魚腥藻PCC7120基因asr0757alr0758的初步研究.doc

魚腥藻PCC7120基因asr0757alr0758的初步研究 李麗君，陳思禮，馬凱，蔣澤鳳，周江旭 （中南民族大學生命科學學院，武漢） 摘要：為研究魚腥藻PCC7120（nabaenasp.）基因在毒素抗毒素系統(tǒng)中的相關生物學功能，設計了特異性引物，擴增目的片段和，將目的基因與載體連接構建克隆載體，并對其進行和雙酶切，再與表達載體連接構建表達重組菌，重組菌的體外表達在的誘導下進行。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，結果擴增出了大小為的和的目的基因。經(jīng)電泳檢測，表達出相對分子質量分別為和的蛋白質。根據(jù)結果可初步認定為毒素基因，為抗毒素基因，共同構成魚腥藻PCC7120毒素抗毒素系統(tǒng)。 關鍵詞：魚腥藻（nabaenasp.）；毒素抗毒素系統(tǒng)；/alr ：（） 魚腥藻的毒素抗毒素（，）系統(tǒng)是由編碼毒素蛋白和抗毒素蛋白的個基因對共同組成的，毒素蛋白可通過影響細胞的相關生物學功能使其死亡，同時毒素也可能對人類及其他生物體造成威脅。研究表明，根據(jù)系統(tǒng)編碼產(chǎn)物的序列相似性可將其分為、等個系統(tǒng)家族，且大腸桿菌染色體上的家族是目前研究最廣、遺傳背景相對清楚的系統(tǒng)之一，。本試驗通過分子生物學分析，對魚腥藻基因進行了相關研究，旨在為該基因在毒素抗毒素系統(tǒng)中的相關生物學功能的研究提供基礎，為治理水華污染和開發(fā)高效的蛋白表達系統(tǒng)提供新思路。 材料與方法 試驗材料 藻種藻種為魚腥藻（），由中南民族大學生命科學學院病原分子生物學研究室保存（購于中國科學院水生生物研究所）。 主要試劑及儀器克隆載體、限制性內切酶、連接酶（公司），聚合酶（Fermentas公司），瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒（公司），、表達載體為本實驗室保存，引物合成、克隆載體及表達載體的測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。 型空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）、型高速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）、型臺式高速離心機（湖南星科科學儀器有限公司）、型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、型三恒電泳儀（上海金鵬分析儀器有限公司）。 試驗方法 程序：，個循環(huán)；，（）（），個循環(huán)；，個循環(huán)；，個循環(huán)。 重組克隆載體的構建擴增目的片段通過V轉化到法制備的感受態(tài)細胞中，并通過藍白斑篩選在氨芐青霉素抗性固體培養(yǎng)基上進行雙重陽性篩選，最終挑取白色菌斑進行菌落，通過測序比對，從而確定克隆載體構建成功與否?？寺◇w系為載體、純化產(chǎn)物、溶液。 重組表達載體的構建用和對重組質粒進行雙酶切獲取目的基因片段，雙酶切體系見表。通過DNA連接酶將目的片段與表達載體相連，連接體系見表。將連接產(chǎn)物轉化入中，使其在含卡那霉素抗性的固體培養(yǎng)上培養(yǎng)，進行陽性篩選。有菌落白斑長出后，挑菌搖床過夜并取適量菌液測序以確定表達載體是否構建成功。 毒素抗毒素蛋白質的誘導表達將含有重組質粒的菌液接種于新鮮的含抗生素（卡那霉素）的抗性液體培養(yǎng)基中，搖床過夜，再取菌液活化，而后加入搖床誘導蛋白質表達。對樣品進行處理后，用分離膠和的濃縮膠進行電泳檢測蛋白質表達的相對分子質量。 結果與分析 基因的擴增 應用擴增技術擴增0基因，并對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，基因片段的實際大小與預期大?。ê停┫喾▓D、圖）。 克隆載體的構建 擴增后的目的片段通過與載體在條件下連接過夜，將連接產(chǎn)物轉化到用法制備的感受態(tài)細胞中，進行藍白斑篩選，挑取陽性單菌落進行菌落檢測，將菌液進行測序，結果表明個目的基因、均成功轉入（圖）。 表達載體的構建 選取上的酶切位點和，對克隆重組質粒進行雙酶切，并將回收后的目的基因片段連接到表達載體上，再轉化到大腸桿菌細胞中，挑取陽性單菌落，進行質粒提取及雙酶切檢測，通過初步鑒定后進行測序。結果表明，表達載體成功構建（圖、圖）。 由圖可知，在基因表達菌序列比對結果中，配對率為，基因覆蓋率為。圖為基因表達菌序列比對結果，結果表明其配對率為，基因覆蓋率為。個基因引物設計時，均敲除了終止密碼子。 毒素抗毒素蛋白質的誘導表達 經(jīng)測序成功的表達載體重組質粒，在的誘導下進行體外表達（圖）。結果表明，毒素抗毒素蛋白質在、的條件下經(jīng)誘導時有蛋白質表達，但基因表達量較少，且誘導劑本身對細胞生長有一定的毒性作用，所以初步認為其為毒素基因。目的毒素蛋白質、抗毒素蛋白質相對分子質量分別為和，再加上其組氨酸標記及相應的酶切位點，分子量增加約為，故實際檢測到的蛋白質相對分子質量約和。經(jīng)電泳檢測，在k之間及之間分別有一較為明顯的條帶，與理論值基本相符。 討論 本試驗設計了和基因的特異性引物，采用降落擴增目的基因構建相應的克隆載體，再利用經(jīng)測序檢測正確的克隆重組質粒來構建表達載體，測序并進行序列比對后表明，目的基因均正確插入到表達載體中，且沒有任何堿基突變出現(xiàn)，故個目的基因表達載體均成功構建。在表達載體的構建過程中，載體與目的片段的最佳濃度比例為，此比例下菌落生長狀況較好。大于的比例時，菌落幾乎不生長，故載體與目的片段比例的選取是該步驟中的一個重要因素。此外，正常生長的單菌落中，由于載體未完全切開或載體自連等原因產(chǎn)生假陽性，因此必須對重組質粒進行測序以驗證試驗結果。 含目的基因的和含目的基因的經(jīng)誘導表達，經(jīng)軟件分析可知，蛋白質表達的大小分別為和，再加上k左右的組氨酸標記及相應酶切位點，理論大小為和。檢測結果表明，目的蛋白質的分子實際大小與理論值基本相符。目的蛋白質在、條件下培養(yǎng)表達，但其最佳表達條件有待進一步研究。毒素基因可能具有核酸酶活性，而已有的研究表明，具有核酸酶活性的毒素蛋白質可通過降解抑制細胞生長，故其表達量較少。 目前，淡水湖泊的污染形勢日趨嚴峻，而藻類是水體富營養(yǎng)化的主要媒介，且大腸桿菌細胞染色體上系統(tǒng)基因參與了一種特殊的環(huán)境脅迫應答并介導細菌的程序性死亡，使得對系統(tǒng)的研究具有十分重要的指導意義。本試驗成功克隆和表達了魚腥藻染色體基因和，并對其相關性質進行了初步研究，為后續(xù)的相關試驗奠定基礎。 參考文獻： ，： 陳思禮，梅菊魚腥藻染色體上同源基因的克隆及表達中南民族大學學報（自然科學版），（1）： ，： ，（）： 楊自言，馮婷婷，寧德剛