FISH雜交技術(shù).ppt

熒光原位雜交（FISH） Fluorescence in situ hybridization,原位雜交（ISH）,原位雜交 (in situ hybridization, ISH) 將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交。 使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細菌或其他真核細胞中的位置。 原位雜交技術(shù)(ISH)是分子生物學、組織化學及細胞學相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀60年代。,基本原理,根據(jù)堿基互補配對原則，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA兩條單鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標記的DNA、RNA或與mRNA互補的cDNA作探針，與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸(RNA或DNA)片段進行雜交，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系予以顯示，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究。,原位雜交常用的標記物質(zhì),3H、35S、125I、32P等,2,熒光素、生物素、地高辛等,70年代,80年代中后期,幾種原位雜交技術(shù),1 基因組原位雜交技術(shù) 2 熒光原位雜交技術(shù) 3 多彩色熒光原位雜交技術(shù) 4 原位PCR,熒光原位雜交,熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù),它提供了將特定DNA片段和特定的真核生物細胞的染色體區(qū)帶聯(lián)系起來的快速而有效的手段,是研究DNA序列在染色體上位置的最直接的方法,自問世以來就廣泛應(yīng)用于生物學研究中。它是以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子(reporter molecule)結(jié)合,雜交后再通過免疫細胞化學過程連接上熒光染料。,FISH發(fā)展,1969年Gall和Pardue利用放射性同位素標記的DNA探針檢測細胞制片上非洲爪蟾細胞核內(nèi)的rDNA獲得成功之后,Pardue等同年又以小鼠衛(wèi)星DNA為模板,利用體外合成的含3H的RNA為探針成功地與中期染色體標本進行了原位雜交,從而開創(chuàng)了RNA-DNA的同位素原位雜交技術(shù)。他們都是采用放射性同位素標記探針,需要采用放射自顯影進行檢測,這種檢測上的限制及當時分子克隆方法的缺乏使得DNA原位雜交技術(shù)不能很快得到廣泛應(yīng)用。,FISH發(fā)展,1974 年，Evans第一次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來,提高了基因定位的準確性。 1975 年,Manning 等最先在溶液的分子雜交中,使用非放射性標記,通過細胞色素C 將生物素與RNA 分子連接起來。 1977 年Rudkin發(fā)明了用間接免疫熒光法檢測目的DNA 的非同位素原位雜交(NISH)。 1981 年，Langer 等首次采用生物素標記的核苷酸探針成功地進行了染色體原位雜交,建立了非放射性原位雜交技術(shù)。至此,以熒光標記的探針在細胞制片上進行基因原位雜交的技術(shù)建立起來。 1985 年，熒光原位雜交技術(shù)被引進到植物。 1986 年，Cremer 與Licher 等分別證實了熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用于間期核檢測染色體非整倍體的可行性,從而開辟了間期細胞遺傳學研究。,20世紀90年代，隨著人類基因組計劃的進行，由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。,FISH發(fā)展,FISH原理,FISH是以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩(wěn)定的異源待檢的雜交體雙鏈DNA，通過熒光標記顯示出來，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。,熒光原位雜交特點,1.FISH不需要放射性同位素作探針標記,安全性高； 2.FISH探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內(nèi)使用，經(jīng)濟、安全； 3.實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準確； 4.FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當； 5.多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列； 6.既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化,也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。,FISH不需要放射性同位素作探針標記,安全性高; FISH的實驗周期短,探針穩(wěn)定性高; FISH能通過多次免疫化學反應(yīng),使其雜交信號明顯增強,從而提高靈敏度,檢測的靈敏度接近同位素探針雜交； FISH的分辨率高達320Mb； FISH可以用不同修飾核苷酸分子標記不同的DNA探針,再用不同的熒光素分子檢測不同的探針分子,因此可以在熒光顯微鏡下在同一張切片上同時觀察幾種DNA探針的定位,直接得到它們的相關(guān)位置和順序,從而大大加速生物基因組和功能基因定位的研究。,實驗流程,植物染色體常規(guī)制片,實驗材料 蠶豆根尖 實驗?zāi)康?制備出分裂相多、雜質(zhì)少、背景清晰、染色體分散且形態(tài)好的染色體標本 實驗步驟,取材 預(yù)處理 固定 解離（酸解） 染色 壓片 鏡檢,染色體制片,固定 固定液處理 對保持染色體完好形態(tài)很重要，并能使染色體核蛋白保持原有結(jié)構(gòu)，使染色體更接近活體狀態(tài)。 解離 酸解或酶解 若解離時間不足，細胞壁不能完全消化，染色體便無法分散、鋪展; 若解離時間過長，則可能導(dǎo)致染色體離散丟失。 染色 解離后材料徹底水洗并吸干，取根尖2-3mm分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加12滴染液，染色510min。 壓片 染色后的材料上加一些染液，蓋上蓋玻片，再用鈍頭的用具敲打，使材料分散壓平，最后，覆一層吸水紙，以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋玻片移動)，便于觀察。 鏡檢 先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細觀察、記數(shù)。找出染色體分散較好的中、后期細胞進行染色體計數(shù),并準確記錄其位置。,間期,在光學顯微鏡下，只看到均勻一致的細胞核及許多的絲狀染色質(zhì)。實質(zhì)上間期的核是處于高度活躍的生理生化的代謝階段，正為細胞分裂準備條件。,前期,核內(nèi)染色質(zhì)逐漸濃縮為細長而卷曲的染色體，每一染色體含有兩個染色單體，它們具有一個共同的著絲點；核仁和核膜逐漸模糊不明顯。,中期,核仁、核膜逐漸消失，各染色體排列在赤道板上，紡錘絲與染色體的著絲點相連。染色體分散，易于鑒定形態(tài)、數(shù)目。,后期,各染色體著絲點分裂為二，其每條染色單體也相應(yīng)地分開，并各自隨著紡錘絲的收縮而移向兩極，每極有一組染色體，數(shù)目和原來的相同。,末期,分開在兩極的染色體各自組成新的細胞核，在細胞質(zhì)中央赤道板處形成新的細胞壁，使細胞分裂為二，形成兩個子細胞。這時細胞進入分裂間期。,小麥染色體制片,探針制備,所謂核酸探針即是指一段用放射性核素或其他標記物(如酶與熒光素等)標記的與目的基因互補的DNA片段或單鏈DNA或RNA。根據(jù)其來源可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針以及PNA探針。 1. cDNA探針 以mRNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成一條與mRNA互補的DNA鏈(cDNA)用堿除去mRNA 2.基因組探針 是把染色體DNA通過超聲擊斷或以限制性內(nèi)切酶不完全水解獲得許多染色體DNA隨機片段擇長度約15-20kb的DNA片段重組到噬菌體中經(jīng)體外包裝轉(zhuǎn)染大腸桿菌篩選出含目的基因的大腸桿菌擴增后提取質(zhì)粒 酶切分離目的基因。,3.寡核苷酸探針 為人工合成的DNA片段，一般長約20-50個bp（堿基）?？筛鶕?jù)已知DNA或RNA序列合成精確互補的DNA探針；如不知核酸序列，可依據(jù)其蛋白產(chǎn)物的氨基酸順序推導(dǎo)出核酸序列合成DNA探針。DNA自動合成儀的出現(xiàn)使探針的合成十分方便。由于分子小，因此更容易滲透到細胞的目標區(qū)域；但也正由于分子小，限制了其所能攜帶的熒光基團或報告分子數(shù)目，并最終導(dǎo)致雜交后熒光信號較弱。因此這類探針僅實用于對重復(fù)單位較短的高度重復(fù)序列的熒光原位雜交分析。,探針制備,4.RNA探針 制備的技術(shù)路線為：將一段含完整或部分基因的DNA片段插入重組質(zhì)粒的多克隆位點，以內(nèi)切酶在插入片段中某一適當部位或在插入片段下游的某一部位消化重組質(zhì)粒，使之成為線性DNA，在相應(yīng)的DNA依賴性RNA聚合酶催化下，以含目的基因的DNA片段為模板合成RNA探針。由于RNA探針為單鏈，雜交時不存在第二條鏈的競爭，所以其敏感性較經(jīng)缺口平移標記的DNA探針要高。 RNA-RNA雜交分子在所有可能的雜交分子中最穩(wěn)定，但RNA探針容易被RNase降解。,探針制備,5.肽核苷酸（PNA）探針 PNA寡聚物是一類新分子，其結(jié)構(gòu)與DNA相似。但在PNA中，沒有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不帶電的肽鏈(聚酰胺)。與DNA相比，PNA對熱穩(wěn)定、與DNA的結(jié)合不依賴于離子強度，因此雜交時，受探針變性溫度和溶液PH的影響較小，鑒于這些特點和優(yōu)點，PNA有望取代DNA或RNA作為FISH的探針。但由于PNA探針只能通過化學方法進行合成，而且合成費用高，因此迄今所用的PNA探針還僅限于染色體的泛著絲粒和泛端粒探針。,探針制備,PNA與DNA雜交時也遵循堿基互補配對原則,探針設(shè)計與特異性,探針是FISH檢測靈敏度和準確性的關(guān)鍵。FISH檢測的準確性來源于探針的設(shè)計。FISH能否應(yīng)用于某一領(lǐng)域也取決于是否具有相應(yīng)的探針。用于FISH檢測的探針必須具備很高的特異性，能特異性地識別特定的基因或染色體上特定的片斷。而且FISH的探針必須能經(jīng)受原位雜交的處理而不變性。熒光基團的標記也直接影響了檢測的靈敏度和原位雜交結(jié)果的檢測方式。,以著名的探針生產(chǎn)商Vysis公司的LSI系列探針為例：LSI系列探針來源于BAC大片斷基因組文庫，探針所覆蓋的染色體片斷總長可達100Kb400Kb，保證了探針的高特異性和極強的熒光信號；熒光基團采用直接標記法標記，不同波長的熒光基團使探針在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)多種熒光信號，借此我們可以一次檢測多個染色體或基因的異常；由于探針具有極強的熒光信號因而對FISH結(jié)果的檢測也采用直接檢測法，即在熒光顯微鏡下直接觀察FISH的信號，而無需抗原抗體反應(yīng)對熒光信號進行放大。Vysis探針的設(shè)計既確保了探針的特異性和靈敏度，同時直接的鏡檢也使FISH檢測更簡便。,探針設(shè)計,探針設(shè)計,探針類型,1、染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體、細菌人工染色體，主要用以識別染色體的易位、缺失和擴增。 探針標記2、染色體涂染探針，包括通過流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。 3、染色體重復(fù)序列探針，主要是指著絲粒-衛(wèi)星 DNA 重復(fù)序列探針和端粒重復(fù)序列探針，用以檢測染色體數(shù)目異常。,染色體涂染探針：判斷易位染色體,探針標記,為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號。,探針標記,放射性標記：很難滿足靈敏度和分辨率這兩個原位雜交成功的條件，靈敏度要求放射性標記具有高中輻射能（32P），當標記物能量過高時，會因為信號散射導(dǎo)致分辨率過低；如果使用低輻射能的放射性標記物（3H）可以得到較高分辨率，但由于靈敏度低而需要長時間曝光，并由此導(dǎo)致背景過高而難以分辨出真正信號。 非放射性標記：常用的有生物素與熒光素。生物素一般通過連接到dUTP等核苷三磷酸上，這種經(jīng)修飾的核苷三磷酸再通過酶促反應(yīng)摻入到探針中；熒光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用下?lián)饺氲教结樦腥?，常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）、羧基熒光素（FAM）、四氯-6-羧基熒光素(TET)、吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等,標記探針的物質(zhì),標記探針的物質(zhì)： （1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) 半抗原報告分子（間接標記） 間接標記：是采用生物素標記DNA探針，雜交后再用聯(lián)有熒光素的抗生物素抗體檢測。（可將檢測信號放大，監(jiān)測到小至500bp的靶序列） （2）熒光物質(zhì)（直接標記） 直接標記：是通過熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標記探針時摻入熒光素核苷三磷酸標記探針。（檢測步驟簡單，但不能將信號放大，不如間接標記的探針靈敏）,探針標記,探針標記可以采用均勻標記和末端標記的方法。 均勻標記有切口平移法、隨機引物法和PCR擴增等方法。,對探針進行標記時，可復(fù)制合成一段新的探針分子，在復(fù)制合成過程滲入標記核苷酸，從而使整個新分子被均勻地標記。其顯著的特點是標記不局限一個位點，而是均勻地滲入，探針的信號強。,均勻標記,切口平移法： 先由胰DNA酶I在DNA雙鏈上隨機切口，大腸桿菌DNA聚合酶I 作用以切口處開始，以另一條DNA鏈為模板，以4種三磷酸脫氧核苷酸為原料，沿切口水解5端核苷酸和3端修復(fù)加入標記核苷酸同時進行，切口平行推移，可均一標記DNA鏈。 （引物延伸法） 本法與切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶來合成與模板互補的新的DNA鏈。由于DNA聚合必須從具有3-OH的末端開始合成，因此與切口平移不同，引物延伸法需要一段與模板序列互補的寡聚核苷酸作引物，將它與模板雜交，以提供3-OH端。,均勻標記,切口平移標記法,標記部分,切口平移法可對環(huán)狀或線性雙鏈DNA進行標記。一般對克隆的DNA片段用這種方法標記的效果較好。 該方法使用時應(yīng)注意： A.只能標記雙鏈DNA 使用探針時要預(yù)先變性后再使用，而且標記時DNA片段不能太小。 B.DNA酶I使用的量要合適 太多會將DNA模板切碎，不能進行標記反應(yīng)；太少則不能有效地打開缺口，使標記物不能進入缺口。 C.標記時間不能太短 太短時間會造成標記量不足，影響雜交的進行。,均勻標記,隨機引物法 原理是使被稱為隨機引物的6-9個核苷酸的寡核苷酸片段與單鏈DNA或變性的雙鏈DNA隨機互補結(jié)合（退火），以提供3-OH端，在5-3外切酶活性的DNA聚合酶大片段作用下，在3-OH端逐個加上核苷酸直至下一個引物。當反應(yīng)液中含有標記的核苷酸時，即形成標記的DNA探針。引物與模板的結(jié)合以一種隨機的方式發(fā)生，標記均勻跨越DNA全長。,隨機引物標記法,1、不但可用于雙連DNA的標記，而且可用于單連DNA和RNA的標記 2、操作簡單 3、標記率高,隨機引物標記法的特點,PCR擴增 在PCR反應(yīng)底物中，將一種dNTP換成標記物標記的dNTP，這樣標記的dNTP就在PCR反應(yīng)的同時摻入到新合成的DNA鏈上。用PCR聚合酶鏈式反應(yīng)只須極少量的DNA模板（50100ng），即可擴增出大量高效標記的目的片段。 若進行質(zhì)粒的提取工作，需要23d完成。若直接從菌中標記目的基因，可以縮短至23h，即可獲得高效率標記的探針。也可直接從具有目的基因載體質(zhì)粒中擴增出目的基因，同時適用于不需提取質(zhì)粒DNA迅速鑒定細菌轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。,均勻標記,PCR標記法,末端標記,直接將探針分子的某個原子替換為放射性同位素原子，或直接在探針分子上加上標記的原子或復(fù)合物，這種直接標記一般是在探針分子的末端進行，所以稱之為末端標記。 經(jīng)過末端標記的核酸分子除作為雜交探針外，更多的用于RNA S1核酸酶作圖以及引物延伸反應(yīng)中的標記引物。,末端標記法,實驗流程,染色體顯帶,顯帶染色是將染色體經(jīng)過一定程序的處理,并用特定的染料染色后,使染色體在其長軸上顯示出一個個明暗交替或深淺不同的橫紋,這樣的橫紋就叫做染色體的帶。,食管癌細胞系24色染色體mFISH核型分析,每條染色體都含有一定數(shù)量、一定排列順序、一定寬窄和染色深淺或明暗不同的帶,這就構(gòu)成了每條染色體的帶型。顯示染色體帶的過程稱為染色體顯帶。 染色體顯帶為染色體的研究提供了一個十分有效的方法。 染色體的顯帶技術(shù)分為兩大類:一類為整條染色體的顯帶技術(shù)；另一類為染色體局部的顯帶技術(shù)。,熒光原位雜交特點,1.熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全； 2.探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內(nèi)使用； 3.實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準確； 4.FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當； 5.多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色