提出經(jīng)典液相色譜法。經(jīng)典液相色譜法包括柱色譜、薄層色譜、紙色譜。 20世紀(jì)60年代末： 隨著色譜理論的發(fā)展、高效細(xì)微固定相的開(kāi)發(fā)、高壓恒流泵及高靈敏度檢測(cè)器的應(yīng)用，高效液相色譜法得到了突破性的發(fā)展。,2.1 HPLC的特點(diǎn)（一）,2 HPLC的特點(diǎn),.2 HPLC的特點(diǎn)（二）,3、液相色譜儀簡(jiǎn)介,貯液罐A 高壓輸液泵A 阻尼器A 貯液罐B 高壓輸液泵B 阻尼器B 初步混合器 壓力傳感器 混合器 進(jìn)樣器 色譜柱 檢測(cè)器 譜圖輸出,3.1 高效液相色譜儀構(gòu)造,3.2 高壓輸液泵簡(jiǎn)介,高壓輸液泵的一般要求： 泵體材料耐酸、耐堿、耐化學(xué)腐蝕； 耐壓40 50MPa，能連續(xù)工作； 輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性佳； 輸出流量范圍寬，對(duì)填充柱：0.1 100mLmin。,注射型泵-輸出精確，無(wú)脈動(dòng)，需更換溶劑而中斷工作。 恒流泵 往復(fù)型泵-造價(jià)低廉，溶劑更換方便，但存在脈動(dòng)。 恒壓泵-壓力恒定，但流量不恒定；,3.3 阻尼器介紹,阻尼器-消除、減輕往復(fù)式柱塞泵輸出的壓力脈動(dòng)。,3.4.1 檢測(cè)器簡(jiǎn)介（一）, 紫外吸收檢測(cè)器（UVD） 原理：用特定波長(zhǎng)的紫外光照射樣品池，通過(guò)檢測(cè)透光率的變化來(lái)測(cè)定樣品濃度的檢測(cè)器。它具有波長(zhǎng)固定，波長(zhǎng)可變和光二極管陣列三種類(lèi)型。 特點(diǎn)：選擇性檢測(cè)器、對(duì)流量和溫度敏感性低、靈敏度較高（10-9g）。 折光指數(shù)檢測(cè)器（RID） 原理：監(jiān)測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率之差來(lái)測(cè)量試樣濃度的檢測(cè)器。 特點(diǎn)：通用性檢測(cè)器，溫變化要保持在0.001、靈敏度低（10-6g）。,3.4.2 檢測(cè)器簡(jiǎn)介（二）, 電導(dǎo)檢測(cè)器（ECD） 原理：監(jiān)測(cè)溶液的電導(dǎo)率變化的檢測(cè)器。 特點(diǎn)：選擇性檢測(cè)器、測(cè)量時(shí)要求恒溫、對(duì)流動(dòng)相的組成變化有明顯響應(yīng)、靈敏度低（10-3g）。適用于離子型化合物。 熒光檢測(cè)器（FLD） 原理：某些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見(jiàn)光（熒光）的性質(zhì)檢測(cè)。 特點(diǎn)：選擇性檢測(cè)器、靈敏度高（10-12g）、對(duì)流量和溫度敏感性低。,3.4.3 檢測(cè)器簡(jiǎn)介（三）, 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD） 原理：通過(guò)檢測(cè)光散射程度而測(cè)定溶質(zhì)濃度的檢測(cè)器。色譜柱后流出物在通向檢測(cè)器途中，被高速載氣（氮?dú)猓﹪姵伸F狀液滴，再進(jìn)入蒸發(fā)漂移管中，流動(dòng)相不斷蒸發(fā)，含溶質(zhì)的霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過(guò)檢測(cè)器。在檢測(cè)器中，光被散射的程度取決于溶質(zhì)顆粒的大小與數(shù)量。 特點(diǎn)：消除了溶劑的干擾，不受溫度變化影響，靈敏度高，是通用型檢測(cè)器。,4、色譜分析法簡(jiǎn)介,液固色譜-以固體吸附劑為固定相，依靠吸附脫附平衡實(shí)現(xiàn)分離，常用的固定相有碳酸鈣、硅膠、三氧化二鋁、氧化鎂、活性炭等。 特點(diǎn)：有時(shí)會(huì)發(fā)生不可逆吸附，應(yīng)用受到限制。 液液色譜-以吸附載帶在惰性固相載體上的極性或非極性固定液為固定相，依靠溶解解吸平衡實(shí)現(xiàn)分離。 特點(diǎn)：固定液可選擇余地大，重現(xiàn)性、分離效果好。,4.1.1 色譜分析法介紹（一）,4.1.2 色譜法簡(jiǎn)介（二）,體積排阻色譜法-以多孔性凝膠為固定相，借助多孔性凝膠孔徑的大小，使樣品中的大分子不能進(jìn)入凝膠孔洞而完全被排阻，只能沿凝膠粒子之間的空隙通過(guò)色譜柱，而首先被洗脫出來(lái)。被分析樣品可按分子的相對(duì)大小分別先后流出。 特點(diǎn)：洗脫時(shí)間短，但不適于分離組成復(fù)雜的混合物。 適用范圍：分子量差別較大的樣品。 離子對(duì)色譜法-分析離子化的強(qiáng)極性化合物。 親和色譜法等等,4.1.3 色譜法簡(jiǎn)介（三）, 鍵合相色譜法簡(jiǎn)介 鍵合相色譜-是由液液色譜發(fā)展起來(lái)的，在高效液相色譜法中占有極其重要的地位。將有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，生成化學(xué)鍵合固定相，解決固定液的流失問(wèn)題,是目前用的最多的一種色譜分析法。 根據(jù)鍵合固定相與流動(dòng)相相對(duì)極性的強(qiáng)弱，分為正相鍵合相色譜法與反相鍵合相色譜法。 正相鍵合相色譜-固定相極性強(qiáng)； 反相鍵合相色譜-固定相極性弱。,.2.1 色譜柱簡(jiǎn)介（一）,正相柱-固定相通常為硅膠以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán)，如（NH2）和氰基團(tuán)（CN）的鍵合相填料。 由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。 反相柱-固定相通常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱官能團(tuán)的鍵合相。反向色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。,4.2.2 色譜柱簡(jiǎn)介（二）,聚合物填料柱-通常為聚苯乙烯二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等. 優(yōu)點(diǎn)：PH值為114均可使用；具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。 缺點(diǎn)：色譜柱柱效較低。 其它無(wú)機(jī)填料柱-如石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。由于在HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解，這類(lèi)柱可在任何PH與溫度下使用，石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可以在PH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。,4.2.3 色譜柱簡(jiǎn)介（三）,手性柱-將手性聚合物共價(jià)鍵和到硅膠上，實(shí)現(xiàn)外消旋物的廣泛分離。如下圖：,特點(diǎn)：具有專(zhuān)一性、通用性不廣。 價(jià)格較貴。,5、分析方法的建立,5.1 色譜柱的選擇： 疏水性的樣品反相鍵合色譜； 親水性的樣品正相鍵合色譜； 生物大分子 體積排阻色譜； 無(wú)機(jī)離子化合物離子對(duì)色譜； 高分子聚合 凝膠色譜； 同系物的分離吸附、分配和鍵合色譜； 同分異構(gòu)體 雙鍵或取代基異構(gòu)用吸附色譜； 多環(huán)芳烴異構(gòu)選用反相鍵合； 對(duì)映異構(gòu)體 流動(dòng)相加入手性選擇劑或具有光學(xué)活性的固定相。,5.2 流動(dòng)相、配比、流量、梯度洗脫的選擇,根據(jù)分析樣品的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，結(jié)合色譜分析法確定流動(dòng)相。 為達(dá)到較好的分離效果，確定流動(dòng)相配比。 流動(dòng)相的總流量增加，通常柱效增加。 梯度洗脫-在洗脫過(guò)程中連續(xù)或間斷的改變流動(dòng)相的組成，來(lái)改善分析效果的技術(shù)。適用范圍：當(dāng)樣品中溶質(zhì)組分較多及不同溶質(zhì)的性質(zhì)差別較大時(shí)。 特殊要求：當(dāng)分析弱酸、弱堿性化合物時(shí)，可通過(guò)采用緩沖溶液及調(diào)節(jié)流動(dòng)相的Ph值來(lái)改善峰型。,5.3 樣品組分保留值和容量因子的選擇,1. 分析時(shí)間控制在1030min ； 2. 容量因子控制在110，對(duì)于復(fù)雜的樣品，容量因子范圍較寬的通常使用梯度洗脫技術(shù)。 容量因子定義：調(diào)整保留時(shí)間與死時(shí)間之比，即可表示為: 3. 相鄰組分分離度的要求： 對(duì)于難分離的樣品,要求分離度R1.0。,6、樣品分析方法介紹,1，流動(dòng)相的準(zhǔn)備 流動(dòng)相的選擇-有機(jī)相（甲醇、乙腈）與水（去離子水、緩沖溶液） 流動(dòng)相的過(guò)濾-用孔徑為0.45m濾膜過(guò)濾除去固體顆粒雜質(zhì)。 流動(dòng)相的脫氣-超聲脫氣、吹氦脫氣、加熱回流法、抽真空脫氣法、在線真空脫氣法。 2，樣品的準(zhǔn)備 稱(chēng)量、用流動(dòng)相超聲溶解、過(guò)濾。,6.1 流動(dòng)相及樣品的準(zhǔn)備,流動(dòng)相過(guò)濾器 樣品過(guò)濾器,6.2 分析方法的設(shè)定,流動(dòng)相的配比及流量-選擇何種有機(jī)相，純水或緩沖溶液，有機(jī)相與水相的比例，流動(dòng)相的總流量。 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的確定-通過(guò)測(cè)定被分析樣品的