GB5413.17-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定.pdf

中華人民共和國國家標準中華人民共和國國家標準GB 5413.172010中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定 National food safety standard Determination of pantothenic acid in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.172010 I 前 言 本標準第一法為等同采用國際分析家學會（AOAC）945.74 Pantothenic Acid in Vitamin Preparations。 本標準代替GB/T 5413.17-1997嬰幼兒配方食品和乳粉 泛酸的測定。 本標準與GB/T 5413.17-1997相比，第一法主要變化如下： 增加了 tris 緩沖液配制方法； 確定了測定波長； 增加了標準曲線繪制的文字描述。 第二法主要變化如下： 更換了色譜柱； 改變了流動相； 增加了含淀粉類試樣進行酶解的處理方法。 本標準的附錄A為資料性附錄。 本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.17-1997。 GB 5413.172010 1 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定 1 范圍 本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定方法。 本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定。 2 規(guī)范性引用文件 本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。 第一法 微生物法 3 原理 利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 8014 對泛酸的特異性，在含有泛酸樣品中生長產(chǎn)生的酸度和形成的光密度來測定泛酸的含量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純試劑，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級水。 4.1 0.9 %生理鹽水：9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 mL 水中，分裝于具塞試管中，每管 10 mL，121 滅菌15 min。每周準備一次。 4.2 泛酸鈣標準品。 4.3 乙酸溶液（0.2 mol/L）：吸取 12 mL 冰乙酸用水稀釋至 1000 mL。 4.4 甲苯（C7H8）。 4.5 乙酸鈉溶液（0.2 mol/L）：溶解 16.4 g 無水乙酸鈉于水中，稀釋至 1000 mL。 4.6 菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 8014。 4.7 培養(yǎng)基 4.7.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：光解胨 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀2 g，聚山梨糖單油酸酯 1 g，瓊脂 10 g，加蒸餾水至 1000 mL，調(diào) pH 至 6.8 0.2（20 25 ）。 4.7.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：光解胨 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀2 g，聚山梨糖單油酸酯 1 g，加蒸餾水至 1000 mL，調(diào) pH 至 6.8 0.2（20 25）。 4.7.3 泛酸測定用培養(yǎng)基：葡萄糖 40 g，乙酸鈉 20 g，無維生素酸水解酪蛋白 10 g，磷酸氫二鉀 1 g，磷酸二氫鉀 1 g，L-胱氨酸 0.4 g，L-色氨酸 0.1 g，硫酸鎂 0.4 g，氯化鈉 20 mg，硫酸亞鐵 20 mg，硫酸錳 20 mg， 硫酸腺嘌呤 20 mg， 鹽酸鳥嘌呤 20 mg， 尿嘧啶 20 mg， 胡蘿卜素 400 g， 鹽酸硫胺素 200 g，GB 5413.172010 2 生物素 0.8 g，p-氨基苯甲酸 200 g，煙酸 1 mg，鹽酸吡哆醇 800 g，聚山梨糖單油酸酯 0.1 g，加蒸餾水至 1000 mL，調(diào) pH 至 6.70.1（20 25 ）。 4.8 Tris 緩沖液：稱取 24.2 g Trizma Base 于燒杯中，加 200 mL 水溶解。 4.9 鹽酸（0.1 mol/L）：吸取 8.3 mL 鹽酸，用水稀釋至 1000 mL。 4.10 標準溶液 4.10.1 泛酸標準貯備液（40 g/mL）：精確稱取 45 mg55 mg 泛酸鈣標準品（4.2），溶入 500 mL蒸餾水中，加 10 mL 乙酸溶液 （4.3），加 100 mL 乙酸鈉溶液（4.5），用水稀釋至泛酸鈣精確濃度為43.47 g/mL（即泛酸濃度為 40 g/mL），加 0.5 mL 甲苯（4.4）貯于 2 4 冰箱中，保存期為 4個月。 4.10.2 泛酸中間貯備液（1 g/mL）：取 25 mL 標準貯備液（4.10.1），加入蒸餾水 500 mL，乙酸溶液 10 mL（4.3），乙酸鈉溶液 100 mL（4.5），再用水稀釋至 1 L。加 0.5 mL 甲苯（4.4）貯于冰箱中（2 4 ），保存期為 1 個月。 4.10.3 泛酸標準工作液（10 ng/mL，5 ng/mL）：吸兩次 5.0 mL 中間貯備液（4.10.2），分別用水定容至 500 mL 和 1000 mL，臨用前配制。 5 儀器和設備 5.1 分光光度儀。 5.2 pH 計：精度為 0.01。 5.3 渦旋振蕩器。 5.4 天平：感量 0.1 mg。 5.5 生化培養(yǎng)箱：36 0.5 。 5.6 離心機：轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘。 6 分析步驟 6.1 測試菌液的制備 6.1.1 把植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 8014 凍干菌粉轉(zhuǎn)入乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（4.7.2）試管中，36 1 培養(yǎng) 24 h。再轉(zhuǎn)接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（4.7.1）試管中，36 1 培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)好的乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（4.7.1）試管的培養(yǎng)物作為貯備菌種。 6.1.2 從貯備菌種培養(yǎng)基上分別轉(zhuǎn)接到三個乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（4.7.1）試管中，放入培養(yǎng)箱中 36 1 培養(yǎng) 24 h。每月轉(zhuǎn)接一次，作為月接種管貯于冰箱中。每月定期從月接種管中重新接種 3 個轉(zhuǎn)接管保存新菌株。 6.1.3 從月接種的培養(yǎng)管中的一支再接種一支乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （4.7.1） 試管， 36 1 培養(yǎng) 24 h，作為日接種管每日測定用。 6.1.4 從日接種管中接種一管乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（4.7.2），36 1 培養(yǎng) 24 h。在無菌條件下離心該培養(yǎng)液 10 min （2000 轉(zhuǎn)/分鐘） ， 棄去上清液。 用 10 mL 生理鹽水 （4.1） 振蕩洗滌菌體， 離心 10 min（2000 轉(zhuǎn)/分鐘），棄去上清液，用 10 mL 生理鹽水（4.1）振蕩清洗。如前離心操作，棄去上清液。再加 10 mL 生理鹽水（4.1），混勻。吸 1 mL 該菌懸液于 10 mL 生理鹽水（4.1）中，混勻制成測試菌液。 GB 5413.172010 3 6.1.5 以生理鹽水（4.1）做對照，在分光光度計 550 nm 波長下，測測試菌液（6.1.4）的光密度值，此值應在 60 %80 %之間。 6.2 試樣的處理 稱取 2 g（精確至 0.0001 g）固態(tài)試樣或 5 g（精確至 0.0001 g）液態(tài)試樣（約含泛酸 0.1 mg）于 250 mL 三角燒杯中。加入 10 mL Tris 緩沖液（4.8） ，再加入少量水，121 水解 15 min，冷卻。用鹽酸（4.9）調(diào)pH至4.5 0.2， 轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中用水定容。 過濾， 吸4 mL濾液， 稀釋至泛酸的濃度約為5 ng/mL。 6.3 標準曲線的制作 按表 1 順序加入蒸餾水、 標準溶液和培養(yǎng)基于試管中， 表 1 中每一編號需制作 3 管。 試管 S2 至 S10中，相當泛酸含量為 0 ng、5 ng、10 ng、15 ng 、20 ng 、25 ng、30 ng、40 ng、50 ng。 表 1 標準曲線管制作 試管號 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 蒸餾水（mL） 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 標準溶液（mL） 0 0 1 2 3 4 5 3 4 5 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 注 1：試管 S3S7 中加低濃度的為標準溶液。 注 2：試管 S8S10 中加高濃度的為標準溶液。 6.4 試樣管的制作 按表 2 順序加入蒸餾水、試樣和培養(yǎng)基于試管中，一式三份。 表 2 試樣管的制作 試管號 1 2 3 4 蒸餾水（mL） 4 3 2 1 試 樣（mL） 1 2 3 4 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 6.5 滅菌 將標準曲線管和試樣管 121 滅菌 5 min，迅速冷卻到室溫（商品化培養(yǎng)基按標簽說明進行滅菌)。 注：保證加熱和冷卻過程中條件均勻，滅菌管數(shù)過多或距離太近，在滅菌鍋中都可產(chǎn)生不良影響。 6.6 接種 在無菌條件下每管中均加入一滴（約 50 L）測試菌液（6.1.4），加蓋，充分振蕩混勻所有試管（標準曲線未接種空白管 S1 除外）。 6.7 培養(yǎng) 36 0.5 培養(yǎng) 16 h24 h。對每個試管進行目測檢查，未接種管中培養(yǎng)液應是澄清的，標準曲線管和試樣管中培養(yǎng)液的濁度應有梯度。未接種管中若出現(xiàn)混濁，則測定無效。 6.8 測定 GB 5413.172010 4 以接種空白管（表 1 中試管號 S2）做對照，取出最高濃度標準曲線管 S7，振蕩 5 s，在波長 550 nm條件下讀取光密度值，放回重新培養(yǎng)。2 h 后同等條件重新測該管的光密度，如果兩次光密度的絕對差結(jié)果2 %，則取出全部檢驗管測定標準溶液和試樣的光密度。 6.9 標準曲線的繪制 以標準曲線管泛酸含量作橫坐標，以光密度值為縱坐標繪制標準曲線。 6.10 試樣管中泛酸含量的計算 按照 6.8 每個試樣管測定的光密度值，從標準曲線中查得對應的泛酸含量。每一編號的三個試樣管應計算管中每毫升測定液泛酸的含量，并與三者平均值相比較。相對偏差小于 15 %的試管為有效試管，無效試樣管應舍去。有效試樣管總數(shù)應大于所有試樣管總數(shù)的 2/3。重新計算每一編號的有效試樣管中每毫升測定液泛酸含量的平均值，以此平均值計算全部編號試樣管的總平均值 Cx。 注：樣品管中泛酸含量低于 5 ng，高于 50 ng 的值應舍去。 7 分析結(jié)果的表述 試樣中泛酸含量按式（1）計算： X= 1001000fmCx（1） 式中： X試樣中泛酸含量，單位為微克每百克（g/100 g） ； Cx6.10 中計算所得的總平均值，單位為微克（g） ； f稀釋倍數(shù)； m試樣的質(zhì)量，單位為克（g） 。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 8 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術平均值的10 %。 第二法 高效液相色譜法 9 原理 試樣經(jīng)熱水提取等前處理后，經(jīng) C18 色譜柱分離，紫外檢測器檢測，外標法定量泛酸的含量。 10 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。 10.1 淀粉酶：酶活力1.5 U/mg。 10.2 甲醇(CH4O)：色譜純。 10.3 鹽酸。 10.4 硫酸鋅(ZnSO4)。 GB 5413.172010 5 10.5 鹽酸（0.1 mol/L）：移取 8.3 mL 鹽酸（10.3）于 1000 mL 容量瓶中，用水定容。 10.6 硫酸鋅溶液（15 g/100mL）：稱取 15 g 硫酸鋅（10.4）用水溶解并定容至 100 mL。 10.7 磷酸二氫鉀溶液（0.05 mol/L）：稱取 6.8 g 磷酸二氫鉀，用水溶解并定容至 1000 mL。用磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.0，用 0.45 m 濾膜過濾。 10.8 泛酸標準溶液 10.8.1 泛酸標準儲備液（1 mg/mL）：準確稱取泛酸鈣 1.087 g，加水溶解并定容至 1000 mL。 泛酸濃度=泛酸鈣濃度0.920 10.8.2 泛酸標準中間液（0.1 mg/mL）：吸取標準儲備液（10.8.1）10 mL 于 100 mL 容量瓶中，加水定容。臨用前配制。 11 儀器和設備 11.1 天平：感量為 0.1 mg。 11.2 高效液相色譜儀，帶紫外檢測器。 11.3 超聲波。 11.4 pH 計：精度為 0.01。 11.5 培養(yǎng)箱：55 2 。 12 分析步驟 12.1 試樣處理 12.1.1 不含淀粉類試樣處理 稱取混合均勻的固態(tài)試樣約5 g（精確至0.0001 g）或液態(tài)試樣約20 g（精確至0.0001 g）于150 mL三角瓶中，固體試樣加入約30 mL 40 50 溫水，振搖溶解后超聲萃取20 min。 12.1.2 含淀粉類試樣處理 如果試樣中含有淀粉，稱取混合均勻的固態(tài)試樣約5 g（精確到0.0001 g）或液態(tài)試樣約20 g（精確到0.0001 g）于150mL三角瓶中，加入淀粉酶（10.1）約0.2 g, 固體試樣加入約30 mL 40 50 溫水振搖溶解，蓋上瓶塞，在50 60 條件下酶解30 min。 12.2 測定液的制備 試樣溶液降至室溫后，用鹽酸（10.5）調(diào)節(jié) pH 至 4.5 0.1，加入 5 mL 硫酸鋅溶液（10.6），充分混合。 轉(zhuǎn)入 50 mL 容量瓶中， 用水定容至刻度并充分混勻后， 用濾紙過濾。 濾液經(jīng) 0.45 m 濾膜過濾后，即為試樣待測液。 12.3 參考色譜條件 色譜柱：ODS-C18（粒徑 5 m， 250 mm4.6 mm ）或具有同等性能的色譜柱。 流動相：取磷酸二氫鉀溶液（10.7）900 mL，取甲醇（10.2）100 mL，混勻后經(jīng)0.45 m微孔濾膜加壓過濾。 流速：1.0 mL/min。 檢測波長：200 nm。 GB 5413.172010 6 柱溫：30 1 。 進樣量：10 L。 12.4 測定 12.4.1 標準曲線測定 分別準