豬鏈采樣與檢測(cè)ppt麗水市疾病預(yù)防控制中心課件

人 感 染 豬 鏈 球 菌 病 樣品采集運(yùn)送與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案,浙江省麗水市人感染鏈球菌病疫情控制和診療技術(shù)培訓(xùn)會(huì)議,麗水市CDC 蘭進(jìn)權(quán),提綱,病原學(xué)簡(jiǎn)介 樣品采集與運(yùn)送 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),病原學(xué)簡(jiǎn)介,分類 培養(yǎng)特性 生化特征 致病因子,鏈球菌分類,伯杰分類 6大類群，29個(gè)種 16SrRNA序列同源性和化學(xué)分類 鏈球菌屬分類學(xué)定義 無芽孢革蘭氏陽性細(xì)菌，細(xì)胞形態(tài)為球形或球桿狀，直徑0.52.0微米，細(xì)胞成對(duì)或成鏈排列，有些種具有莢膜。,鏈球菌分類,根據(jù)溶血現(xiàn)象分類 甲型溶血性鏈球菌：稱甲型溶血或溶血，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞并未完全溶解。多為條件致病菌。 乙型溶血性鏈球菌：稱乙型溶血或溶血，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞完全溶解，致病力強(qiáng) 丙型鏈球菌：無溶血環(huán)，一般不致病 豬鏈球菌溶血(偶而也有弱溶血或溶血、溶血現(xiàn)象均不明顯 ) ，某些菌株在馬血培養(yǎng)基上溶血,鏈球菌分類,根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的分類 蘭氏分類：按多糖類抗原（C抗原）將鏈球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群(其中缺I、J群) ，近年又增加U、V群，共20群，每個(gè)群有1個(gè)或多個(gè)種。 幾乎所有群的菌株，都能從病豬體內(nèi)分離得到，引起豬病并偶爾經(jīng)傷口感染人的鏈球菌主要有 R群的2型豬鏈球菌 S群和D群的1型豬鏈球菌 F群的咽峽炎鏈球菌 L、S、T、U、V群鏈球菌等,鏈球菌分類,豬鏈球菌 血清2型 蘭氏分類：R群 根據(jù)菌體莢膜抗原特性不同，分為35個(gè)血清型：1/2，134型 致病性最強(qiáng)的是2型，其次為1型 2型豬鏈球菌 1954年英國(guó)分離 1968年命名為莢膜II型豬鏈球菌 分為致病力不同的株,豬鏈球菌培養(yǎng)特性,革蘭氏陽性無芽胞球菌，兼性厭氧 營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不良，需補(bǔ)充血液、血清、葡萄糖等 在血清肉湯中易形成長(zhǎng)鏈，管底呈絮狀沉淀 在綿羊鮮血瓊脂平板上37 培養(yǎng)24小時(shí)，形成直徑l2毫米的細(xì)小菌落，灰白色，半透明，邊緣整齊，凸起，光滑，溶血（有時(shí)呈弱溶血或溶血不明顯），48小時(shí)后可有草綠色色素沉著。,豬鏈球菌培養(yǎng)特性,剛分離的豬鏈球菌，典型的革蘭氏陽性鏈球菌，鏈長(zhǎng)達(dá)二十多個(gè) 二代培養(yǎng)后細(xì)菌形態(tài)不典型，結(jié)晶紫作色不良，多為不成鏈球桿菌，少數(shù)呈短鏈狀。,鏈球菌. Gram stain. CDC/Dr. Richard Facklam,鏈球菌,豬鏈球菌培養(yǎng)特性,10培養(yǎng)不生長(zhǎng)，45培養(yǎng)生長(zhǎng)，6030分鐘試驗(yàn)不生長(zhǎng) 5530分鐘即可被殺死,豬鏈球菌生化特征,豬鏈球菌生化特性往往差異較大，一般難以作為分類依據(jù) 觸酶試驗(yàn)陰性 水解七葉苷、淀粉和精氨酸，不水解馬尿酸鹽和明膠 分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露糖，不分解阿拉伯糖、鼠李糖和甘露醇,致病因子,豬鏈球菌2型主要致病因子 溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein,MRP） 細(xì)胞外因子（extracellular factor,EF） 豬溶素（suilysin） 莢膜多糖 用南通地區(qū)分離的人源豬鏈球菌對(duì)兔和小白鼠的攻擊試驗(yàn)表明，豬鏈可使家兔發(fā)病，并引起死亡。而小白鼠不敏感,樣品采集與運(yùn)送,采樣器材 樣品種類 血液和腦脊液標(biāo)本采集方法 樣品運(yùn)輸保存 注意事項(xiàng),采樣器材,無菌封閉性好的試管，最好使用負(fù)壓采血管或帶螺口蓋的塑料管，避免使用玻璃試管。 可以清楚標(biāo)記且標(biāo)記不易脫落的記號(hào)筆。 可以方便采集組織標(biāo)本的無菌容器。 無菌的剪刀、鑷子和手術(shù)刀。,采樣器材,血平皿(或者血培養(yǎng)瓶)。 一次性隔離服、乳膠手套、防護(hù)口罩等 帶有冰袋或者冰排的安全可靠的保溫運(yùn)輸容器 采樣送檢單,樣品種類,現(xiàn)癥病人不抗凝全血 現(xiàn)癥病人抗凝血 發(fā)病47天、1016天不抗凝血 腦脊液標(biāo)本 尸體解剖應(yīng)無菌采集肝、脾、心血、胸（腹）水 如有病死豬也可進(jìn)行解剖，取肝、脾、腎、心血、肉,血液和腦脊液標(biāo)本采集方法,無菌抽取血液510ml分置于有抗凝劑和無抗凝劑的無菌試管或者負(fù)壓采血管中 按常規(guī)方法腰穿采集適量腦脊液標(biāo)本置于無菌試管中 采集標(biāo)本的同時(shí)接種血平皿或者血培養(yǎng)瓶，置于3537培養(yǎng),樣品運(yùn)輸保存,所有的原始標(biāo)本在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中應(yīng)置于安全可靠容器中。 標(biāo)本應(yīng)冷藏運(yùn)輸。 需要馬上檢測(cè)的標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)室可暫放4-8冰箱。 剩余標(biāo)本放置于-70保存。,注意事項(xiàng),嚴(yán)格無菌操作，防止標(biāo)本污染。 用于分離培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)在抗菌治療前采集。 應(yīng)盡可能床邊接種分離培養(yǎng)，如無法立即接種，應(yīng)在樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行分離。 在標(biāo)本采集過程中，注意安全防護(hù)。使用一次性隔離服、乳膠手套、防護(hù)口罩 采取預(yù)防措施，防止針頭等銳器刺傷 如發(fā)生傷口意外暴露，應(yīng)及時(shí)清洗和消毒，并預(yù)防性服藥,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),豬鏈球菌檢驗(yàn)程序 推片鏡檢 分離鑒定 檢測(cè)要點(diǎn),豬鏈球菌檢驗(yàn)程序,病人檢樣（腦脊液、血液等） 增菌培養(yǎng) （腦心肉湯/牛血清葡萄糖 肉湯/血培養(yǎng)瓶） 革蘭氏染色 觸酶試驗(yàn),推片鏡檢,豬鏈球菌檢驗(yàn)程序(續(xù)),羊血瓊脂平板 （37，5%CO2，24h） 溶血(偶而也有弱溶血) PCR檢測(cè) 血清學(xué)檢測(cè) 生化鑒定,推片鏡檢,抗凝血或腦脊液可推片革蘭氏染色鏡檢 陽性標(biāo)本可見中性粒細(xì)胞內(nèi)吞噬顆粒，偶爾可見革蘭陽性球菌,感染鼠尾血推片,感染兔心臟血推片,分離鑒定,血平板直接接種 新鮮羊血瓊脂平板/含8%新生牛血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板 血或腦脊液等標(biāo)本 直接接種 組織標(biāo)本 可直接涂抹平板或剪碎用無菌生理鹽水洗滌，洗液接種平板 置375% CO2培養(yǎng)箱或者燭缸中培養(yǎng)24小時(shí),分離鑒定,增菌培養(yǎng) 待檢標(biāo)本置約10倍體積腦心肉湯/含8%新生牛血清葡萄糖肉湯（附配方）/商品化血培養(yǎng)瓶中增菌培養(yǎng)37 24小時(shí) 增菌培養(yǎng)物接種新鮮羊血瓊脂平板，置375% CO2培養(yǎng)箱或者燭缸中培養(yǎng)24小時(shí) 如果是污染標(biāo)本,則要接種于選擇增菌培養(yǎng)液（含15微克/毫升多粘菌素B，30微克/毫升萘啶酮酸的腦心培養(yǎng)基）進(jìn)行增菌,附：葡萄糖肉湯（含8%新生牛血清）,成分： 酵母浸膏 3克 10%葡萄糖溶液 20毫升 枸椽酸鈉 3克 磷酸氫二鉀 2克 牛肉湯 900毫升 24.7%硫酸鎂 20毫升 0.5%對(duì)氨苯甲酸 5毫升 新生牛血清 80毫升,附：葡萄糖肉湯（含8%新生牛血清）,制法 除葡萄糖及硫酸鎂外,其他各物混合,加熱溶解,矯正pH至7.6,再煮沸5分鐘 用濾紙過濾并分裝于100毫升三角燒瓶?jī)?nèi),每瓶50毫升,包扎瓶口,高壓滅菌10磅20分鐘 將葡萄糖配成10%水溶液,硫酸鎂配成24.7%水溶液,分別高壓滅菌8磅15分鐘 每50毫升無菌肉湯內(nèi)加入無菌葡萄糖及磷酸鎂水溶液各1毫升,混勻.于37培養(yǎng)2天證明無細(xì)菌生長(zhǎng)后存于冰箱內(nèi)備用。,分離鑒定,形態(tài)學(xué)鑒定 挑取平板上可疑菌落革蘭氏染色鏡檢 篩檢生化試驗(yàn) 豬鏈球菌觸酶試驗(yàn)陰性，可與葡萄球菌區(qū)別 血清學(xué)檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)分型診斷血清，進(jìn)行乳膠凝集試驗(yàn)或玻片凝集試驗(yàn) 確定所分離的菌株為R群，與2型豬鏈球菌分型血清反應(yīng) 目前國(guó)內(nèi)無分型診斷血清供應(yīng)。據(jù)報(bào)道,加拿大和澳大利亞有商品化血清分型試劑。,分離鑒定,生化鑒定 血平板上挑選可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色和觸酶試驗(yàn) 符合鏈球菌特征，接種血平板純培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定 梅里埃API生化鑒定系統(tǒng)API 20 strep可鑒定2型豬鏈球菌，推薦使用（鑒定程序詳見操作說明）,分離鑒定,PCR檢測(cè) 豬鏈球菌種特異性基因16S rDNA 豬鏈球菌2型和1/2型型特異的莢膜多糖基因cps2A 毒力因子溶菌酶釋放蛋白基因MRP 細(xì)胞外蛋白因子基因EF,基因鑒定，使用PCR技術(shù)和對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析 檢測(cè)豬鏈球菌種特異性16S rRNA。 上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat 下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa,檢測(cè)豬鏈球菌莢膜多糖基因（cps2A） 上游引物：gttgagtccttatacacctgtt 下游引物：cagaaaattcatattgtccacc,檢測(cè)溶菌酶釋放相關(guān)蛋白編碼基因片段（mrp） 上游引物： ggtatacctt gctggtaccg ttc 下游引物：agtctctaca gctgtagctg g,PCR反應(yīng)的條件： 94預(yù)變性5分鐘;94、30秒，60、30秒，72、30秒，25個(gè)循環(huán)，最后延伸72、5分鐘。取5微升擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。,Multiplex PCR Assay for Detection of Streptococcus suis Species and Serotypes 2 and 1/2 in Tonsils of Live and Dead Pigs.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, July 2004, p. 31693175,Multiplex PCR Assays for Simultaneous Detection of Six Major Serotypes and Two Virulence-Associated Phenotypes of Streptococcus suis in Tonsillar Specimens from Pigs. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2002, p. 29222929 The cps Genes of Streptococcus suis Serotypes 1, 2, and 9: Development of Rapid Serotype-Specific PCR Assays. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. 1999, p. 31463152,Use of Ribotyping and Hemolysin Activity To Identify Highly Virulent Streptococcus suis Type 2 Isolates. JOURNAL OF CLINICA MICROBIOLOGY, Jan. 1998, p. 1519,檢測(cè)要點(diǎn),傳代培養(yǎng)后細(xì)菌形態(tài)不典型,多為革