分子生物學(xué)考點答案.doc

1移動基因：又叫轉(zhuǎn)位因子（transposable elements）,由于它可以在染色體基因組上移動，甚至可在不同染色體間躍遷，故又稱跳躍基因（jumping gene）。2斷裂基因：真核細胞的結(jié)構(gòu)基因，其核苷酸序列中含有與氨基酸編碼無關(guān)的DNA間隔區(qū)段，從而被分割成不連續(xù)的若干區(qū)域。將這種編碼序列不連續(xù)，有間隔區(qū)段的DNA片斷稱為斷裂基因3重疊基因：不同基因的核苷酸序列有時為相鄰兩個基因共用，將核苷酸彼此重疊的兩個基因稱為重疊基因（overlapping genes）。4假基因：在珠蛋白基因簇（gene cluster）各片斷核苷酸序列分析時發(fā)現(xiàn)，除了有正常的功能基因之外，還有功能失活的特殊序列片斷，它不能行使表達功能。該類無表達功能的畸變核苷酸基因序列片斷，稱為假基5同尾酶：有一些限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基順序不完全恒定，即識別順序不同，但酶切后產(chǎn)生同樣黏性末端的兩種酶稱為同尾酶，如BamH和Bgl 。6質(zhì)粒：細菌存在于細胞質(zhì)中的一種獨立于染色體以外的遺傳成分，是由環(huán)狀的DNA分子組成的復(fù)制子。質(zhì)粒有我復(fù)制和調(diào)控系統(tǒng)，可以在胞漿內(nèi)自主復(fù)制，把攜帶的遺傳信息通過自我復(fù)制的子代質(zhì)粒，可隨細菌分裂而進入子代菌體中。7COS質(zhì)粒，粘性質(zhì)粒（Cosmid）帶有噬菌體的Cos位點和整個pBR322的DNA順序。經(jīng)感染進入細菌細胞以后，它就好象質(zhì)粒那樣在細胞中進行復(fù)制。易環(huán)化和擴增。分子量小，可包裝30-45kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用于構(gòu)建基因文庫。8Cos位點（Cohesive-end site）： DNA為線狀雙鏈分子，兩端各有幾個堿基的單鏈互補粘性末端，通過粘性末端的互補作用形成雙鏈環(huán)形DNA。這種由粘末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段即Cos位點。9.COS細胞：用一個復(fù)制起始部位缺失的SV40突變種感染猴細胞，由于病毒DNA不能自主復(fù)制，便整合到宿主染色體DNA中，病毒DAN?,早期基因表達產(chǎn)生功能性的T抗原，這樣的細胞就叫COS細胞。10基因組文庫：分離真核生物中某種DNA成分, 通常是分離供體細胞中的染色體DNA，酶切后，將這些染色體DNA片段與某種載體相接，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，建立包含有真核細胞染色體DNA片斷的克隆株, 這種克隆株群體稱基因組文庫。11cDNA文庫：以mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將形成的互補DNA（cDNA ）建立基因文庫（gene library）12轉(zhuǎn)染：病毒（含噬菌體）DNA及其重組子DNA導(dǎo)入宿主細胞（或細菌）的過程稱轉(zhuǎn)染。13轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細菌的過程稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。14 轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒作為克隆載體將目的基因?qū)胨拗骷毎?。使原來細胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生15啟動子：是位于結(jié)構(gòu)基因上游，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控所必需的一段DNA序列，內(nèi)含-35區(qū)（與因子結(jié)合）和-10區(qū)（和核心酶結(jié)合）的保守序列。當啟動子與全酶結(jié)合后可在+1轉(zhuǎn)錄起始點開始轉(zhuǎn)錄。16 終止子：位于一個基因編碼區(qū)下游提供終止信號的DNA序列，可以被RNA聚合酶識別并發(fā)出停止mRNA合成的信號。17起始密碼子：編碼多肽鏈的第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細菌中也有罕見的其實密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表達作用AUGGUG。18終止密碼子：有三個密碼子（UAA, UAG，UGA），為終止密碼子，只表示鏈的終止，不表達氨基酸。19 鋅指結(jié)構(gòu)：由兩個半胱氨酸殘基和兩個組氨酸殘基通過位于中心的鋅離子結(jié)合成一個穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu)，表面暴露的堿基及其極性氨基酸與DNA結(jié)合有關(guān)。20粘性末端：是指DNA分子在限制酶切割后產(chǎn)生一條鏈多出幾個堿基的互補對稱的突出末端，若5突出稱5粘性末端，他們能夠通過堿基間的配對而重新環(huán)化起來，若平末端的DNA片段則不易重新環(huán)化。21PCR：聚合酶鏈反應(yīng)，以DNA變性復(fù)制的某些特性為原理，以目的DNA片段為模板, 利用酶促反應(yīng)（Taq酶），在特定引物的引導(dǎo)下，將加入的4種dNTP由引物沿模板從53按堿基配對原則, 形成與模板DNA互補的半保留復(fù)制鏈, 新合成的鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)25-30個循環(huán)產(chǎn)物呈 2n指數(shù)擴增，由pgg（紫外可見），可獲得基因片段。22Genomic DNA：基因組DNA，組成生物基因組的所有DNA，包含是一個生物體的全部遺傳信息，即DNA的全部核苷酸序列。 23Intron：即間隔子（內(nèi)含子），與原核的蛋白質(zhì)編碼基因相比，真核蛋白質(zhì)編碼基因最主要的特點是其轉(zhuǎn)錄區(qū)的編碼序列是間斷的不連續(xù)的，其中非編碼序列叫間隔子。它是轉(zhuǎn)錄物被剪除掉的相應(yīng)DNA分子。24Exon：即表達子（編碼序列），與原核的蛋白質(zhì)編碼基因相比，真核蛋白質(zhì)編碼基因最主要的特點是其轉(zhuǎn)錄區(qū)的編碼序列是間斷的不聯(lián)系的，其中編碼氨基酸的序列叫表達子。它是轉(zhuǎn)錄物經(jīng)加工后被保留的相應(yīng)的DNA分子。25轉(zhuǎn)錄（transcription）:遺生物體以DNA為合成RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶通過與一系列組分構(gòu)成動態(tài)復(fù)合體，并以DNA序列為遺傳信息模板，催化合成序列互補的RNA，包括轉(zhuǎn)錄起始、延伸、終止等過程。 26翻譯(translation): 在多種因子輔助下，細胞內(nèi)以mRNA模板，通過tRNA識別該mRNA的三聯(lián)體密碼子和轉(zhuǎn)移相應(yīng)氨基酸，進而按照模板mRNA信息依次連續(xù)合成蛋白質(zhì)肽鏈的過程。 27順式作用元件：順式作用元件為一些能與DBP結(jié)合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,決定轉(zhuǎn)錄起始位點和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。按功能可分為啟動子、增強子、沉默子、衰減子、終止子等DNA序列片段。28反式作用因子 ：反式作用因子是一組能直接或間接地與DNA的順式作用元件特定序列結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的核內(nèi)非組蛋白，即DNA結(jié)合蛋白（DBP），DBP又稱轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor,TF）分通用轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子兩大類?；虮磉_的組織特異性及細胞周期特異性受上述元件和因子的相互作用所決定。 29轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合在某基因上游特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，活化后從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至胞核，通過識別和結(jié)合基因啟動子區(qū)的順式作用元件,啟動和調(diào)控基因表達30瞬時表達 ：外源基因進入宿主細胞后，不整合到受體細胞染色體而立即轉(zhuǎn)錄，出現(xiàn)基因產(chǎn)物，它只在細胞內(nèi)進行暫時性表達，不能隨細胞傳代，隨后逐漸降低或消失。31穩(wěn)定表達 ：外源基因進入真核細胞后，可將基因整合到細胞染色體上，可隨細胞轉(zhuǎn)錄表達和傳代。32tk基因：胸苷激酶基因？胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（thymidine Kinase,TK）在所有真核細胞中都有表達, 是嘧啶生物合成補救代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶, 它可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dTMP, 繼續(xù)磷酸化生成dTTP, 參與DNA的生物合成。33亮氨酸拉鏈：存在與蛋白C末端，為兩組走向平行.帶亮氨酸的螺旋形成的對稱二聚體，約為30個氨基酸，每兩個亮氨酸之間隔有六個氨基酸，于是每兩圈螺旋就有一個亮氨酸，排成一排，從而在2個-螺旋的蛋白分子之間形成一條拉鏈。34基因突變：是基因組DNA分子在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變（通常它只涉及基因中部分序列的變化），并引起個體表型的改變, 而使生物體發(fā)生遺傳性變異。35同義突變：是指堿基被替代后, 沒有改變產(chǎn)物氨基酸序列, 這是與密碼子的簡并性相關(guān), 如CTT、CTC、CTA、CTG的第3位堿基互相替代后其編碼表達的產(chǎn)物均為亮氨酸,因此這種突變不產(chǎn)生突變效應(yīng)。 36錯義突變：是指堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸的序列改變。有些錯義突變嚴重影響到蛋白質(zhì)活性甚至完全失去活性，從而影響了表型。如果該基因是必需基因，則該突變?yōu)橹滤劳蛔儭?37.無義突變：某個堿基的改變可使某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子。如賴氨酸的密碼子AAG突變?yōu)榻K止密碼子TAG,使肽鏈合成過早終止, 因而蛋白質(zhì)產(chǎn)物一般沒有活性。若是發(fā)生在基因DNA的3末端處, 它所表達產(chǎn)生的多肽常有一定活性或有部分活性, 這種突變又稱為滲漏變型（leaky mutation）。 38限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶39基因拼接：將有共同限制性內(nèi)切酶切點的基因連接起來形成多種基因雜合體，這個過程稱為基因拼接。此外，也可根據(jù)需要將具有協(xié)同效應(yīng)的不同基因進行接拼。40基因缺失：將原基因中的非功能區(qū)域的編碼子人為地使之缺失的過程稱為基因缺失，所表達的產(chǎn)物相對分子質(zhì)量雖然小了，但有時可提高表達效率，有時還可降低一些毒性作用。41重組病毒載體：以SV40病毒為基礎(chǔ)，經(jīng)設(shè)計改造后的克隆載體。主要由兩種類型：取代型的重組病毒載體和重組的病毒-質(zhì)粒載體。42重組質(zhì)粒型載體：即重組病毒-質(zhì)粒載體，這類載體只取病毒基因組中維持在哺乳動物中進行復(fù)制的有關(guān)序列，使它與一個細菌質(zhì)粒融合，這樣的重組體也能夠在大腸桿菌中進行復(fù)制和增殖，不過這種載體（重組體）不能夠被包裝成病毒顆粒，不能出現(xiàn)裂解感染的情況，它實際上是一種類似于質(zhì)粒的DNA分子載體。43基因工程多肽疫苗：使微生物對人體具保護作用的抗原基因經(jīng)體外重組表達后所制備的生物活性多肽類疫苗稱基因工程多肽或亞單位疫苗。其表達系統(tǒng)可以是酵母，也可以是哺乳動物細胞，若無需糖基化的多肽疫苗甚至可在大腸桿菌等原核細胞中表達。44基因置換(gene reptacement)：是指將致病基因整個地被有功能的正常基因所置換，使致病基因永久地得到更正。但操作難度大，有倫理學(xué)問題。45基因修正(gene correction)是指將致病基因的突變堿基序列得以糾正，而正常序列部分予以保留，使突變的致病基因恢復(fù)正常功能。即使致病基因的突變序列糾正為正常序列（用堿基點突變技術(shù)）。 46基因修飾(gene augmentation)則是指將目的基因?qū)肴毕菁毎蚱渌毎?，目的基因的表達產(chǎn)物可修飾和改變?nèi)毕菁毎墓δ芑蚴乖械墓δ艿玫郊訌姟?47基因失活(gene inactivation)就是應(yīng)用反義技術(shù)(antisense technology)特異封閉某些基因的表達，以達到抑制或阻止某些有害基因的表達。SiRNA的基因干擾可造成靶基因（異常基因）的失活（或沉默）。48轉(zhuǎn)基因動物：就是把外源性目的基因?qū)雱游锏氖芫鸦蚱淠遗呒毎?，后改用注入受精卵的任何一個前核，并在細胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或囊胚細胞篩選出來，采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動物（foster mother）的子宮內(nèi), 使之發(fā)育成具表達目的基因的胚胎動物, 并能傳給下一代。這樣，生育的動物為轉(zhuǎn)基因動物。這類動物由于外源性目的基因的穩(wěn)定存在而賦于子代動物個體。49動物克隆：動物克隆是一種通過核移植過程進行無性繁殖的技術(shù)。發(fā)育早期的動物胚胎細胞，或成年動物的體細胞，經(jīng)顯微手術(shù)移植到去掉細胞核的卵母細胞中之后，在適當?shù)臈l件下，可以重新發(fā)育成正常胚胎。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動物個體。經(jīng)過核移植而產(chǎn)生的動物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細胞核供體完全相同。這種不經(jīng)過有性生殖過程，而是通過核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細胞核供體相同動物個體的技術(shù)，就叫做動物克隆。50基因敲除：是向正常生物個體內(nèi)引入某個突變基因位點而選擇性地使某特定基因功能失活的技術(shù)，可培養(yǎng)出靶向性剔除某基因的小鼠，而導(dǎo)致行為特性改變。51 ES細胞：胚胎肝細胞，不僅具有全能分化能力，而且可以在體外培養(yǎng)建立細胞株52基因組：表示某物種單倍體的總DNA。對于二倍體高等生物其配子的DNA總和即為一組基因組不同生物基因組數(shù)目不同。53基因表達：是目的基因DNA在導(dǎo)入的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA, 再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)。54RT-PCR：即逆轉(zhuǎn)錄PCR，先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以mRNA為模板合成DNA,再以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。這樣低濃度的mRNA被擴增放大易于檢測。是一種快速、簡便且敏感性極高的檢測RNA的方法，可用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、克隆cDNA及合成cDNA探針、改造cDNA序列等。55載體可以插入核酸片段、能攜帶外源核酸進入宿主細胞，并在其中進行獨立和穩(wěn)定的自我復(fù)制的核酸分子56基因 基因就是指編碼有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA分子所必須的全部核酸序列。1 什么叫做基因？何謂基因的新概念？基因的主要功能是什么?答：基因就是指編碼有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA分子所必須的全部核酸序列。所謂基因的新概念是隨著近年分子生物實驗技術(shù)的發(fā)展從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，提出的移動基因，斷裂基因，重疊基因，假基因等基因的新概念。功能：編碼蛋白質(zhì)或者RNA分子基本遺傳信息的基本遺傳單位，是構(gòu)成DNA的功能單位。2真核細胞基因組中的基因常有內(nèi)含子存在，能否在原核細胞中表達？能，為什么？不能，為什么？不能，因為原核細胞缺乏對真核基因中內(nèi)含子的剪接功能和轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。原核生物必須有相應(yīng)的原核RNA聚合酶可識別原核細胞的啟動子, 以催化RNA的合成。 基因表達是以操縱子為單位，操縱子由數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控功能的部位組成的。因此在構(gòu)建原核表達載體時必須有1個強的原核啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列。3試述DNA分子的結(jié)構(gòu)及其意義。答：DNA是一反向平行的互補雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA是右手螺旋結(jié)構(gòu)。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定橫向靠兩條鏈間互補堿基的氫鍵維系，縱向則靠堿基平面的疏水性堆積力維持。意義：雙鏈堿基互補特點揭示了DNA復(fù)制時兩條鏈可分別作為模板生成新的子代互補鏈，從而形成遺傳信息穩(wěn)定傳遞的半保留復(fù)制的機制。4 構(gòu)建cDNA文庫的意義？常用載體及構(gòu)建過程如何？答：意義：通過構(gòu)建cDNA文庫能直接分離到生命活動過程中的一些調(diào)控基因及了解這些基因所編碼的蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系因此cDNA文庫的構(gòu)建是基因克隆的重要方法之一，從cDNA文庫中可以篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達。它是發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的工具。常用載體是質(zhì)粒（噬菌體）。過程：1.制備mRNA 1)取材：mRNA約占總RNA的15，所以應(yīng)選用目的基因mRNA表達最豐富的組織細胞為材料來源，如獲胰島素基因，由應(yīng)以胰島細胞為原始生物材料，細胞因子基因應(yīng)選用經(jīng)抗原或絲裂原刺激培養(yǎng)的淋巴細胞為材料；2)從總的RNA中分離mRNA：將提取的mRNA在寡聚脫氧胸苷酸 oligo(dT) 纖維素中進行親和層析 2.第一股 cDNA合成 1）以O(shè)ligo(dT) 為引物：從模板3末端開始，沿模板的35方向合成, 對于較長的mRNA分子很難得到全長cDNA ；2）隨機引物：以68個核苷酸為隨機引物，從mRNA的不同結(jié)合點合成全長cDNA第一鏈（RNA-DNA）3.第二股cDNA的合成 自身引導(dǎo)法； 置換合成法； 外加引物合成法 4.cDNA與載體連接和導(dǎo)入宿主細胞5構(gòu)建基因組文庫的意義及構(gòu)建過程如何？答：意義：提供全套遺傳信息, 即完整的基因組DNA,可以研究基因組中5端控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列, 內(nèi)含子的分布和作用, 以及重復(fù)序列的數(shù)量分布及大小過程： 分離純化基因組DNA,提取哺乳動物細胞染色體DNA； 制備全部基因組的DNA片斷。機械斷裂法:用超聲波或高速攪拌DNA溶液斷裂片段兩端沒有與克隆載體匹配的粘末端，因此插入載體之前還需要進行修飾加工，少用限制性內(nèi)切酶降解（鳥槍法）過去用EcoR,現(xiàn)在用Sau3A斷裂片段兩端有與克隆載體匹配的粘末端，可以直接與處理過的載體連接。 DNA片斷與載體的連接包裝 常用載體：粘性質(zhì)粒 噬菌體 酵母人工染色體基因組DNA +粘性質(zhì)粒重組DNA轉(zhuǎn)化細菌菌落 基因組DNA +噬菌體重組DNA包裝成噬菌體感染細菌噬菌斑1個克隆含有基因組的某個片段，整個克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和。6什么是限制性核酸內(nèi)切酶？限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，簡稱限制酶。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu),輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性內(nèi)切酶同時具有修飾及認知切割的作用7.鏈終止DNA測序法基本原理是，聚丙烯酰胺凝膠能把長度只差一個核苷酸的單鏈DNA分子區(qū)分開，這意味著在長10-1500個核苷酸的范圍內(nèi)，所有分子經(jīng)電泳后可成為一系列可分辨的條帶，單鏈DNA分子的序列由與之互補的多核苷酸鏈的酶促合成來判定，互補鏈在某一特定的核苷酸位置即加入雙脫氧核苷酸的位置終止。 又稱Sanger（桑格）雙脫氧鏈終止法。是Sanger于1975年發(fā)明的。測序過程需要先做一個PCR反應(yīng)。PCR過程中，雙脫氧核糖核酸可能隨機的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核酸多脫了一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續(xù)增加長度。最終的結(jié)果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。目前最普遍最先進的方法，是將雙脫氧核糖核酸進行不同熒光標記。將PCR反應(yīng)獲得的總DNA通過毛細管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發(fā)出熒光。由于ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4種雙脫氧核糖核酸）熒光標記不同，計算機可以自動根據(jù)顏色判斷該位置上堿基究竟是A，T，G，C中的哪一個。8試繪圖并說明大引物PCR定點誘變法的過程。答：圖在P183頁 預(yù)先設(shè)計一個含有突變序列的引物2，第一輪以引物2和引物3擴增出短片段DNA 。待PCR產(chǎn)物分離純化后除去原來的引物，將PCR擴增產(chǎn)物作為大引物，并與引物1一起再對靶基因進行第二輪擴增，其PCR產(chǎn)物即為突變的DNA。9.何謂基因工程的四大里程碑和三大技術(shù)發(fā)明？答：四大里程碑：1944年Oswald報道肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗，明確遺傳物質(zhì)是DNA；1953年James waston和Francis Crick闡明了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)(半保留復(fù)制及其中心法則)；遺傳密碼子的破譯；基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)。三大技術(shù)發(fā)明：工具酶的發(fā)明（內(nèi)切酶、合成酶、連接酶）；基因合成和測序（合成儀、測序儀）；PCR技術(shù)（PCR擴增儀）。：10 基因重組是常用哪幾種載體？其共同特點如何？ 答：常用載體的種類：質(zhì)粒、噬菌體衍生物（COS、M13）、動物病毒；共同特征：自主復(fù)制易于擴增分離純化有非必需區(qū)有單一酶切位點（多克隆位點）單一酶切位點：一種酶在一個載體上只有一個酶切位點；多克隆位點：一個載體上的某一個區(qū)域含有多個單一酶切位點有選擇標記基因表達載體還應(yīng)有表達調(diào)控元件（啟動子、增強子、終止子,SD序列）11作為理想的質(zhì)粒載體有哪些基本條件？答：作為理想的質(zhì)粒載體，應(yīng)具備以下幾個條件（1）能自主復(fù)制，即本身是復(fù)制子（2）具有一種或多種限制酶的單一切割位點，并在此位點中插入外源基因片段，不影響本身的復(fù)制功能；（3）在基因組中有1-2個篩選標記，為寄主細胞提供易于檢測的表型特征，（4）分子量要小，多拷貝，易于操作。12什么叫插入失活，舉例說明之？P104 答：在含某個基因的載體中，將目的基因DNA片段插入該基因，導(dǎo)致該基因的功能失活。（4分）如：抗性基因的插入失活篩選，含Tetr和Ampr基因的載體，若將目的基因插入Tetr基因，導(dǎo)致Tetr基因失活，形成重組質(zhì)粒Tets和Ampr。13如何從所克隆到的基因重組體載體中鑒定基因的存在和正確性？答：（1）重組子大小鑒別篩選：重組子中裝有一段較大分子量的外源性基因，其分子量明顯比原載體大很多，因此可將提取的重組載體和原載體，用一種限制性內(nèi)切酶消化后，直接進行凝膠電泳，從而據(jù)其電泳特性而初步篩選重組子中是否插入外源基因片段。（2）酶切鑒定：對于篩選出的具有重組子的菌株，經(jīng)小量培養(yǎng)后，再分別提取原載體或重組載體DNA，根據(jù)已知重組時外源基因兩端的酶切位點，用相應(yīng)的兩種內(nèi)切酶進行酶解，經(jīng)瓊脂糖電泳后，就可以看出載體中是否含有目的基因片段，以及有DNAmarker條帶對比分析可得知插入基因片段的大小。（3）PCR篩選法：利用能與插入基因片段兩端互補的特異引物，以少量抽提的重組子DNA為模板進行PCR分析，能擴增出特異片段的轉(zhuǎn)化子為攜有目的基因的重組子（4）原位雜交：在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來的位置原位不變的轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位溶菌裂解，DNA變性和用特異探針進行雜交，從而鑒定出含有重組子的菌落或噬菌斑。14、質(zhì)粒單酶切點的基因連接如何降低本底和防止自我環(huán)化和提高連接效率？ 克服這一缺點的方法是：用細菌的或小牛腸的堿性磷酸酶（BAP或CAP），預(yù)先處理線性的載體DNA分子，以移去其末端的5/-P基團，于是在連接反應(yīng)中，它自己的兩個末端就再也不能被連接酶共價連接起來了。這樣形成的雜種DNA分子的每一個連接位點中，載體DNA都只有一條鏈是外源DNA連接上的，而另外一條鏈由于失去了5/-P基團，不能作此連接，故留下一個具有3/-OH和5/-OH的缺口，盡管如此，這樣的DNA分子仍然可以導(dǎo)入細菌細胞，并在寄主細胞內(nèi)完成缺口的修復(fù)工作。15如何利用抗體標記基因篩選陽性克?。看穑捍蠖鄶?shù)質(zhì)粒載體均帶有抗生素抗性基因，常見的有抗氨芐西林基因，抗四環(huán)素基因等，當帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化抗性細胞后，所有轉(zhuǎn)入載體的細菌都獲得了抗性，被轉(zhuǎn)化的陽性克隆菌能在相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長，并形成菌落，而未被轉(zhuǎn)化的原宿主菌則不能生長，據(jù)此可篩選攜帶外源基因的重組DNA轉(zhuǎn)化子。在含有兩個抗性基因的載體中，如果目的基因DNA片段插入其中一個抗性基因，就會導(dǎo)致該抗性基因的功能失活，用兩個分別含不同抗生素藥物的平板進行對照篩選，可篩選出陽性重組子克隆菌體。16真核表達調(diào)控的順式作用元件有哪些？其作用特點是什么？ 答：順式作用元件有：啟動子，增強子，沉默子，衰減子，終止子。作用特點：是能夠與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的特定序列的DNA片段，決定轉(zhuǎn)錄起始位點和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。真核表達調(diào)控的反式作用因子有哪些？其作用特點？答：反式作用元件：主要分為通用轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子兩大類。作用特點：一，同一DNA序列可被不同蛋白質(zhì)識別；二：同一蛋白質(zhì)因子可與多種不同DNA序列發(fā)生聯(lián)系，多通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)先結(jié)合再影響DNA。三：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA的結(jié)合，導(dǎo)致構(gòu)象上細微的改變，從而發(fā)揮調(diào)控作用。四：反式作用元件在合成過程中有相當大的可變性和可塑性。17、目的基因表達系統(tǒng)有哪幾種？其特點如何？1）細菌表達系統(tǒng)：采用大腸桿菌。表達水平高，約占菌體總蛋白的1040，不能糖基化，產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，表達產(chǎn)物不具有天然蛋白質(zhì)構(gòu)型，大多聚積在細菌包涵體中，分離純化較復(fù)雜；2）酵母表達系統(tǒng)：采用啤酒酵母或畢氏酵母。表達水平介于細菌與哺乳動物細胞之間，表達產(chǎn)物接近天然蛋白構(gòu)型，雖能糖基化，但糖基化結(jié)構(gòu)和數(shù)量有一定差異，多數(shù)能分泌到胞外培養(yǎng)液內(nèi)，分離純化較簡易，無需進行復(fù)性加工；3）昆蟲細胞多角體病毒表達系統(tǒng)：采用對昆蟲細胞敏感的多角體病毒DNA。表達水平1500mg/L,具有良好的翻譯后修飾功能，表達產(chǎn)物接近天然的蛋白構(gòu)型，糖基化結(jié)構(gòu)和數(shù)量稍有差異。4）哺乳動物細胞表達系統(tǒng)：常用中國倉鼠卵巢細胞為表達系統(tǒng)。表達水平僅為細菌表達量的5，表達產(chǎn)物更接近天然蛋白構(gòu)型，有正確糖基化結(jié)構(gòu)與數(shù)量，通常分泌于胞外培養(yǎng)液內(nèi)，分離純化較簡易，無需進行復(fù)性加工可獲得高活性生物活性產(chǎn)品。18基因工程疫苗研究開發(fā)常用的技術(shù)途徑有哪些？19基因治療展望和應(yīng)用如何？答：展望：盡管基因治療目前還存在很多問題，但它是人類治療疑難疾病的新方法，新技術(shù)，隨著研究和應(yīng)用的不斷發(fā)展，不斷深入，技術(shù)不斷完善成熟，基因治療將會在人類常見病和多發(fā)病及疑難病的有效治療中發(fā)揮巨大作用，許多原來視為“不治之癥”的疾病將應(yīng)用這先進技術(shù)得到治愈，其應(yīng)用前景極為廣闊。應(yīng)用：1，現(xiàn)在已有部分基因的基因治療計劃在執(zhí)行標記或治療。2，基因治療人體試驗，到目前為止，已有部分經(jīng)批準或經(jīng)實施。3，有部分人體基因治療計劃將開始進行。基因治療的臨床應(yīng)用（一）遺傳性疾病的基因治療 （二）腫瘤的基因治療 （1）抑癌基因轉(zhuǎn)移的基因治療（2） 反義寡核苷酸的原癌基因失活療法 （3）藥物自殺基因在腫瘤基因治療中的應(yīng)用 （4）癌抗原基因轉(zhuǎn)移的腫瘤基因治療如打破原先的腫瘤免疫的耐受，建立腫瘤特異免疫 （5）多重耐藥性基因轉(zhuǎn)移的腫瘤基因治療（三）抗病毒的基因治療 阻止病毒復(fù)制策略、使感染HIV細胞死亡的方法、 降解策略20有哪幾種反義核苷酸基因失活療法？簡述其原理。答：1，將特異的反義基因重組到表達載體上，導(dǎo)入靶細胞中轉(zhuǎn)錄出反義RNA，形成雙鏈RNA,阻礙基因的翻譯。2，人口合成寡聚脫氧核糖核酸經(jīng)過化學(xué)修飾導(dǎo)入細胞，與mRNA與 DNA結(jié)合，形成RNA/DNA雜鏈或DNA核苷酸三聚體，影響基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄。3，特異性的核酸，根據(jù)癌基因設(shè)計出特異的“錘頭”或“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，它能夠催化切割，降解異常表達基因的mRNA而影響基因的翻譯。原理：反義RNA是一種與mRNA互補的RNA分子，它是雙鏈DNA中無意義鏈轉(zhuǎn)錄的RNA，因此腫瘤癌基因活化表達的mRNA的起始翻譯部位就會被相應(yīng)的反義RNA互補結(jié)合形成RNA/RNA雙鏈體，進而就阻止了核糖體與后動子結(jié)合，或阻止核糖體mRNA上移，以抑制mRNA的翻譯，起到了抑癌基因過高表達癌蛋白的效果。21何謂“動物克隆技術(shù)”？有何應(yīng)用價值？答：動物克隆是一種通過核移植過程進行無性繁殖的技術(shù)。發(fā)育早期的動物胚胎細胞，或成年動物的體細胞，經(jīng)顯微手術(shù)移植到去掉細胞核的卵母細胞中之后，在適當?shù)臈l件下，可以重新發(fā)育成正常胚胎。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動物個體。經(jīng)過核移植而產(chǎn)生的動物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細胞核供體完全相同。這種不經(jīng)過有性生殖過程，而是通過核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細胞核供體相同動物個體的技術(shù)，就叫做動物克隆。和轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)不同，動物克隆技術(shù)是核移植的一種無性繁殖法。動物克隆技術(shù)不僅理論上有重大突破，無需有性繁殖即可生產(chǎn)動物，而且可利用克隆羊技術(shù)來克隆人體器官，有醫(yī)學(xué)價值，還可使難以生殖或即將滅種的動物（如熊貓）采用無性繁殖方式來繁殖后代，因此引起全世界關(guān)注?，F(xiàn)又有克隆牛、克隆豬、克隆羊的問世，現(xiàn)在正在克隆熊貓。22 PCR基本原理PCR是在試管中進行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR全過程每一步的轉(zhuǎn)換是通過溫度的改變來控制的。需要重復(fù)進行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶