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硫醇光學(xué)探針摘要：細(xì)胞內(nèi)的生物硫醇，通過自由硫醇(RSH)和氧化二硫化物(RSSR)的平衡在維持生物氧化還原動態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用，定量檢測生物體系中硫醇的濃度在生物化學(xué)和臨床化學(xué)中具有重要意義。通過改變顏色或熒光強(qiáng)度（或發(fā)射波長）檢測的硫醇光學(xué)傳感器在過去的十年吸引了相當(dāng)多的關(guān)注，一些優(yōu)秀的熒光和比色傳感器被設(shè)計(jì)，并且成功應(yīng)用于生物樣品檢測和細(xì)胞成像。本文對過去十年內(nèi)的硫醇光學(xué)傳感器進(jìn)行了綜述，并展望了此類探針的發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景。1 引言細(xì)胞內(nèi)的生物硫醇，例如谷胱甘肽（GSH）,同型半胱氨酸（Hcy），和半胱氨酸（Cys），通過自由硫醇(RSH)和氧化二硫化物(RSSR)的平衡在維持生物氧化還原動態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用1。然而異常的半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽水平，與一些疾病密切相關(guān)，如肝臟損傷、皮膚損傷、生長緩慢、水腫，癡呆、老年癡呆癥、冠心病、頸動脈粥樣硬化、肌張力障礙、牛皮癬、臨床打擊，肺損傷、帕金森癥、和哮喘，白血球降低、癌癥、艾滋病。硫醇也活躍在酶的催化位點(diǎn)，在代謝途徑扮演重要角色。因此，定量檢測生物體系中硫醇的濃度在生物化學(xué)和臨床化學(xué)中具有重要意義。2-3目前已報道的檢測方法有：高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜法等。然而這些方法需要復(fù)雜、耗時的步驟、使用高級昂貴的儀器和高的檢測限。通過改變顏色或熒光強(qiáng)度（或發(fā)射波長）檢測的硫醇光學(xué)傳感器由于它們簡單、便宜和檢測迅速，在過去的十年被廣泛研究。近期，Yin等對硫醇熒光探針進(jìn)行了綜述2。雖然近幾年，一些硫醇比色傳感器被報道，但硫醇比色傳感器還沒有被評論。本文按光學(xué)傳感器與巰基作用機(jī)理的不同進(jìn)行分類，對近十年該領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行評述。硫醇巰基強(qiáng)的親核性，與軟酸強(qiáng)的配位能力，利用巰基斷裂硒氮鍵、斷裂磺酸脂鍵、斷裂磺酰胺鍵，含氮末端硫醇與醛基反應(yīng)，對缺電子雙鍵的親核加成，與方酸衍生物缺電子四元環(huán)加成等作用機(jī)理被應(yīng)用于硫醇光學(xué)傳感器設(shè)計(jì)。本文按照上述硫醇與傳感器作用機(jī)理進(jìn)行分類，對對近十年該領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了評述。一些機(jī)理如光致誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（RET）、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）等也被應(yīng)用與硫醇光學(xué)傳感器設(shè)計(jì)研究，本文也對其進(jìn)行了簡要概述。2 利用巰基與二硫鍵的氧化還原平衡反應(yīng)檢測硫醇的光學(xué)探針生物體內(nèi)存在巰基與二硫鍵的氧化還原平衡，因此巰基與二硫鍵作用被用于設(shè)計(jì)硫醇光學(xué)探針。此類探針不改變細(xì)胞內(nèi)的總硫醇含量，有較低的氧化還原電勢等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于熒光顯微成像。（1）斷裂二硫鍵檢測硫醇含量應(yīng)用最廣泛的試劑是Ellmans試劑（1）。由于跨膜電荷排斥和基于吸光率的檢測方法不能應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)的檢測，因此這種試劑只能應(yīng)用于體外。Zhu等在2004年報道了5-（2-氨乙基）二硫-2硝基苯甲酸鹽（2）作為Ellmans試劑的替代物4。2與自由硫醇的反應(yīng)在動力學(xué)上與Ellmans試劑相似，但在堿性條件下更穩(wěn)定，能應(yīng)用于堿性條件下硫醇含量和酶活性的檢測。 Pires等報道了一種含有兩個雙硫鍵的羅丹明110衍生物作為硫醇的熒光探針（3）5.探針本身無熒光，當(dāng)3的雙硫鍵被溶液中的硫醇或細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽還原時暴露出親核的巰基，暴露的巰基導(dǎo)致鄰近的氨基甲酸鍵斷裂，因此釋放出具有強(qiáng)烈熒光的羅丹明110。探針被應(yīng)用于HeLa細(xì)胞激光共振聚焦成像。 Lee等近期發(fā)表了利用雙光子熒光探針46。該探針有二硫鍵作為硫醇的反應(yīng)位點(diǎn)，以2-氨甲基-6-乙酰基萘作為顯色團(tuán)，用雙光子顯微鏡法能夠在組織90180m深度活體細(xì)胞核和活體組織檢測硫醇。該探針被應(yīng)用于HeLa細(xì)胞成像和老鼠海馬趾的薄片成像。可對細(xì)胞內(nèi)硫醇濃度的變化產(chǎn)生響應(yīng)。（2）基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的二硫鍵硫醇熒光探針（DSSA）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種從供體熒光團(tuán)的激發(fā)態(tài)到供體100 內(nèi)適當(dāng)?shù)氖荏w熒光團(tuán)的能量非輻射量子機(jī)械轉(zhuǎn)移。基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的二硫鍵硫醇熒光探針（DSSA）由含二硫鍵（SS）的鏈聯(lián)接供體(D)和受體(A)組成。由于受體和供體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使此類探針顯示較弱的熒光。當(dāng)體系中存在硫醇時，硫醇通過反應(yīng)斷裂二硫鍵，從而使供體和受體分離，導(dǎo)致熒光共振能量轉(zhuǎn)移減小，供體產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。通過檢測供體的熒光，可實(shí)現(xiàn)對硫醇的檢測和谷胱甘肽還原酶活性的檢測。此類檢測相對于普通的熒光檢測有更高的靈敏度和更小的背景干擾。但反應(yīng)時間較長，不利于硫醇的即時檢測。Piggott和Karuso通過一個短的含二硫鍵的鏈連接兩分子熒光素組成了一個新的熒光探針57。5的能量最小模型顯示：當(dāng)含二硫鍵的鏈完全伸展時兩個熒光團(tuán)的距離低于30 ，小于熒光素44的Forster 半徑，因此分子顯示出強(qiáng)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）間接猝滅。硫醇斷裂二硫鍵使兩個熒光素分子分離，導(dǎo)致熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）間接猝滅減小和相應(yīng)的520nm熒光強(qiáng)度增大。探針被應(yīng)用于檢測GSH和谷胱甘肽還原酶的活性。 Pullela等報道了另兩種DSSA探針（6和7）8，6和7由熒光素（D）通過二硫鍵聯(lián)接羅丹明（R）組成。由于熒光素的發(fā)射光譜和羅丹明的激發(fā)光譜有效重疊，熒光素的熒光被猝滅。與硫醇反應(yīng)后二硫鍵斷裂，供體和受體熒光團(tuán)分離，熒光素的熒光恢復(fù)，通過檢測熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度的變化來檢測硫醇弄濃度的變化。羅丹明在pH6.0時有熒光,因此探針5能在很寬的pH范圍內(nèi)有熒光。并且熒光素在pH 6.0自環(huán)化成中性的螺內(nèi)酰胺，從而保證了5在不同pH值的細(xì)胞膜滲透性。因此5能夠在很寬的pH范圍內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的硫醇。 Wang等報道了基于熒光素-胱胺-甲基紅的熒光探針89.該探針能在1M濃度范圍內(nèi)檢測同型半胱氨酸。Lee等報道了一個氧化還原電勢探針910， 9由縮氨酸連接carbostyril和鋱螯合物DTPA(Tb)組成。如圖8所示，9有兩種存在形態(tài)：氧化態(tài)和還原態(tài)。9的氧化態(tài)共軛發(fā)光，發(fā)光由激活發(fā)射產(chǎn)生（sensitized emission）。當(dāng)carbostyril被激發(fā)，carbostyril的激發(fā)態(tài)能量隨后轉(zhuǎn)移至Tb，然后激發(fā)態(tài)的Tb通過光散發(fā)回至基態(tài)。這種從顯色團(tuán)到金屬離子有效的能量轉(zhuǎn)移由距離決定。在氧化態(tài)中縮氨酸中的兩個巰基以二硫鍵形式存在，carbostyril在封閉的空間接近鋱螯合物，允許產(chǎn)生激活發(fā)射（sensitized emission）。當(dāng)探針處于還原態(tài)，探針采取隨意的卷式構(gòu)象，在空間上分離發(fā)色團(tuán)和鋱螯合物，限制了激活發(fā)射過程。探針的氧化態(tài)（強(qiáng)熒光）和還原態(tài)（弱熒光）之間的不同的熒光能被用來測量環(huán)境的氧化還原電勢。3 利用巰基對缺電子芳環(huán)的親核取代反應(yīng)（ArSN）Jiang等利用熒光團(tuán)NBD-Cl設(shè)計(jì)合成了一個利用磺酰胺檢測硫醇的熒光探針1011,由于烷基硫醇與苯基硫酚pKa的不同(分別為8. 5和6. 5) ,在中性條件下烷基硫醇幾乎不能電離而苯基硫酚能夠大部分電離,電離出的巰基負(fù)離子的親核性遠(yuǎn)大于巰基。因此,該探針在中性條件下可以選擇性的檢測苯基硫酚,烷基硫醇不干擾。探針10由于分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移( ICT)使母體熒光團(tuán)的熒光被猝滅。由于苯基硫酚中性條件下電離出的巰基負(fù)離子具有強(qiáng)親核性,與2, 4-二硝基苯發(fā)生ArS+反應(yīng)使磺酰胺鍵斷裂,ICT受阻熒光恢復(fù)。該探針靈敏度高(與苯基硫酚反應(yīng)可產(chǎn)生50倍的熒光增強(qiáng)) ,選擇性好(半胱氨酸、谷胱甘肽、烷基硫醇以及其它具有親核性的胺、氰根等不干擾測定) ,條件溫和(室溫下pH 7. 3 磷酸鹽緩沖溶液中10 min反應(yīng)基本完成) ,是第一個可以選擇性的檢測苯基硫酚而烷基硫醇不干擾的熒光探針。由于苯基硫酚是一類高毒性的環(huán)境污染物,在石油和煤的精煉廠、橡膠和塑料工業(yè)中都會產(chǎn)生大量的苯硫酚污染物,因此能夠選擇性的檢測高毒性的苯基硫酚在環(huán)境科學(xué)中具有重要意義。Bouffard等開發(fā)了一個紅色的熒光增強(qiáng)型的磺酰胺熒光探針1112,由于ICT過程探針分子本身的熒光很弱,與硫醇反應(yīng)后磺酰胺鍵斷裂,吸收光譜紅移158 nm,熒光增強(qiáng)120倍。探針成功用于小鼠胚胎纖維原細(xì)胞成像,由于探針的發(fā)射波長位于近紅外區(qū)(623 nm) ,該探針具有在小動物的活體內(nèi)成像的潛能。探針缺點(diǎn)在于本體熒光團(tuán)在水溶液中的熒光量子產(chǎn)率非常低,僅為0. 01。該方法通過加入1%人血清蛋白將其熒光量子產(chǎn)率提高到0. 24。Shibata等設(shè)計(jì)合成了一個羅丹明磺酰胺測硫醇的熒光探針1213。該探針基于羅丹明開環(huán)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的變化,探針本身無熒光,與硫醇類物質(zhì)反應(yīng)后磺酰胺鍵斷裂,羅丹明110的強(qiáng)熒光結(jié)構(gòu)恢復(fù),熒光增強(qiáng)5800倍。探針12成功用于人乳腺癌細(xì)胞(HeLa cells)共聚焦成像,證明該探針膜滲透性好、可以對活細(xì)胞內(nèi)硫醇濃度的變化產(chǎn)生響應(yīng)。Ji等報道了基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的關(guān)-開熒光硫醇探針12和1314.由于作為供體的乙炔基pyrene熒光團(tuán)和作為受體的磺酰胺間的強(qiáng)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，探針處于暗態(tài)。與硫醇反應(yīng)后磺酰胺基團(tuán)斷裂，釋放出顯色團(tuán)，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移受阻，熒光團(tuán)的熒光恢復(fù)。半胱氨酸、谷胱甘肽和巰基丙酸能使12或13的熒光增強(qiáng)20到53倍。探針12被應(yīng)用于嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞核洋蔥表皮細(xì)胞硫醇熒光成像。在洋蔥表皮細(xì)胞成像表明強(qiáng)的熒光集中在細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核顯示弱的熒光。由于強(qiáng)的惡水性，探針12的細(xì)胞膜穿透能力較弱，不能應(yīng)用于洋蔥表皮細(xì)胞成像。 Maeda等報道了基于熒光素的探針14和1515.由于2，4-二硝基苯磺?；鶑?qiáng)的吸電子作用，導(dǎo)致熒光素?zé)晒忖?。由于硫醇?qiáng)的親核作用，與探針反應(yīng)斷裂2，4-二硝基苯磺?；尫懦鰺晒馑?，熒光素強(qiáng)的熒光恢復(fù)。在HEPES緩沖溶液中14和15的量子效率為0.0007和0.0003， 14與15與GSH在p H7.4和37的反應(yīng)速率常數(shù)為1.7102和1.4102M-1S-1。半胱氨酸和巰基丙胺的與GSH相似，巰基丙酸的較慢些。檢出極限低于2.0pmol/L。Wang等報道了基于部花青顯色團(tuán)的熒光探針1616.當(dāng)硫醇斷裂強(qiáng)吸電子2，4-二硝基苯磺?；?，釋放出離子化羥基的16.這使部花青顯色團(tuán)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移增強(qiáng)。導(dǎo)致在吸收光譜上大的紅移（380nm紅移至530nm）和“關(guān)-開”類型的熒光檢測，顏色也由黃色變?yōu)槌壬?。線性范圍為1.010-7 mol/L到8.010-5 mol/L。對谷胱甘肽的檢測極限為2.410-8mol/L。4 基于硒氮鍵斷裂谷胱甘肽過氧化物酶類似物Ebselen是在生物抗氧化防御體系關(guān)鍵的硒酶，有好的治療學(xué)性能和低毒性，在生物和醫(yī)學(xué)有重要的作用17。Ebselen含有能與巰基發(fā)生特異反應(yīng)的硒氮鍵。受此啟發(fā)，一些基于硒氮鍵的硫醇探針被報道。Tang等報道了基于羅丹明6G的熒光探針（Rh-Se）17于識別硫醇17。17有較弱的熒光，由于巰基強(qiáng)的親核作用使硒氮鍵斷裂釋放出有強(qiáng)烈熒光的羅丹明6G。激發(fā)波長為525nm，通過檢測在550nm熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對硫醇的檢測。在3.0 10-9 到1.2 10-7 M有良好的線性系數(shù)。檢測極限為1.4nM。Zhu報道了利用吸收紅移和熒光增強(qiáng)雙重檢測的硫醇探針1818， 在DMF 和水 (8:2, v/v)混合溶液中硫醇與piazselenole反應(yīng)產(chǎn)生供電性強(qiáng)的鄰苯二胺，從而導(dǎo)致吸收波長發(fā)生19nm的紅移和3倍量的熒光增強(qiáng)。利用吸收法測量的線性檢測范圍為4-12M，檢測極限為0.5M。熒光法線性檢測范圍是2-12M，檢測極限為0.03M。相對于巰基丙酸、巰基丙胺、半胱氨酸等非蛋白質(zhì)硫醇，探針18對谷胱甘肽顯示了更強(qiáng)的響應(yīng)。5 置換反應(yīng)在眾多的硫醇檢測體系中，利用硫醇和銅、汞、鎘等軟酸的強(qiáng)的親和力傳感器受到廣泛關(guān)注。這類傳感器最大的優(yōu)勢是能在水溶液中進(jìn)行。Shao等報道了基于螺吡喃的探針1919.金屬離子如銅離子和汞離子能導(dǎo)致螺吡喃開環(huán)，形成紫紅色的部花青結(jié)構(gòu)。在銅離子或汞離子存在下，半胱氨酸通過巰基失質(zhì)子形成胱氨酸。胱氨酸與銅離子和19形成1：2：2的三重組合體。紫外光譜最大吸收峰由532nm藍(lán)移至405nm，伴隨顏色由紫紅色變?yōu)辄S色。該體系的檢測極限為4.010-8M。文章指出在銅離子或汞離子存在下，即使是無氧條件，半胱氨酸也能被氧化為胱氨酸。證明了半胱氨酸的氧化為銅離子或汞離子催化氧化。Han 和Kim報道了利用Cd-TPXD和鄰苯二酚紫組成2：1：1藍(lán)色的傳感系蹤物20在pH7.0-8.5選擇識別半胱氨酸20。把半胱氨酸加入到傳感系蹤物的水溶液中，體系顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。這是由于相比于Cd2+（軟酸）與鄰苯二酚紫的兩個酚羥基（硬堿）弱的鍵，軟堿巰基與軟酸Cd2+有更強(qiáng)的親和力，從而釋放出鄰苯二酚紫，實(shí)現(xiàn)對半胱氨酸的目視檢測。Liao等利用桑色素（21）發(fā)展了一種簡單靈敏的熒光增強(qiáng)檢測痕量cys的方法。在pH7.4Britoon-Robinson緩沖溶液中，將cys加入Cu2+-桑色素（1：2）體系中由于競爭取代，釋放出顯色團(tuán)桑色素，在539nm處熒光強(qiáng)烈的增強(qiáng)。在6.5210-7-2.2010-5molL-1范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與cys濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，方法的檢測線為6.5210-8 molL-1.方法被應(yīng)用到檢測鮮豬血和人尿液蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的cys。Zhang最近報道了22與Cu2+形成2：1的傳感系蹤物通過直接取代反應(yīng)在水溶液中比色檢測cys和hcy的方法。在pH7.0緩沖溶液中加入cys或hcy，釋放出顯色團(tuán)22，導(dǎo)致紫外光譜498nm處吸收增強(qiáng)，顏色由黃色變?yōu)榧t色。其它氨基酸不干擾測定。6、硫醇與方酸衍生物缺電子四元環(huán)加成方酸有缺電子中心四元環(huán)，是一種強(qiáng)的親電試劑。并且方酸有長的吸收和發(fā)射波長，在水溶液中有好的熒光性能。因此，方酸衍生物也被應(yīng)用于硫醇檢測。Ros-Lis等合成了水溶性方酸衍生物23和2421。該探針在乙腈：水20:80 （v/v）混合溶液中在640nm有強(qiáng)的熒光，與硫醇反應(yīng)后熒光猝滅，溶液顏色也由藍(lán)色變?yōu)闊o色。乙醇、苯酚、胺、不含巰基氨基酸、硫化物、以及強(qiáng)親典型的氰根沒有導(dǎo)致光譜和顏色變化。探針1和2被成功應(yīng)用于檢測血漿中硫醇的含量。Sreejith等報道了近紅外方酸染料2522。脂肪族硫醇加成在四元環(huán)上，改變了吡咯基團(tuán)與四元環(huán)的的雙鍵，破壞了兩個吡咯基團(tuán)間的共軛，導(dǎo)致兩個初級顯色團(tuán)的重組。在乙腈：水（1：1）溶液中，加入氨基硫醇，最大吸收峰由紅外區(qū)（750nm）紅移至可見區(qū)（440nm），顏色也由綠色變?yōu)榱咙S色。當(dāng)激發(fā)波長730nm時，探針在800nm處弱的熒光發(fā)射峰降低。激發(fā)波長為410nm時，探針在592nm處出現(xiàn)新的強(qiáng)發(fā)射峰和亮橙色熒光。通過檢測在兩個不同激發(fā)波長的發(fā)射，可實(shí)現(xiàn)對生物樣品氨基硫醇的檢測。探針被成功應(yīng)用于檢測和評價血漿中氨基硫醇的含量，并且證實(shí)了吸煙能導(dǎo)致血漿中氨基硫醇含量的增高。7、醛基與含氮末端硫醇的反應(yīng)推-拉類型的分子，由于醛基強(qiáng)的吸電子效應(yīng)，受到激發(fā)時發(fā)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移。當(dāng)溶液中加入Cys或Hcy，醛基與氮末端硫醇反應(yīng)生成thiazolidines 或 thiazinanes，由于烴基弱的給電子效應(yīng)，阻止了分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移。因此將會發(fā)生吸收和發(fā)射光譜上的藍(lán)移。 Rusin等報道了利用熒光素二醛26選擇性識別半胱氨酸和高半胱氨酸23。加入半胱氨酸或高半胱氨酸，紫外吸收光譜發(fā)生紅移，熒光猝滅，溶液顏色由亮黃色變?yōu)樽攸S色。其它常見硫醇、氨基酸、胺、牛血清蛋白、尿素酶干擾很小。Zhang等報道了比色傳感器27和2824.27在DMF中最大吸收峰在465nm，加入cys，最大吸收峰藍(lán)移至442nm。為增加探針的水溶性，在28中引入兩個羥基。28中硝基的存在增強(qiáng)了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，使最大吸收峰紅移至515nm。在DMF-水（9：1）溶液中，醛與cys和hcy反應(yīng)降低了28的吸電子能力，導(dǎo)致探針的ICT受阻，最大吸收峰由515nm藍(lán)移至475nm。溶液也由粉紅色變?yōu)辄S色。其它氨基酸和谷胱甘肽不干擾測定。對cys和hcy顯示了良好的選擇性。由粉紅色變?yōu)辄S色。 Chen等報道了熒光增強(qiáng)的Hcy磷光化學(xué)傳感器2925. 在含29的DMSO-HEPES 中(pH 7.2, 9:1 v/v) hcy導(dǎo)致在525nm處磷光大的增強(qiáng)。1-hcy的發(fā)光量子產(chǎn)率為0.38，比1-cys的（0.002）明顯高出很多。首次通過發(fā)射峰和熒光強(qiáng)度變化區(qū)分開cys和hcy。其它氨基酸和相關(guān)硫醇多肽不干擾測定。但是DMSO-HEPES(9:1 v/v)是生物不適應(yīng)性的，需要200倍的HCY（4mM）降低了體系的靈敏度。Huang等報道了基于鉑化合物的磷光探針426.同時設(shè)計(jì)了不含醛基的對比化合物5.2在560nm有強(qiáng)的橘黃色發(fā)射峰，由于醛基強(qiáng)的吸電子能力，1的最大發(fā)射波長藍(lán)移至510nm，發(fā)光顏色變?yōu)橄鄳?yīng)的綠色。1在乙腈：水(40 lM, pH7.2, 4:1 v/v)溶液中量子產(chǎn)率為1.4.加入hcy，最大吸收峰紅移至555nm，相應(yīng)的發(fā)光顏色由綠色變?yōu)殚冱S色。其它氨基酸及谷胱甘肽不干擾測定。Zhang等報道了Y形雙光子熒光傳感器3127.相比于單光子熒光探針，雙光子熒光探針的激發(fā)波長在近紅外區(qū)，有很低的背景光，弱的光致傷害，在低濃度有高的發(fā)射。這些特性使雙光子探針適于生物成像。在DMF中，cys導(dǎo)致31的單光子激發(fā)熒光發(fā)射光譜明顯的改變，發(fā)射峰由535nm藍(lán)移至498nm，量子產(chǎn)率由0.66降低至0.31，相應(yīng)的熒光顏色由綠色變?yōu)榍嗌?。雙光子激發(fā)熒光發(fā)射光譜研究顯示，在787nm激發(fā)，31的雙光子激發(fā)熒光強(qiáng)度是31-cys（40倍量）的10倍，伴隨著30nm藍(lán)移。 Duan等報道了熒光探針3228. 32是一個電子受體-芳香熒光團(tuán)-電子受體-共軛體系。當(dāng)32與cys反應(yīng)，由于烴基弱的推電子能力，-共軛變?yōu)殡娮邮荏w-芳香熒光團(tuán)-電子給體。因此推-拉效應(yīng)更有效，導(dǎo)致高的熒光量子產(chǎn)率和伴隨發(fā)射光譜紅移。在乙醇：水(60:40, v/v) pH 7.2HEPES 緩沖(50 mM)，將cys加入含32的溶液中，最大吸收峰由375nm藍(lán)移至370nm。同時熒光發(fā)射增強(qiáng)伴隨著25nm紅移，熒光量子產(chǎn)率由0.25增至0.40，熒光顏色由藍(lán)變青。探針被應(yīng)用于V79細(xì)胞成像。Lin等報道了基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的熒光探針3329.當(dāng)染料富電子基團(tuán)共軛缺電子基團(tuán)，受到激發(fā)將會發(fā)生從供體到受體的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）。當(dāng)cys或hcy和探針反應(yīng)，探針電子供體-受體體系共軛破壞，ICT被關(guān)閉，導(dǎo)致吸收和發(fā)射波譜上較大的藍(lán)移。在10 mMHEPES buffer, pH 7.4/DMF (v/v, 1: 3)中，加入cys或hcy探針最大吸收峰由376nm藍(lán)移至330nm，熒光發(fā)射光譜由519nm到376nm發(fā)生125nm藍(lán)移。在394nm和519nm處熒光強(qiáng)度之比I394/I519，加入cys增強(qiáng)176倍，加入hcy增強(qiáng)920倍。探針的熒光顏色也由綠變藍(lán)。加入其它氨基酸、葡萄糖、含硫化合物沒有導(dǎo)致明顯的光譜變化。探針對cys在0.6到8010-5M有良好的線性范圍。生理學(xué)健康血漿中半胱氨酸的含量范圍在24-3610-5M，預(yù)示探針對檢測血漿中半胱氨酸有潛在的應(yīng)用。Kim等在2008年報道了兩個香豆素分子（34和35）30-31。在含有34的pH 7.4HEPES 緩沖溶液中，加入hcy 450nm熒光發(fā)射強(qiáng)度增強(qiáng)100倍，加入cys增強(qiáng)49倍。在365nm激發(fā)，只有含cys和hcy的探針溶液顯示亮藍(lán)色熒光。探針熒光增強(qiáng)可能因?yàn)橐韵聝蓚€原因：第一、將hcy加入探針34中，苯酚質(zhì)子和thiazinane氮原子形成氫鍵，阻止了在先前報道的thiazinane香豆素可能發(fā)生的PET猝滅。第二、thiazinane的形成，羰基sp2雜化軌道轉(zhuǎn)化為sp3雜化軌道，使從香豆素HOMO到醛羰基LUMO的電荷轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的熒光猝滅被降低，從而使探針的熒光增強(qiáng)。在含有10mM谷胱甘肽人血漿中，熒光增強(qiáng)也被觀察到。探針35含有推-拉類型的香豆素?zé)晒鈭F(tuán)31。二乙基胺基團(tuán)推電子，醛基和羰基拉電子，35在488nm產(chǎn)生強(qiáng)的熒光發(fā)射。在乙醇溶液中加入500倍量Hcy或cys，由于36的熒光團(tuán)附近thiazinane/thiazolidine的氮原子有一對孤電子，產(chǎn)生光致誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移使1的熒光猝滅。發(fā)射峰也藍(lán)移至470nm。Li等報道了探針3732，37能在水溶液和活細(xì)胞中從hcy和GSH中有效的區(qū)分cys。37無色有弱的熒光。在含有37的乙醇-PBS (0.1 M, pH=7.00, 3 : 7,v/v)溶液中，加入200Mcys，在531nm出現(xiàn)新的吸收峰，熒光增強(qiáng)20倍。37溶液的熒光強(qiáng)度在M級與cys成線性比例，檢測極限為7.35 10-8 M.加入Hcy導(dǎo)致小的熒光減弱。其它氨基酸和GSH不干擾測定。比hcy高的選擇性可能是因?yàn)榕c不飽和醛反應(yīng)，37與cys反應(yīng)產(chǎn)生五元雜環(huán)，形成不穩(wěn)定的化合物38，接著發(fā)生開環(huán)反應(yīng)促進(jìn)39水解為40，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，溶液顏色由無色變?yōu)樽仙?7與hcy反應(yīng)生成41，但為無色并無熒光。37被應(yīng)用于MCF和PC12細(xì)胞成像。對細(xì)胞內(nèi)cys濃度改變產(chǎn)生變化。并用于檢測人尿液cys，與文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)相符。8、基于巰基親核加成Zhang等報道了一個發(fā)射增強(qiáng)熒光cys/hcy探針38并應(yīng)用于生物成像33。在含有38的甲醇：HEPES（7：3，v/v）pH=7的緩沖溶液中，加入cys或hcy，最大吸收峰由430nm紅移至580nm，在465nm有一個明顯的等吸收點(diǎn)，相應(yīng)的顏色由黃綠色變?yōu)殚偌t色。激在發(fā)波長為465nm時，加入40倍的hcy，含有38的溶液588nm處熒光增強(qiáng)75倍，相應(yīng)強(qiáng)烈的橘紅色熒光。由于位阻效應(yīng)，其它硫醇在此條件下幾乎不發(fā)生反應(yīng)。38被應(yīng)用于激光共聚焦成像（CLSM）和雙光子熒光成像（TPLSM）。淋巴囊癌細(xì)胞（ACCM）激光共聚焦成像能顯示cys和hcy的亞細(xì)胞分布。在880nm雙光子熒光成像顯示，胰腺癌細(xì)胞（PANC）的熒光信號定位在細(xì)胞核周圍區(qū)域和類似核仁區(qū)域，HeLa細(xì)胞的熒光廣泛分布在細(xì)胞液和細(xì)胞核。PANC和HeLa熒光成像的不同顯示不同細(xì)胞內(nèi)cys和hcy的代謝機(jī)理是有差異的。Huang等報道了一個基于苯醌-甲基-類型反應(yīng)的長波長硫醇熒光探針3934。探針39在生理?xiàng)l件和水溶液中與硫醇自發(fā)的發(fā)生不可逆的氧化還原反應(yīng)。首先硫醇導(dǎo)致苯醌還原，隨后發(fā)生苯醌-甲基-類型重排反應(yīng)，釋放出在595nm處有強(qiáng)烈熒光的熒光團(tuán)40。其它氨基酸和生物還原劑不干擾測定。在1-100M范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與硫醇濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。 Zeng等發(fā)展了一個基于ICT機(jī)理的硫醇和過度金屬離子的雙重比色化學(xué)傳感器4135。41在450-700nm有一個強(qiáng)的ICT吸收帶。當(dāng)加入cys，由于cys的巰基在苯醌的1位親核加成導(dǎo)致苯醌轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的對苯二酚，降低了苯醌的受電子能力，ICT吸收帶強(qiáng)度逐漸降低，溶液的顏色也由深紫色變?yōu)闊o色。其它硫醇顯示了相同的變化，而其它氨基酸沒有導(dǎo)致光譜上明顯的改變。Yi等報道了一個基于光致誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）的高靈敏熒光探針4236。42由香豆素作為熒光團(tuán)和馬來酰亞胺作為硫醇的受體。分子內(nèi)雙鍵有效的光致誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移使熒光團(tuán)的熒光猝滅，42熒光量子產(chǎn)率僅為0.001。X晶體衍射分析顯示42包含一個能與硫醇發(fā)生Michael加成反應(yīng)的順勢雙鍵?；旌?2與硫醇立刻觀察到藍(lán)綠色熒光，在pH7.4和25，42與cys的反應(yīng)速率常數(shù)為7.010 M-14s-1。與谷胱甘肽反應(yīng)后熒光增強(qiáng)470倍，產(chǎn)物量子產(chǎn)率為0.47。其它氨基酸、氧化態(tài)谷胱甘肽（GSSG）和胱氨酸沒有產(chǎn)生明顯的光譜變化。探在0-100nM范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與谷胱甘肽濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，針的檢測線為0.5nM。探針被用于檢測谷胱甘肽還原酶（GR）的活性。人胚胎腎細(xì)胞（HEK-293）激光共聚焦成像顯示42有良好的細(xì)胞膜滲透性。Huo等將色烯衍生物43應(yīng)用于比色檢測硫醇3。在含有43的HEPES pH7.0緩沖溶液中加入cys，硫醇強(qiáng)親核性的巰基與43發(fā)生Michael加成，然后色烯通過開環(huán)釋放4-硝基苯酚基團(tuán)，最大吸收峰由292nm紅移至405nm（紅移113nm），顏色由無色變?yōu)辄S色。通過檢測405nm處吸收峰強(qiáng)度可實(shí)現(xiàn)對cys濃度的檢測。在pH7.4和25，速錄常數(shù)為kobs=0.62s-1，t1/2=1.0s，指示在實(shí)驗(yàn)條件下43與cys反應(yīng)迅速。其它氨基酸和常見陰離子，如F-、Cl-、Br-、I-、AcO-、SCN-、NO3-、SO42-、CO32-、-OOCCOO-、PO43-不干擾測定。43為利用色烯衍生物設(shè)計(jì)比色或熒光硫醇探針提供了一個新的模型，基于此方法的傳感器在將來可能被廣泛開發(fā)。Lin等報道了一個基于硫醇與，-不飽和酮1，4共軛加成反應(yīng)的熒光探針441.在pH7.4磷酸緩沖溶液中，44無熒光，加入cys，最大吸收峰由466nm藍(lán)移至444nm，在453nm出現(xiàn)等吸收點(diǎn)。激發(fā)波長為444nm時，在496nm出現(xiàn)新的發(fā)射峰，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)211倍，熒光顏色由黑色變?yōu)闊o色。檢測線為9.2510-7M。Hcy和谷胱甘肽分別導(dǎo)致180和35倍熒光增強(qiáng)。其它氨基酸、金屬離子（Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、和Zn2+）、活性氧基團(tuán)（過氧化氫）、還原劑（煙堿腺嘌呤二核苷酸）、核苷和葡萄糖沒有引起明顯的光譜變化。References(1)Lin, W. 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