GB4789.40-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準G B4 7 8 9 .4 02 0 1 6食品安全國家標準食品微生物學檢驗克羅諾桿菌屬( 阪崎腸桿菌) 檢驗2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B4 7 8 9.4 02 0 1 6 前 言 本標準代替G B4 7 8 9.4 02 0 1 0 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗 、S N/T1 6 3 2.12 0 1 3 出口奶粉中阪崎腸桿菌( 克羅諾桿菌屬) 檢驗方法 第1部分: 分離與計數(shù) 。本標準與G B4 7 8 9.4 02 0 1 0相比, 主要變化如下: 標準名稱 修改為 “ 食 品安全國 家標準 食品微生物 學檢驗 克羅諾桿菌 屬 ( 阪崎 腸桿菌) 檢驗” ; 修改了可疑菌落的挑取數(shù)量。G B4 7 8 9.4 02 0 1 61 食品安全國家標準食品微生物學檢驗克羅諾桿菌屬( 阪崎腸桿菌) 檢驗1 范圍本標準規(guī)定了食品中克羅諾桿菌屬(C r o n o b a c t e r) 的檢驗方法。本標準適用于嬰幼兒配方食品、 乳和乳制品及其原料中克羅諾桿菌屬的檢驗。2 設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外, 其他設備和材料如下:2.1 恒溫培養(yǎng)箱:2 51,3 61,4 40.5。2.2 冰箱:25。2.3 恒溫水浴箱:4 40.5。2.4 天平: 感量0.1g。2.5 均質器。2.6 振蕩器。2.7 無菌吸管:1m L( 具0.0 1m L刻度) 、1 0m L( 具0.1m L刻度) 或微量移液器及吸頭。2.8 無菌錐形瓶: 容量1 0 0m L、2 0 0m L、20 0 0m L。2.9 無菌培養(yǎng)皿: 直徑9 0mm。2.1 0 p H計或p H比色管或精密p H試紙。2.1 1 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。3 培養(yǎng)基和試劑3.1 緩沖蛋白胨水(b u f f e rp e p t o n ew a t e r,B PW) : 見A.1。3.2 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(m o d i f i e dl a u r y ls u l f a t et r y p t o s eb r o t h - v a n c o m y c i nm e d i u m,m L S T - Vm) : 見A.2。3.3 阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基。3.4 胰蛋白胨大豆瓊脂(t r y p t i c a s es o ya g a r,T S A) : 見A.3。3.5 生化鑒定試劑盒。3.6 氧化酶試劑: 見A.4。3.7 L -賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基: 見A.5。3.8 L -鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基: 見A.6。3.9 L -精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基: 見A.7。3.1 0 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基: 見A.8。3.1 1 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基: 見A.9。G B4 7 8 9.4 02 0 1 62 第一法 克羅諾桿菌屬定性檢驗4 檢驗程序克羅諾桿菌屬檢驗程序見圖1。圖1 克羅諾桿菌屬檢驗程序5 操作步驟5.1 前增菌和增菌取檢樣1 0 0g(m L) 置滅菌錐形瓶中, 加入9 0 0m L已預熱至4 4的緩沖蛋白胨水, 用手緩緩地搖動至充分溶解,3 61培養(yǎng)1 8h2h。移取1m L轉種于1 0m Lm L S T - Vm肉湯,4 40.5培養(yǎng)2 4h2h。5.2 分離5.2.1 輕輕混勻m L S T - Vm肉湯培養(yǎng)物, 各取增菌培養(yǎng)物1環(huán), 分別劃線接種于兩個阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板, 顯色培養(yǎng)基須符合G B4 7 8 9.2 8的要求,3 61培養(yǎng)2 4h2h, 或按培養(yǎng)基要求條件G B4 7 8 9.4 02 0 1 63 培養(yǎng)。5.2.2 挑取至少5個可疑菌落, 不足5個時挑取全部可疑菌落, 劃線接種于T S A平板。2 51培養(yǎng)4 8h4h。5.3 鑒定自T S A平板上直接挑取黃色可疑菌落, 進行生化鑒定。克羅諾桿菌屬的主要生化特征見表1?？蛇x擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。表1 克羅諾桿菌屬的主要生化特征生化試驗特 征黃色素產(chǎn)生+氧化酶-L -賴氨酸脫羧酶-L -鳥氨酸脫羧酶(+)L -精氨酸雙水解酶+檸檬酸水解(+)發(fā)酵D -山梨醇L -鼠李糖D -蔗糖D -蜜二糖苦杏仁甙(-)+ 注:+9 9%陽性;-9 9%陰性; (+)9 0%9 9%陽性; (-)9 0%9 9%陰性。6 結果與報告綜合菌落形態(tài)和生化特征, 報告每1 0 0g(m L) 樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌屬。第二法 克羅諾桿菌屬的計數(shù)7 操作步驟7.1 樣品的稀釋7.1.1 固體和半固體樣品: 無菌稱取樣品1 0 0g、1 0g、1g各三份, 分別加入9 0 0m L、9 0m L、9m L已預熱至4 4的B PW, 輕輕振搖使充分溶解, 制成11 0樣品勻液, 置3 61培養(yǎng)1 8h2h。分別移取1m L轉種于1 0m Lm L S T - Vm肉湯,4 40.5培養(yǎng)2 4h2h。7.1.2 液體樣品: 以無菌吸管分別取樣品1 0 0m L、1 0m L、1m L各三份, 分別加入9 0 0m L、9 0m L、9m L已預熱至4 4的B PW, 輕輕振搖使充分混勻, 制成11 0樣品勻液, 置3 61培養(yǎng)1 8h2h。分別移取1m L轉種于1 0m Lm L S T - Vm肉湯,4 40.5培養(yǎng)2 4h2h。G B4 7 8 9.4 02 0 1 64 7.2 分離、 鑒定同5.2和5.3。8 結果與報告綜合菌落形態(tài)、 生化特征, 根據(jù)證實為克羅諾桿菌屬的陽性管數(shù), 查MP N檢索表, 報告每1 0 0g(m L) 樣品中克羅諾桿菌屬的MP N值( 見表B.1) 。G B4 7 8 9.4 02 0 1 65 附 錄 A培養(yǎng)基和試劑A.1 緩沖蛋白胨水(B PW)A.1.1 成分蛋白胨1 0.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鈉(N a2H P O41 2 H2O)9.0g磷酸二氫鉀1.5g蒸餾水10 0 0m LA.1.2 制法加熱攪拌至溶解, 調節(jié)p H至7.20.2,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.2 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(M o d i f i e d l a u r y l s u l f a t e t r y p t o s e b r o t h - v a n c o m y c i nm e d i u m,m L S T - V m)A.2.1 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(m L S T) 肉湯A.2.1.1 成分氯化鈉3 4.0g胰蛋白胨2 0.0g乳糖5.0g磷酸二氫鉀2.7 5g磷酸氫二鉀2.7 5g十二烷基硫酸鈉0.1g蒸餾水10 0 0m LA.2.1.2 制法加熱攪拌至溶解, 調節(jié)p H至6.80.2。分裝每管1 0m L,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.2.2 萬古霉素溶液A.2.2.1 成分萬古霉素1 0.0m g蒸餾水1 0.0m LA.2.2.2 制法1 0.0m g萬古霉素溶解于1 0.0m L蒸餾水, 過濾除菌。萬古霉素溶液可以在05保存1 5d。G B4 7 8 9.4 02 0 1 66 A.2.3 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(M o d i f i e dl a u r y l s u l f a t et r y p t o s eb r o t h - v a n c o m y c i nm e d i u m,m L S T - V m) 每1 0m Lm L S T加入萬古霉素溶液0.1m L, 混合液中萬古霉素的終濃度為1 0g/m L。注:m L S T - Vm必須在2 4h之內使用。A.3 胰蛋白胨大豆瓊脂(T S A)A.3.1 成分胰蛋白胨1 5.0g植物蛋白胨5.0g氯化鈉5.0g瓊脂1 5.0g蒸餾水10 0 0m LA.3.2 制法加熱攪拌至溶解, 煮沸1m i n, 調節(jié)p H至7.30.2,1 2 1高壓1 5m i n。A.4 氧化酶試劑A.4.1 成分N,N,N ,N -四甲基對苯二胺鹽酸鹽1.0g蒸餾水1 0 0m LA.4.2 制法少量新鮮配制, 于冰箱內避光保存, 在7d之內使用。A.4.3 試驗方法用玻璃棒或一次性接種針挑取單個特征性菌落, 涂布在氧化酶試劑濕潤的濾紙平板上。如果濾紙在1 0s中之內未變?yōu)樽霞t色、 紫色或深藍色, 則為氧化酶試驗陰性, 否則即為氧化酶實驗陽性。注:實驗中切勿使用鎳/鉻材料。A.5 L -賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基A.5.1 成分L -賴氨酸鹽酸鹽(L - l y s i n em o n o h y d r o c h l o r i d e)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.0 1 5g蒸餾水10 0 0m LA.5.2 制法將各成分加熱溶解, 必要時調節(jié)p H至6.80.2。每管分裝5m L,1 2 1高壓1 5m i n。G B4 7 8 9.4 02 0 1 67 A.5.3 實驗方法挑取培養(yǎng)物接種于L -賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基, 剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。3 01培養(yǎng)2 4h2h, 觀察結果。L -賴氨酸脫羧酶試驗陽性者, 培養(yǎng)基呈紫色, 陰性者為黃色, 空白對照管為紫色。A.6 L -鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基A.6.1 成分L -鳥氨酸鹽酸鹽(L - o r n i t h i n em o n o h y d r o c h l o r i d e)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.0 1 5g蒸餾水10 0 0m LA.6.2 制法將各成分加熱溶解, 必要時調節(jié)p H至6.80.2。每管分裝5m L。1 2 1高壓1 5m i n。A.6.3 實驗方法挑取培養(yǎng)物接種于L -鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基, 剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。3 01培養(yǎng)2 4h2h, 觀察結果。L -鳥氨酸脫羧酶試驗陽性者, 培養(yǎng)基呈紫色, 陰性者為黃色。A.7 L -精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基A.7.1 成分L -精氨酸鹽酸鹽(L - a r g i n i n em o n o h y d r o c h l o r i d e)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.0 1 5g蒸餾水10 0 0m LA.7.2 制法將各成分加熱溶解, 必要時調節(jié)p H至6.80.2。每管分裝5m L。1 2 1高壓1 5m i n。A.7.3 實驗方法挑取培養(yǎng)物接種于L -精氨酸脫羧酶培養(yǎng)基, 剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。3 01培養(yǎng)2 4h2h, 觀察結果。L -精氨酸脫羧酶試驗陽性者, 培養(yǎng)基呈紫色, 陰性者為黃色。A.8 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基A.8.1 基礎培養(yǎng)基A.8.1.1 成分酪蛋白( 酶消化)1 0.0gG B4 7 8 9.4 02 0 1 68 氯化鈉5.0g酚紅0.0 2g蒸餾水10 0 0m LA.8.1.2 制法將各成分加熱溶解, 必要時調節(jié)p H至6.80.2。每管分裝5m L。1 2 1高壓1 5m i n。A.8.2 糖類溶液(D -山梨醇、L -鼠李糖、D -蔗糖、D -蜜二糖、 苦杏仁甙)A.8.2.1 成分糖8.0g蒸餾水1 0 0m LA.8.2.2 制法分別稱取D -山梨醇、L -鼠李糖、D -蔗糖、D -蜜二糖、 苦杏仁甙等糖類成分各8g, 溶于1 0 0m L蒸餾水中, 過濾除菌, 制成8 0m g/m L的糖類溶液。A.8.3 完全培養(yǎng)基A.8.3.1 成分基礎培養(yǎng)基8 7 5m L糖類溶液1 2 5m LA.8.3.2 制法無菌操作, 將每種糖類溶液加入基礎培養(yǎng)基, 混勻; 分裝到無菌試管中, 每管1 0m L。A.8.4 實驗方法挑取培養(yǎng)物接種于各種糖類發(fā)酵培養(yǎng)基, 剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。3 0 1 培養(yǎng)2 4h2h, 觀察結果。糖類發(fā)酵試驗陽性者, 培養(yǎng)基呈黃色, 陰性者為紅色。A.9 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基A.9.1 成分檸檬酸鈉2.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀1.0g磷酸二氫銨1.0g硫酸鎂0.2g溴麝香草酚藍0.0 8g瓊脂8.0g 1 8.0g蒸餾水10 0 0m LA.9.2 制法將各成分加熱溶解, 必要時調節(jié)p H至6.80.2。每管分裝1 0m L,1 2 1高壓1 5m i n, 制成斜面。G B4 7 8 9.4 02 0 1 69 A.9.3 實驗方法挑取培養(yǎng)物接種于整個培養(yǎng)基斜面,3 6 1 培養(yǎng)2 4h2h, 觀察結果。陽性者培養(yǎng)基變?yōu)樗{色。G B4 7 8 9.4 02 0 1 61 0 附 錄 B克羅諾桿菌屬最可能數(shù)(MP N) 檢索表每1 0 0g(m L) 檢樣中克羅諾桿菌屬最可能數(shù)(MP N) 的檢