（有機(jī)化學(xué)專業(yè)論文）afm檢測(cè)生物分子間作用力及星狀光電分子的合成與表征.pdf

覆算父擎 摘要 摘要 本論文的研究?jī)?nèi)容主要涉及兩方面的內(nèi)容：其一為原子力顯微鏡測(cè)量生物分 子間作用力的研究，這是本人作為交流學(xué)生在日本東京農(nóng)工大學(xué)生物技術(shù)與生命 科學(xué)系完成；其二是設(shè)計(jì)、合成了可用于表面自組裝研究的一系列端基帶有氫鍵 基團(tuán)的星狀兀共軛分子。 生物大分子間存在高特異性相互作用力，它們?cè)谡{(diào)控分子識(shí)別過程中起到了 相當(dāng)重要的作用。了解、檢測(cè)和分類生物體系問的相互作用力已經(jīng)成為現(xiàn)階段生 物學(xué)以及相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。而原子力顯微鏡作為表征形貌和測(cè)量分子間作用 力的手段，能有效地和定量化地計(jì)算生物體系中兩類分子之間的特異性作用力。 在本課題中，我們選用的鋅指是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠和特異性的d n a 結(jié)合 起到基因轉(zhuǎn)錄的作用。我們將z i 億6 8 和目標(biāo)d n a 分別化學(xué)修飾在a f m 針尖和 玻璃基板上，利用a f m 測(cè)定一系列z 娩6 8 一d n a 體系的力曲線，并計(jì)算歸納獲 得z i f 2 6 9 - - d n a 復(fù)合物的解離力大小。同時(shí)由于z i 岔6 8 和非特異性作用的d n a 之問存在一定的作用力，所以課題設(shè)計(jì)了有效的對(duì)比試驗(yàn)用以證實(shí)z 舵6 8 和目 標(biāo)d n a 分子之間的特異性作用力，得出了z i f 2 6 8 和目標(biāo)d n a 之間特異性作用 力的數(shù)值，并將其和已有文獻(xiàn)的相關(guān)報(bào)道進(jìn)行對(duì)比用以證明其可信性。另外，也 計(jì)算出非特異性作用力的大小，并且對(duì)其產(chǎn)生的原因進(jìn)行了分析和闡述。 把結(jié)構(gòu)明確的兀共軛寡聚物進(jìn)行超分子組裝將會(huì)對(duì)分子電子器件的發(fā)展產(chǎn) 生決定性的影響；因?yàn)楣丫畚锓肿哟_定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)有助于實(shí)現(xiàn)特定的 功能以及便于實(shí)現(xiàn)超分子結(jié)構(gòu)的調(diào)控。同時(shí)，這些分子器件的性能與分子在固體 表面的排布形態(tài)有著密切的相互關(guān)聯(lián)性。因此，更好的理解并調(diào)控兀共軛寡聚物 在自組裝單層膜中的取向與聚集形態(tài)對(duì)于發(fā)展未來的納米器件是至關(guān)重要的。在 本課題中，我們?cè)O(shè)計(jì)、合成了一系列的星狀冗共軛分子，包括分別含有一、二、 三個(gè)羧酸端基的星狀芴和以及結(jié)構(gòu)更為剛性的三個(gè)端基均為2 ，4 一二胺基三嗪 環(huán)的三聚茚分子，以此形成一個(gè)系列的分子結(jié)構(gòu)，便于進(jìn)行系統(tǒng)性研究。同時(shí)我 們對(duì)這些星狀分子的溶液和薄膜分別進(jìn)行了紫外和熒光光譜的表征。最終這些功 能性分子將有望由氫鍵誘導(dǎo)在石墨或者金屬表面形成有序的自組裝結(jié)構(gòu)。我們期 望通過不同類型氫鍵的引入，實(shí)現(xiàn)共軛光電分子在納米尺度的可控構(gòu)筑，并為未 來的分子光電器件的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：原予力顯微鏡，生物分子作用力，力曲線，星狀共軛分子，表面自組裝 槎星父擎 a b s t r a c t 1 1 把r e s e a r c ho ft h i st h e s i sa r ef o c u s e do nt w oa s p e c t s ：o n ei st h er e s e a r c ho n b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o nf o r c e sa n a l y z e db ya t o mf o r c em i c r o s c o p e ( a f m ) ，w h i c h w a sp r o c e s s e di nd e p a r t m e n to fb i o t e c h n o l o g ya n db i o s c i e n c e ，t o k y ou n i v e r s i t yo f a 掣i c u l t u r ea n dt e c h n o l o g y 1 1 艙s e c o n dw o r ki sd e s i g na n ds y n t h e s e so fas e r i e so f s t a r - s h a p ec o n j u g a t e dm o l e c u l e se n d - c a p p e dw i t hh y d r o g e nb o n d i n gg r o u p s h i g h l ys p e c i f i ci n t e r a c t i o n s e x i s ti nb i o m o l e c u l a rs y s t e m t h e y p l a ynv e r y i m p o r t a n t r o l e i nm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n 1 1 ”k n o w l e d g e c h a r a c t e r i z a t i o na n d c l a s s i f i c a t i o no fb i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n sb e c o m et h er e s e a r c hh o t s p o tf o rb i o l o g y a n ds o m er e l a t e ds c i e n c e a f mc a nb ee m p l o y e dt oe f f i c i e n t l ya n d q u a n f i f i c a t i o n a l l y c h a n k ：t i 哦靄t h es p e c i f i cf o r c ei n t e r a c t i o n sb e t w c e mb i o m o l e c u l e s z i n c f i n g e r p m t e i n sa a ni m p o r t a n te f f e c ti nt r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o nd u et ot h e i ri n t e r a c t i o n s w i t hd n a t h e r e f o r e ，i nt h i sp r o j e c tw es e l e c t e dz i f 2 6 8 - d n ac o m p l e xa so n r r e s e a r c ht a r g e t z i f 2 6 8w e r eb o u n do l lt h es u r f a c eo fa na f m t i pa n dt h et i pw a s a p p r o a c h e dt o c o n t a c tt a r g e tm o l e c u l e sw h i c hw o r ei m m o b i l i z e do nt h es u b s t r a t e t h e n , t h ef o r c er e q u i r e dt ou n b i n dt h eb i n d e r - t a r g e tc o m p l e xw a se s t i m a t e df r o m f o r c e - d i s t a n c ec n r v e so b s e r v e dd u r i n gt h ew i t h d r a w a lo ft h et i pf r o mt h es u b s t r a t e d u et ot h eo c c u r r e n c eo fn o n - s p e c i f i ci n t e r a c t i o n s 咖嘲z i f 2 6 8a n dd n a p a r a l l e l e x p e r i m e n t sw c r ed e s i g n e da n dp e r f o r m e dt od i s c r i m i n a t es p e c i f i ci n t e r a c t i o n sa m o n g t h ec o m p l e xp r o t e i n - d n ai n t e r a c t i o n s w ea l s oq u a n t i f i e dt h es p e c i f i ci l h c r a c t i o n b e t w c e nz i 億6 8a n dt a r g e td n aa n ds u m m a r i z e dt h ec m i s 錨f o rn o n - s p e c i f i c i n 刪o u s , b a s e do ns t a t i s t i c a la n a l y s i so f t h ef o r c ec u r v 器 硼磚s u p r a m o l e c u l a ro r g a n i z a t i o no f 兀c o n j u g a t e do l i g o m e r sw i t hw e l l - d e f i n e d s t r u c t u r e sw i l lh a v ec r u c i a li n f l u e n c e so l lm o l e c u l a re l e c t r o n i cd e v i c e s o l i g o m e r s h a v ed e f i n e dc h e m i c a ls t r u c t u r e sa n dp h y s i c a lp r o p e r t i e s , w h i c hc o n t r i b u t et or e a l i z e s o m cs p e c i f i cf u n c t i o n a l i t i e sa n dt u n es u p r a m o l e c u l a rs l r l l l ：t u r e s m e a n w h i l e ，t h e m o l e c u l a rp a t t e ms t r n c r i r e so nt h es u r f a c eh a v eg r e a te f f e c t so nt h ep r o p e r t i e so f t h e s em o l e c u l a rd e v i c e s t h u s ，i ti sg r e a te s s e n t i a lt ou n d e r s t a n da n dc o n t r o lt h e o r i e n t a t i o no f t h e s ec o n j u g a t e do l i g o m e r si nt h e i rs e l f - a s s e m b l ym o n o l a y e r s ，f o rb e t t e r d e v e l o p m e n to fn a n o - d e v i c e s i nt h i sp r o j e c t , as e r i e so fs t a r - s h a p e do p t o - e l e c t r o n i c m o l e c u l e se n d - c a p p e dw i t hh y d r o g e nb o n d i n gg r o u p sw e r es y n t h e s i z e dw h i c hw o u l d b eg o o dc a n d i d a t e sf o rh y d r o g e nb o n d i n gi n d u c e ds e l f - a s s e m b l ym a t e r i a l so ng r a p h i t e o rm e t a ls u r f a c e o n e ，t w oa n dt h r e ec a r b o x y lt e r m i n a lg r o u p sw e r ei n t r o d u c e di n t o 覆算戈葶a b s t r a c t s t a r - s h a p e do l i g o f l u o r e n e s r e s p e c t i v e l y ；a n dm o r ep l a n a rc o r es t r u c t u r et r u x e n ew i 出 1 ，3 ，5 - t r i a z i n e - 2 ，4 一d i a m i n e ( 1 ) e n d - g r o u p sw i g _ l - ea l s od e s i g n e da n ds y n t h e s i z e df o r s y s t e m a t i cr e s e a r c ha n dc o m p a r i s o n t h eo p t i c a lp r o p e r t i e so ft h e s em o l e c u l e sw e r e c h a r a c t e r i z e db yu v - v i sa n df l u o r e s c e n c es p e c t r a , w h i c hi m p l i e dt h a tt h es t a r - s h a l 喊! c o r ea n dt h el o n ga l k a n es i d ec h a i n sc o u l ds u b s t a n t i a l l ys u p p r e s si n t e r m o l e c u l a r 兀吼 a g g r e g a t i o n k e y w o r d s ：a f m ，b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n , f o r c ec u r - v e ，s t a r - s h a p e dc o n j u g a t e d m o l e c u l e ，s u r f a c es e l f - a s s e m b l y 論文獨(dú)創(chuàng)性聲明 木論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。論文巾除 了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的 研究成果。其他同志對(duì)本研究的啟發(fā)和所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作廣l 月確的聲叫 并表示了謝意。 作者簽名：王送堇盛日期：望：z 墨：夠 論文使用授權(quán)聲明 本人完全了解復(fù)旦大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留 送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi) 容，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此 規(guī)定。 作者簽名：盤重筻遂導(dǎo)師簽名日期：趟7 l 乞1 嶧 在算太擎 第一章緒論 第部分生物體系作用力的原子力顯微鏡研究 1 1 原子力顯微鏡 第一章緒論 1 9 8 6 年，i b m 公司的qb i n n i n g 和斯坦福大學(xué)的c eq u a t e 及c g e r b e r 合 作發(fā)明了原子力顯微鏡( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) i i l 。它是在掃描隧道顯 微鏡( s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p y ，s t m ) 基礎(chǔ)上為觀察非導(dǎo)電物質(zhì)經(jīng)改進(jìn)而 發(fā)展起來的可在分子和原子級(jí)進(jìn)行觀察的顯微工具。原子力顯微鏡自問世以來， 已經(jīng)有多項(xiàng)應(yīng)用擴(kuò)展。一開始，通過a f m 探針與被測(cè)樣品之間存在的微弱的相 互作用力( 原子間相互作用力) 可以使用a f m 來獲得物質(zhì)表面的形貌。之后， 人們利用原子力顯微鏡技術(shù)研究生物體系中單個(gè)生物分子的特性或生物分子之 間的相互作用。最近，通過修飾和操控a f m 的探針成功實(shí)現(xiàn)了單分子操縱技術(shù)。 原予力顯微鏡的橫空出世和潛在應(yīng)用使得人們?cè)谖㈦娮蛹夹g(shù)、生物技術(shù)、基因工 程、生命科學(xué)、材料科學(xué)、表面技術(shù)、信息技術(shù)1 2 l 和納米技術(shù)等各種尖端科學(xué)領(lǐng) 域的探索和發(fā)展更進(jìn)一步。 1 1 1 先進(jìn)顯微技術(shù)的歷史發(fā)展 掃描探針顯微鏡( s p m ) 是繼光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡之后的第三代顯微鏡， 這是一種以物理學(xué)為基礎(chǔ)，集多種現(xiàn)代科技為一體的新型表面分析儀器。1 9 8 1 年，gb i n n i g 和h r o h r e r 3 j 發(fā)明了掃描隧道顯微鏡( s t m ) ，并因此被授予1 9 8 6 年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。s t m 是基于量子力學(xué)的隧道效應(yīng)，通過一個(gè)由壓電陶瓷驅(qū) 動(dòng)的探針在物體表面作精確的二維掃描，其掃描精度達(dá)到納米級(jí)別。該探針尖端 可以制成只有一個(gè)原子大小的粗細(xì)，并且位于距樣品表面足夠近的距離內(nèi)，以使 探針尖端與樣品表面之處的電子云有些微重疊。這時(shí)若在探針與樣品表面之間加 一上定的偏壓，就會(huì)有一種被稱作為隧道電流的電子流流過探針。這種隧道電流 對(duì)探針與物體表面的間距十分靈敏，從而在探針掃描時(shí)通過感知這種隧道電流的 變化就可以記錄下物體表面的起伏情況。這些信息再經(jīng)計(jì)算機(jī)重建后就可以計(jì)算 機(jī)屏幕上獲得反映物體表面形貌的直觀圖象。但由于s t m 要求使用導(dǎo)電基底，通 常是高定向裂解石墨( h o p g ) 、金屬等，而月這些基底用來觀測(cè)生物樣品時(shí)，非 常易于產(chǎn)生同螺旋d n a 和其他生物大分子相像的假象。另外，由于不清楚隧道 電子是如何同非導(dǎo)電吸附材料相作用的，很難判斷生物大分子s ，r m 圖像的真實(shí) 性。這些限制了s t m 在生物大分子研究中的廣泛應(yīng)用。而隨著生物技術(shù)的進(jìn)步， 復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文 特別是基因工程和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，在分子尺度觀察、測(cè)量生物分子結(jié)構(gòu)和相 互作用變得越來越重要和迫切。 在s t m 的基礎(chǔ)上，gb i n n i n g 、c eq u a t e 及c g e r b e r 合作發(fā)明了原子力顯微 鏡( 越m ) ，將觀察對(duì)象由導(dǎo)體、半導(dǎo)體擴(kuò)展到絕緣體。i v a na m a t o 將a f m 比作 為“納米世界的選拍照相機(jī)”1 4 1 ，彌補(bǔ)了s t m 在生物研究領(lǐng)域的不足，同時(shí)它又 成為觀察物質(zhì)表面、對(duì)原子和分子進(jìn)行操縱的一個(gè)有效工具1 5 1 。a f m 可直接對(duì)脫 氧核糖核酸( d n a ) 、核糖核酸( r n a ) 和它們的蛋白或其他配合體、復(fù)合物結(jié) 構(gòu)進(jìn)行研究。同時(shí)，樣品制備上避免了電子顯微鏡成像過程中所需要的噴鍍、染 色和標(biāo)記等用來增加圖像反差的復(fù)雜處理步驟。a f m 也能夠像在空氣中一樣在 液體中操作，因此能在接近生理?xiàng)l件的緩沖溶液中成像生物分子。a f m 的水平 分辨率一般是5 1 0 n l n ( 和針尖的曲率半徑有關(guān)) ，因此a f m 是第一個(gè)，目前也 是唯一能在近似生理?xiàng)l件下對(duì)生物樣品成像達(dá)到納米分辨率的檢測(cè)技術(shù)。 近年來，在s t m 和a f m 的理論基礎(chǔ)上，各種掃描力顯微術(shù)發(fā)展很快，相 繼發(fā)明了力調(diào)制顯微鏡( f o r c em o d u l a t i o nm i c r o s c o p y ，f m m ) 、相位檢測(cè)顯微鏡 ( p h a s ed e t e c t i o nm i c r o s c o p y ，p d m ) 、靜電力顯微鏡( e l e c t r i cf o r c em i c r o s c o p y ， e f m ) 、電容掃描顯微鏡( s c a n n i n gc a p a c i t a n c em i c r o s c o p y ，s c m ) 、熱掃描顯微 鏡( s c a n n i n gt h e r m a lm i c r o s c o p y ，s t h m ) 和近場(chǎng)光學(xué)掃描顯微鏡( s c a n n i n g n e a r - f i e l do p t i c a lm i c r o s c o p y ，n s o m ) 等各種系列顯微鏡。由于以上顯微鏡均 是基于探針在被測(cè)試樣表面上進(jìn)行二維掃描引起相關(guān)檢測(cè)量變化的原理而研制 的設(shè)備，因此國(guó)際上稱以上各系列顯微鏡為掃描探針顯微鏡( s c a n n i n gp r o b e m i c r o s c o p y , s p m ) 。 1 1 2 原子力顯微鏡的工作原理 a f m 主要由為反饋光路提供光源的激光系統(tǒng)( l a s e r ) 、實(shí)現(xiàn)力一距離反饋的 微懸臂系統(tǒng)( c a n t i l e v e r ) 、執(zhí)行光柵掃描和z 軸定位的壓電掃描器( x ，y z p i e z o - s c a n n e r ) 、接收光反饋信號(hào)的光電探測(cè)器( d e w e t o r ) 、反饋電子線路( c u r r e n t c i r c l e ) 、粗略定位系統(tǒng)、防震防噪聲系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)與數(shù)據(jù)處理軟件、樣 品探測(cè)環(huán)境控制系統(tǒng)( 濕控、溫控、氣環(huán)境控制等) 、監(jiān)控激光一懸臂一樣品相 對(duì)位置的顯微及c c d 攝像系統(tǒng)等構(gòu)成。其中，前四大系統(tǒng)是該儀器的核心部件。 圖1 1 為原子力顯微鏡主要部件和工作原理圖。 a f m 是使用一個(gè)一端固定而另一端裝有針尖的彈性微懸臂來檢測(cè)樣品表面 形貌的。當(dāng)樣品在針尖下面掃描時(shí)，同距離有關(guān)的針尖一樣品相互作用( 即可能 是吸引的，也可能是排斥的) 和其他相互作用力，就會(huì)引起微懸臂的形變。也就 是說，微懸臂的形變是對(duì)樣品一針尖相互作用的直接測(cè)量【6 】?？刂漆樇饣驑悠返?2 覆算天擎 第一章緒論 匝刨隧世h暑愛ii匭 霉-o譬。盆j-!ii曼臼弓置矗墨昌。盤。盤_篁ou_舞io疊00 e遼斗g基b葚8_fp：哨莛怠弋 復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文 z 軸位置，利用激光束的反射來檢測(cè)微懸臂的形變。即使小于0 0 1i l l l l 的微懸臂 形變，只要用激光束將它反射到光電檢測(cè)器后，變成了3 1 0 n m 的激光點(diǎn)位移， 由此在光電倍增管上產(chǎn)生一定的電壓變化。通過測(cè)量檢測(cè)器電壓對(duì)應(yīng)樣品掃描位 置的變化，就可得到樣品的表面形貌圖像。商業(yè)用的微懸臂具有的彈簧常數(shù)( k ) 一般為o 0 0 4 - - 1 1 8 5n m ，針尖曲率半徑大約為3 0n m 。 1 1 3 原予力顯微鏡的操作模式 a f m 有三種不同的常用操作模式：接觸模式( c o n t a c tm o d e ) ，輕敲模式 ( t a p p i n gm o d e ) 和非接觸模式( n o n - c o n t a c tm o d e ) 。其中，最常用的是接觸式 和輕敲模式。圖1 2 給出了a f m 不同操作模式在針尖和樣品相互作用力曲線中的 工作區(qū)間。 一|，排斥力區(qū) 吸引力區(qū) 接觸 一l l t 一- l 一 - 非接觸 l 針尖一樣品間距 圖1 2 針尖一樣品相互作用力隨距離的變化曲線 1 1 3 1 接觸模式 在接觸模式中，針尖始終同樣品接觸。樣品掃描時(shí)，針尖在樣品表面上滑動(dòng)。 接觸模式通常產(chǎn)生穩(wěn)定的高分辨圖像。當(dāng)激光束照射到微懸臂的背面，再反射到 位置靈敏的光電檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)器不同象限會(huì)接收到同懸臂形變量成一定比例關(guān) 系的激光強(qiáng)度差值。反饋回路根據(jù)檢測(cè)器的信號(hào)與預(yù)置值的差值，不斷調(diào)整針尖 一樣品距離，并且保持針尖一樣品作用力不變，就可以得到表面形貌像。這種測(cè) 量模式稱為恒力模式i “。當(dāng)已知樣品表面非常平滑時(shí)，可以讓針尖一樣品距離保 持恒定，這時(shí)針尖一樣品作用力大小直接反映了表面的高低，這種方法稱恒高模 式1 1 1 。但接觸模式下研究低彈性模量的樣品( 例如生物樣品) 時(shí)也存在些缺陷。 這是由于這類分子和基底間的吸附接觸很弱，探針在樣品表面上的移動(dòng)會(huì)產(chǎn)生壓 縮力和剪切力，容易使得樣品發(fā)生變形，并會(huì)損壞探針，從而影響到圖像的質(zhì)量 4 梗旦戈擎 第一章緒論 和真實(shí)性。 1 1 3 2 輕敲模式 在輕敲模式中，微懸臂是振蕩的并具有較大的振幅( 2 0r i m ) ，針尖在振蕩 的底部間斷地同樣品接觸，是介于接觸模式和非接觸模式之間的一種操作模式 研。當(dāng)針尖沒有接觸到表面時(shí)，微懸臂以一定的大振幅振動(dòng)，當(dāng)針尖接近表面直 至輕輕接觸表面時(shí)，其振幅將減??；而當(dāng)針尖反向遠(yuǎn)離表面時(shí)，振幅又恢復(fù)到原 先的大小。反饋系統(tǒng)根據(jù)檢測(cè)該振幅，不斷調(diào)整針尖一樣品之間的距離來控制微 懸臂的振幅，使得作用在樣品上的力保持恒定。由于針尖同樣品接觸，分辨率通 常幾乎同接觸模式一樣好：但因?yàn)榻佑|是非常短暫的，剪切力引起的破壞幾乎完 全消失，所以輕敲模式適合于分析研究柔軟、粘性和脆性的樣品p l 。在輕敲模式 中，針尖在振蕩周期是間斷地與樣品接觸；因?yàn)檫@種接觸是短暫的，就大大降低 了對(duì)樣品的損傷，所以很適合用于生物分子的成像。 1 1 3 3 非接觸模式 在非接觸模式中，針尖在樣品表面的上方幾到幾十納米處振動(dòng)，始終不與樣 品表面接觸。以略大于微懸臂自由共振頻率的頻率驅(qū)動(dòng)微懸臂，當(dāng)針尖接近樣品 表面時(shí)，微懸臂的振幅顯著減小。振幅的變化量對(duì)應(yīng)于作用在微懸臂上的力梯度， 因此對(duì)應(yīng)于針尖一樣品間距。由于針尖探測(cè)器檢測(cè)的是范德華吸引力和靜電力等 對(duì)成像樣品沒有破壞的長(zhǎng)程作用力，一般比接觸式的作用力小幾個(gè)數(shù)量級(jí)，因此 適合研究柔軟的或有彈性的表面。同時(shí)非接觸模式有另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是針尖始終 不與樣品表面接觸，因而針尖不會(huì)對(duì)樣品造成污染。盡管這種模式雖然增加了顯 微鏡的靈敏度，但相對(duì)較長(zhǎng)的針尖一樣品間距使得分辨率要比接觸模式的低。實(shí) 際上，由于針尖很容易被表面的粘附力所捕獲，非接觸模式的操作是很難的。到 目前為止，非接觸模式的應(yīng)用通常不適合在液體中成像，而且在生物中的應(yīng)用也 是很少的1 9 】。 ， 1 1 4 原予力顯微鏡的應(yīng)用 原子力顯微鏡具有很高的空間分辨率，不僅能直接觀察到物質(zhì)表面的原子結(jié) 構(gòu)，而且還能對(duì)原子和分子進(jìn)行操縱。事實(shí)證明a f m 已經(jīng)成功的應(yīng)用于物理、 化學(xué)、金屬、半導(dǎo)體、微電子、納米材料、生物、生命科學(xué)、生物醫(yī)藥等眾多領(lǐng) 域中，特別在推動(dòng)材料科學(xué)和生命科學(xué)的深入發(fā)展上起到了非常重要的作用。 5 復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 4 1 在材料科學(xué)中的應(yīng)用 在材料科學(xué)中，無論無機(jī)材料還是有機(jī)材料，人們對(duì)于材料是晶態(tài)還是非晶 態(tài)、分子或原子的存在狀態(tài)、中間化合物及各種相的變化進(jìn)行探索，以便找出結(jié) 構(gòu)與性能之間的規(guī)律【1 0 u 】。在這些研究中a f m 可以使研究者，從分子或原子水 平直接觀察晶體或非晶體的形貌、缺陷，測(cè)量空位能、聚集能及各種力的相互作 用，從而了解和掌握材料微觀結(jié)構(gòu)與宏觀性能之間的關(guān)系，并將在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā) 揮巨大作用。 當(dāng)今納米材料是材料領(lǐng)域最受關(guān)注的課題，而a f m 在對(duì)納米材料的微觀研 究中也是最重要的分析測(cè)試工具之一。n e f f a t i 等人用高分辨a f m 觀察不同濃度 下的硅氧烷橡膠黑煙末( c b ) 納米復(fù)合材料樣品的表面形貌和性質(zhì)，證實(shí)樣品 的粗糙度和表面c b 的晶粒數(shù)目有關(guān)，并得出結(jié)論：c b 的主體濃度和表面的實(shí) 際濃度均受到硅氧烷橡膠基體制備速率的影響，并決定其材料的傳導(dǎo)率。由此可 見，在納米級(jí)的復(fù)合材料研究中，a f m 是一種強(qiáng)有力的工具1 1 2 】。 工業(yè)上可以利用原子力顯微鏡對(duì)鋼材成分進(jìn)行有效分析，相對(duì)于光學(xué)顯微鏡 和掃描電子顯微鏡，a f m 不僅可以在一次掃描下，根據(jù)不同物理參數(shù)同時(shí)得到 氧化鐵皮圖片，更可以根據(jù)磁力圖判斷氧化鐵皮的成分。用原子力顯微鏡的磁力 針尖以敲擊模式作精細(xì)掃描，可同時(shí)得到低碳鋼熱軋板樣品的形貌圖、相圖和磁 力圖。證實(shí)低碳鋼熱軋板表面氧化鐵皮結(jié)構(gòu)主要是四氧化三鐵和游離鐵的混合物 1 3 l 。 1 1 4 2 在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 在生命科學(xué)中，因a f m 有著很高的三維圖形分辯能力，因此用a f m 對(duì)生 物大分子成像的意義，不僅是在分子水平上認(rèn)識(shí)大分子的形態(tài)，而且可以通過對(duì) 生物分子結(jié)構(gòu)的研究及生物分子在相互作用前后構(gòu)型的變化，對(duì)揭示生命過程起 到至關(guān)重要的作用。例如，在生命科學(xué)中，a f m 對(duì)染色體、蛋白質(zhì)、多糖、微 生物、細(xì)胞等的研究都發(fā)揮了非常重要的作用。 在對(duì)鳥嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 分帶中期染色體的三維結(jié)構(gòu)的觀察i l ”、染色 單體型畸變識(shí)別【l5 】以及核型分析等方面研究的應(yīng)用證實(shí)，與光學(xué)顯微鏡、掃描及 透射電鏡等成像工具相比，a f m 具備獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它不僅能夠識(shí)別染色體畸變， 同時(shí)可以對(duì)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行細(xì)微的觀察。除正常染色體的結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)的研究， 利用a f m 還可對(duì)g 分帶染色體形態(tài)發(fā)生的一系列變化進(jìn)行觀察。研究發(fā)現(xiàn)，隨 著胰蛋白酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，染色體除周邊之外的其余結(jié)構(gòu)將逐漸發(fā)生崩解i ”j 。 中期染色體經(jīng)g 、c 分帶會(huì)出現(xiàn)縱向高度的差異l l ”，各條帶中染色質(zhì)纖維排列的 6 覆旦，t 擎 第一章緒論 松緊度也有所不剛1 8 】。這些都有助于染色體分帶機(jī)制的闡明。對(duì)重離子射線誘發(fā) 染色體畸變的分析發(fā)現(xiàn)，通過a f m 不但能識(shí)別出染色單體裂隙和單體斷裂，還 清楚地觀察到單體型畸變斷裂點(diǎn)的纖維狀結(jié)構(gòu)【l9 1 。這證實(shí)了a f m 是輻射誘發(fā)染 色體畸變的結(jié)構(gòu)研究中十分有用的工具。 利用a f m 觀察，生物膜可以在其固有的狀態(tài)下獲得水平方向分辨率達(dá)o 5 1 l i r a 、垂直方向分辨率達(dá)0 1 - - 0 2a m 的高分辨圖像，甚至可以觀察到分子內(nèi)的結(jié) 構(gòu)細(xì)節(jié)1 2 0 i 。d n a 的復(fù)制、蛋白質(zhì)的合成、遺傳信息的傳遞等都是由分子間力控 制的，而a f m 對(duì)微小相互作用力的靈敏度使其成為測(cè)量這些相互作用的有效工 具。單分子力譜和高分辨成像的結(jié)合使得分析生物分子內(nèi)和分子間的相互作用力 成為可能。譬如，p a n g 在a f m 下直接觀察抗腫瘤藥順鉑及其異構(gòu)體反鉑與d n a 的相互作用，發(fā)現(xiàn)順鉑抑制d n a 復(fù)制的作用較反鉑強(qiáng)，順鉑的抗腫瘤活性與 d n a 分子中鳥嘌呤( g ) 和胞嘧啶( c ) 含量有關(guān)j 隨著儀器和生物樣品制備方法的改進(jìn)以及成像條件的優(yōu)化使得a f m 不僅可 以對(duì)生物分子進(jìn)行高分辨成像，而且可以對(duì)生物分子進(jìn)行操縱對(duì)被觀察標(biāo)本 直接進(jìn)行切割、鉆孔、打磨等操作。因此可利用舡m 進(jìn)行生物制藥和基因治療。 同時(shí)，a f m 操作簡(jiǎn)便，樣品處理要求不高，可檢測(cè)的樣品范圍很廣，配套設(shè)備 很少，安裝條件也比較簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)足以證明a f m 將成為現(xiàn)代、未來生物醫(yī)學(xué)研 究的主要手段。 1 1 4 3 在聚合物研究中的應(yīng)用 a f m 在聚合物研究中的應(yīng)用非常廣泛，除對(duì)聚合物表面幾何形貌進(jìn)行觀測(cè) 外，目前更常用于對(duì)聚合物納米級(jí)結(jié)構(gòu)和表面性能的研究。例如a f m 對(duì)嵌段共 聚物膜表面形貌與相分離進(jìn)行觀察，有研究小組 2 2 1 就報(bào)道了聚苯乙烯一聚乙烯， 聚丁烯一聚苯乙烯三嵌段共聚物( s e b s ) 在相同澆鑄條件下不同溶劑澆鑄成膜 的微相分離形態(tài)。 而通過對(duì)聚合物在原子級(jí)別上的觀察、分析、歸納、總結(jié)，可以獲得更深層 次的信息。例如觀察聚氧化乙烯( p e o ) 的晶體結(jié)構(gòu)田l 。由a f m 圖像可確定p e o 片晶表面幾何形狀接近正方形，厚度約為1 2 5n m ，在空氣中隨時(shí)間的延長(zhǎng)晶片 逐漸形成不規(guī)則的樹枝狀結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)問的縫隙深度較p e o 晶體厚度大，說 明在這個(gè)過程中高分子鏈進(jìn)行重新折疊。 運(yùn)用a f m 技術(shù)可以順利解析聚合物的各種性質(zhì)，例如導(dǎo)電性能、單鏈聚合 物的力學(xué)性能1 2 4 j 等。研究聚合物結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系，操縱和修飾聚合物鏈， 設(shè)計(jì)和創(chuàng)造新的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)，從根本上評(píng)價(jià)和控制聚合物可能的性能和過程，將 成為a f m 的發(fā)展趨勢(shì)以及聚合物科學(xué)的重要研究領(lǐng)域。 7 復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 4 4 在信息技術(shù)中的應(yīng)用 半導(dǎo)體芯片技術(shù)是當(dāng)今高科技的核心。盡管元件尺寸越來越小，但是芯片的 功能卻越來越強(qiáng)。當(dāng)尺寸縮小到納米級(jí)，傳統(tǒng)的觀測(cè)手段( 如電子顯微鏡) 已不 能滿足需要，必須采用掃描探針顯微鏡。光盤具有存儲(chǔ)量大、成本低、精度高和 信息保存壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為主要的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)之一。它的信息是以凹坑 的形式存儲(chǔ)于盤基上，凹坑的深度和長(zhǎng)度是信息位的關(guān)鍵參數(shù)，它們直接影響光 盤讀出信號(hào)的質(zhì)量。a f m 可直接對(duì)物體表面進(jìn)行三維檢測(cè)，能夠在納米尺度上 對(duì)光盤上的信息位凹坑結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維檢測(cè)。同時(shí)由于a f m 具有高分辨率、形象 直觀的觀測(cè)、提供量化的三維信息以及對(duì)樣品無特殊要求的特點(diǎn)，使其成為分析 信息存儲(chǔ)介質(zhì)的重要工具，因而也將在未來的數(shù)據(jù)分析和處理中發(fā)揮重要作用。 另外，a f m 還集納米加工與測(cè)量于一體，具有較好的實(shí)時(shí)監(jiān)控和微加工能力， 這對(duì)于未來開發(fā)和研制更快的存儲(chǔ)介質(zhì)及海量存儲(chǔ)系統(tǒng)等也有重要的意義i 弭j 。 1 1 5 原子力顯微鏡的展望 原子力顯微鏡以其獨(dú)特的成像方式、高分辨率、制樣簡(jiǎn)單、操作易行等特點(diǎn) 而備受關(guān)注，并且突出地顯現(xiàn)了顯微觀測(cè)技術(shù)作為人類視覺感官功能的延伸與增 強(qiáng)的重要性。a f m 已在生命科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮了重大作用，極大地推 動(dòng)了納米科技的發(fā)展，促進(jìn)人類加速進(jìn)入了納米時(shí)代；同時(shí)，a f m 將帶領(lǐng)人類 進(jìn)入后基因組，即蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新天地。 2 0 年來，材料科學(xué)、電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)的進(jìn)步極大地促進(jìn)了a f m 技術(shù) 的進(jìn)步。目前a f m 在以下方向有待發(fā)展：( 1 ) 探針針尖的工藝研究。探針針尖 的工藝對(duì)a f m 分辨率至關(guān)重要，如何提高針尖尖度、延長(zhǎng)探針使用壽命將成為 a f m 長(zhǎng)期研究的問題。目前科學(xué)家們正致力于研究碳納米管針尖的制造和應(yīng)用 2 5 , 2 6 。( 2 ) 接觸面處的接觸距離，是a f m 中最關(guān)鍵的因素。合理的接觸距離， 既有利于延長(zhǎng)針尖的使用壽命，又有利于提高a f m 的分辨率。在原子操縱中， 接觸距離將起著決定性作用。電場(chǎng)的強(qiáng)弱和原子間力的大小接觸同距離有密切的 關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接觸距離達(dá)到某個(gè)值時(shí)，接觸面處的原子會(huì)發(fā)生“突跳”， “突跳”對(duì)原子操縱影響很大。( 3 ) 計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步和數(shù)據(jù)處理軟件的開發(fā)也 是不可忽視的關(guān)鍵因素。 8 摸曼太擎 第一章緒論 1 2 生物體系間作用力的a f m 研究 1 2 1 研究生物體系之間的相互作用力的意義 生物大分子問存在高特異性相互作用力，例如抗體一抗原、配體一受體、互 補(bǔ)d n a d n a 間相互作用力，它們?cè)谡{(diào)控分子識(shí)別過程中起到了相當(dāng)重要的作 用。例如基因的表達(dá)、酶的功能性催化、細(xì)胞的保護(hù)這些過程都依賴于生物分子 問的相互作用力。又如，在免疫系統(tǒng)中，抗體能夠高效快速的識(shí)別于它們相應(yīng)的 抗原，并與它們結(jié)合，這在生物工藝學(xué)、藥理掣”】和催化學(xué) 2 s l 中都起到了重要 作用。所以，了解、檢測(cè)和分類生物體系間的相互作用力已經(jīng)成為現(xiàn)階段生物學(xué) 以及相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，不僅對(duì)細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)等基礎(chǔ)研究提 供了廣泛的研究素材，也對(duì)于生物傳感器的發(fā)展有不可低估的影響。 隨著儀器技術(shù)的發(fā)展，對(duì)生物分子間的相互作用力的直接檢測(cè)( 定性和定量) 已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)。目前生物膜力探針( b i o m e m b r a n ef o r c ep r o b e ) 例、表面力測(cè)量 儀( s u r f a c ef o r c e sa p p a r a t u s ) p o 、光鑷子( o p t i c a lt w e c z e t s ) 郾j 是應(yīng)用比較普遍 的敏感力轉(zhuǎn)換裝置。盡管這些技術(shù)對(duì)于生物分子間的作用力較為敏感，但是它們 缺乏測(cè)量離散的分子間相互作用力的空間或者力分辨率。而原子力顯微鏡使用微 小的針尖作為力探針，柔軟的懸臂作為力轉(zhuǎn)換裝置，能夠獲得良好的空間和力分 辨率。同時(shí)，能夠在等同于生理學(xué)的條件下進(jìn)行儀器操作，這些優(yōu)勢(shì)使得原子力 顯微鏡在生物分子間相互作用的研究中獨(dú)樹一幟。 1 2 2 生物分子問相互作用的a f m 研究簡(jiǎn)介 1 9 9 4 年，l e e 小組田】首次報(bào)道了利用a f m 測(cè)定離散的生物分子復(fù)合物的斷 裂力。他們選用生物素一鏈霉親和素體系，這是因?yàn)樵搹?fù)合物具有很強(qiáng)的非共價(jià) 鍵作用力。牛血清白蛋白作為介質(zhì)，可以將生物素修飾于a f m 針尖表面，同時(shí) 將鏈霉親和素修飾于玻璃基板表面。鏈霉親和素分子有四個(gè)活性位點(diǎn)，盡管某些 位點(diǎn)在基板修飾中被占據(jù)，但仍然能夠保證與生物素的作用。在a f m 針尖和基 板分離的過程中，存在多種斷裂力，但是通過力曲線圖可以獲得最終斷裂力的信 息。經(jīng)過分析歸納，統(tǒng)計(jì)顯示了這些最終斷裂力的分布，其中峰值代表了一個(gè)或 多個(gè)生物素一鏈霉親和素復(fù)合物的斷裂力大小，并得出單個(gè)生物素一鏈霉親和素 特異性作用力大小為1 6 0p n 。 除了對(duì)于生物素一鏈霉親和索的研究，對(duì)于抗體一抗原的作用力研究也有報(bào) 道。s t u a r t 和h l a d y l 3 3 j 的研究中發(fā)現(xiàn)抗體一抗原非特異性斷裂力也能被檢測(cè)到， 這可能是因?yàn)榉肿舆\(yùn)動(dòng)性不足。d a m m c r 小組1 3 4 j 利用自組裝單層膜修飾針尖和基 底并獲得定量斷裂力。而h i n t c r d o r f c r 小組1 3 5 ，3 6 l 是第一個(gè)確定單個(gè)抗體一抗原之 9 復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文 間的相互作用力的。后兩個(gè)研究小組在修飾的過程中使用具有移動(dòng)性的交聯(lián)劑分 別在針尖和基板上連接抗體和抗原，這樣可以克服一系列問題，例如定位失誤、 位阻效應(yīng)和構(gòu)型轉(zhuǎn)化，同時(shí)可以降低針尖上抗體密度，保證是單分子作用。 在蛋白質(zhì)一d n a 作用力的測(cè)定中，目前主要還是通過a f m 圖像功能定性化 的觀測(cè)它們之間相互作用的動(dòng)力學(xué)過程和機(jī)理。例如蛋白質(zhì)分子是怎樣和活細(xì)胞 中d n a 上特定位點(diǎn)相作用的，通常這些特定位點(diǎn)僅僅是幾個(gè)特定堿基對(duì)，所以 相對(duì)于周圍環(huán)境中的大量非特異性d n a ，它們之間的結(jié)合顯得很神奇。利用動(dòng) 態(tài)a f m 成像便可以清晰的觀測(cè)到甚至單個(gè)d n a 分子的長(zhǎng)度，蛋白質(zhì)分子最優(yōu) 結(jié)合位點(diǎn)等細(xì)節(jié)問題p 7 - 3 9 。另外，基于d n a 本身的特性，也可以通過力曲線獲 得定量數(shù)據(jù)。多個(gè)小組【柏，4 l 】都對(duì)互補(bǔ)d n a 雙鏈中單個(gè)堿基對(duì)的相互作用力進(jìn)行 了定量測(cè)定，之間存在一些數(shù)值差異可能源于特異性和非特異性的作用力，以及 不同的力加載速率 4 2 j 。也有研究d n a 分子經(jīng)過a f m 拉伸過程導(dǎo)致堿基堆積作 用消失，d n a 分子失去彈性，導(dǎo)致的b s 轉(zhuǎn)變過程1 4 3 - 4 5 。 1 3 本課題選題背景和意義 生物分子間相互作用力的研究是現(xiàn)在生物學(xué)以及相關(guān)專業(yè)中值得投入精力 進(jìn)行分析研究的一個(gè)方向。這是因?yàn)樗鼈冊(cè)谏矬w和真實(shí)環(huán)境中對(duì)識(shí)別調(diào)控起到 了不可估量的作用。鋅指是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠和特異性的d n a 結(jié)合起到 基因轉(zhuǎn)錄的作用。所以，對(duì)于它們之間的相互作用的研究，一直以來是科學(xué)家們 關(guān)注的重點(diǎn)。十多年來，人們通過各種表征手段了解研究鋅指一d n a 復(fù)合物， 從一開始利用x 射線單晶衍射方法直接觀測(cè)它們之間的復(fù)雜多樣的作用方式， 到計(jì)算機(jī)模擬鋅指一d n a 復(fù)合物之間相互作用力，特定堿基對(duì)和鋅指分子的作 用力大小等，已經(jīng)走過了很長(zhǎng)的研究之路。隨著原子力顯微鏡在單分子操縱技術(shù) 上的應(yīng)用，使用a f m 獲得的鋅指一d n a 力曲線圖可以定量分析這種特異性作用 力的大小，深刻了解鋅指一d n a 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特性，使得科學(xué)家們能夠進(jìn)一步 理解鋅指的基因轉(zhuǎn)錄作用。 原子力顯微鏡作為表征形貌和測(cè)量分子間作用力的手段，能有效地和定量化 地計(jì)算生物體系中兩類分子( 例如d n a 和蛋白質(zhì)) 之間的特異性作用力。鋅指 z i 億6 8 和富含g 、c 堿基對(duì)的d n a 可以特異性結(jié)合從而起到轉(zhuǎn)錄基因的作用。 我們將z i f 2 6 8 和目標(biāo)d n a 分別化學(xué)修飾在a f m 針尖和玻璃基板上，利用a f m 測(cè)定一系列z i f 2 6 8 一d n a 體系的力曲線，并計(jì)算歸納獲得z i f 2 6 8 - - d n a 復(fù)合物 的解離力大小。 同時(shí)由于z i f 2 6 8 和非特異性作用的d n a 之間存在一定的作用力，稱為非特 異性作用力，所以課題需要設(shè)計(jì)有效的對(duì)比試驗(yàn)用以證實(shí)z i f 2 6 8 和目標(biāo)d n a 分 i o 援算大擎 第一章緒論 子之間的特異性作用力，并且區(qū)分其和非特異性作用力的大小，同時(shí)討論非特異 性作用力的成因。另外，課題設(shè)計(jì)不同的試驗(yàn)條件以最大程度減小非特異性作用 力對(duì)z i f 2 6 8 - - d n a 分子間特異性作用力的影響，從而獲得更為精確的z i f 2 6 9 - - d n a 復(fù)合物的解離力大小。 本課題為作者作為交流學(xué)生在東京農(nóng)工大學(xué)生物技術(shù)與生命科學(xué)系三宅一 中村聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室完成。 復(fù)旦大學(xué)硬士學(xué)位論文 參考文獻(xiàn) 【1 1b i n n i n ggq u a t ec f , g e r b e rc a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e 明p l a y s r e v l e t t ， 1 9 8 6 ，5 6 ( 9 ) ：9 3 0 - 9 3 3 【2 】劉萬里，孫大許，馬強(qiáng)，閆勇剛原子力顯微鏡在信息存儲(chǔ)介質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng) 用叨現(xiàn)代科學(xué)儀器，2 0 0 5 ，5 ，5 1 5 3 【3 】b i n n i n gg r o h r e rh ，g e r b e rc ，w e i b e le ，s u r f a c es t u d i e sb ys c a n n i n gt u n n e l i n g m i c r o s c o p y 叨p h y s r e v l e t t ，1 9 8 2 ，4 9 ( 1 ) ：5 7 6 1 【4 】a m a t oi a t o m i ci m a g i n g ：c 鋤d i dc a m e r a sf o r t h en a n o w o r l d 川s c i e n c e ，1 9 9 7 ， 2 7 6 ( 5 3 2 1 ) ：1 9 8 2 - 1 9 8 5 【5 】b u s t