器官移植配型.ppt

器官移植配型理論與技術(shù),1,基本概念,廣義的器官移植：用自身或異體的正常器官、組織或細胞置換病變或功能缺失的器官、組織或細胞，以維持和重建機體的生理功能。 影響移植成功的關(guān)鍵因素是可能發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)；,2,一. 基本概念,人,人,豬,相關(guān)概念,同種異體移植,異種移植,同系移植,移植,自體移植,3,引起排斥反應(yīng)的抗原,ABO血型抗原； 組織特異性抗原； 主要組織相容性抗原(MHA, major histocompatibility antigen )，又稱人類白細胞抗原（HLA）; 次要組織相容性抗原（mHA, minor histocompatibility antigen ）H-Y抗原;,4,HLA的基因結(jié)構(gòu)、抗原結(jié)構(gòu)及特點,由第6號染色體短臂21.31區(qū)編碼，按功能分為HLA-I,三個區(qū)域，其中I,區(qū)編碼抗原與移植關(guān)系密切。,HLA-I類抗原主要由A、B、C位點編碼； HLA-類抗原由DR、DP、DQ位點編碼；,5,HLA-I類抗原是由第6號染色體相應(yīng)I類基因編碼的鏈與第15號染色體編碼的2微球蛋白非共價鍵結(jié)合的糖蛋白，主要表達在有核細胞表面； HLA-類抗原由第6號染色體相應(yīng)類基因編碼的鏈和鏈非共價鍵結(jié)合的糖蛋白，主要表達在抗原遞呈細胞，胸腺上皮細胞表面；,6,HLA抗原的生物學(xué)功能,1.參與蛋白質(zhì)抗原的處理與遞呈； 2.調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答； 3.參與T細胞分化過程； 4.介導(dǎo)同種免疫應(yīng)答；,7,HLA基因的遺傳特點,1.高度多態(tài)性；HLA基因呈現(xiàn)多位點復(fù)等位的特點； 2.共顯性遺傳：每對等位基因同時表達； 3.單倍型遺傳：位于同一條染色體上的 HLA各位點的基因組合； 4.連鎖不平衡：單倍型基因非隨機分布的現(xiàn)象；,8,2.傳統(tǒng)的HLA分型技術(shù),血清學(xué)分型:補體依賴的細胞毒實驗; 待測淋巴細胞與已知抗體孵育，再加入補體，若該抗體與淋巴細胞膜上HLA分子相匹配，則激活補體系統(tǒng)導(dǎo)致待測細胞膜的破壞，否則細胞膜完整不受影響。 局限性：需要活的淋巴細胞；存在交叉反應(yīng)；隱蔽抗原無法識別；人為影響因素多質(zhì)控難做；,9,細胞學(xué)分型：混合淋巴細胞培養(yǎng)技術(shù)； 受者淋巴細胞與已知類型的淋巴細胞或者供者淋巴細胞混合培養(yǎng)，兩種細胞HLA分子表型如果相同則不能刺激淋巴細胞增殖，反之則刺激淋巴細胞增殖，分為單雙向兩種類型。 局限性：需要活的純合子表型的淋巴細胞；增殖檢測方法要用到同位素；,10,分子生物學(xué)技術(shù)分型,HLA抗原蛋白分子的多態(tài)性取決于相應(yīng)編碼基因的多態(tài)性； RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP; PCR-SSCP; PCR-Sequencing； PCR-SSO/基因芯片技術(shù)； 流式細胞儀技術(shù)； 氨基酸殘基配型標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)；,11,聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 在多聚合酶，引物，底物和模板的參與下通過變性，退火，延伸三個循環(huán)步驟在短時間內(nèi)達到對目的片斷的大量擴增，是基因 分型的基礎(chǔ)。,12,2019/10/26,13,RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP/ 基因組DNA 提取 酶切 電泳分析（RFLP） DNA 擴增（共性引物/特異性引物） (限制性內(nèi)切酶酶切) 電泳檢測(PCR-RFLP/PCR-SSP),14,PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）,提取基因組DNA PCR擴增（特異引物） 變性(雙鏈 單鏈) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)帶型可檢出基因的多態(tài)性又可檢出點突變，有利于發(fā)現(xiàn)新的等位基因,15,PCR-sequencing,提取基因組DNA PCR擴增（非特異/特異引物）DNA測序 最可靠、直接、準(zhǔn)確的HLA分型方法； 臨床上應(yīng)用限制了供體的來源； 在確定等位基因的多態(tài)性、發(fā)現(xiàn)新位點、基因定位等研究領(lǐng)域應(yīng)用較多；,16,PCR-SSO（序列特異性寡核苷酸探針雜交）/基因芯片技術(shù),正向雜交：提取基因組DNA PCR擴增（共性引物） 將PCR產(chǎn)物固定在固相支持載體上并進行變性處理 與標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針變性雜交 根據(jù)雜交信號判斷HLA類型； 反向雜交：將特異性寡核苷酸探針固定在固相載體上 與標(biāo)記的PCR產(chǎn)物（已經(jīng)變性處理）雜交 根據(jù)雜交信號判斷HLA類型； 基因芯片技術(shù)是一種反向PCR-SSO方法，具有高通量、縮微化、自動化程度高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢；,17,流式細胞儀技術(shù),提取基因組DNA 非特異性PCR擴增 變性處理 與包被了特異性HLA探針的微球結(jié)合 洗脫處理 通過流式細胞儀檢測 利用流式細胞儀技術(shù)將反向的固相PCRSSO技術(shù)變?yōu)橐合鄼z測分析技術(shù)； 每種包被了不同類型HLADNA探針的微球?qū)?yīng)一種熒光染色能夠被流式細胞儀識別； 具有高通量、準(zhǔn)確快速的優(yōu)勢；,18,氨基酸殘基配型標(biāo)準(zhǔn)分型技術(shù),根據(jù)HLA分子346個氨基酸殘基中對移植物排斥與存活率具有重要影響的關(guān)鍵氨基酸，當(dāng)供受者的關(guān)鍵氨基酸殘基相同，盡管接受HLA抗原部分錯配的供體，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性仍然是低反應(yīng)性或無免疫反應(yīng)性，從而使移植物得以長期存活。,19,HLA分型技術(shù)臨床應(yīng)用評價,1.在器官移植中具有重要臨床意義； 六位點配型原則：HLA-A/B/DR 2.合理選擇HLA基因分型技術(shù)； 各種方法相互補充，難以相互替代，根 據(jù)不同需求選擇不同方法,20,抗原法/基因法,21,字母HLA代表染色體上一段特殊的遺傳區(qū)域（人類白細胞表面抗原區(qū)域）； A/B/DR代表該區(qū)域某一具體的基因座位； 數(shù)字代表該基因座位編碼的特異性抗原（血清型）