實(shí)驗(yàn)五 等電聚焦測(cè)蛋白質(zhì)等電點(diǎn).doc

實(shí)驗(yàn)五 等電點(diǎn)聚焦測(cè)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)Mangogola等電點(diǎn)聚焦（IEF）是在電場(chǎng)中分離蛋白質(zhì)技術(shù)的一個(gè)重要進(jìn)展，其實(shí)質(zhì)就是在穩(wěn)定的pH梯度中按等電點(diǎn)的不同分離兩性大分子的平衡電泳方法。IEF的關(guān)鍵是得到一定范圍內(nèi)的穩(wěn)定pH梯度，即找到合適的兩性載體。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧基的同系物和異構(gòu)物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相異、相近。經(jīng)過適當(dāng)電泳時(shí)間后，兩性電解質(zhì)將依等電點(diǎn)遞增的次序在支持物中從正極到負(fù)極彼此相互銜接，形成一平滑穩(wěn)定的pH梯度。蛋白質(zhì)靠近正極在低于其pI的環(huán)境中帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)，反之則向相反方向移動(dòng)，最終停在其pI處。聚焦在等電點(diǎn)的分子也會(huì)不斷擴(kuò)散，一旦偏離等電點(diǎn)分子因pH的改變而重新帶上正或負(fù)電荷，從而又向pI遷移。最后測(cè)出蛋白質(zhì)停留位置的pH即為該蛋白質(zhì)的pH。一實(shí)驗(yàn)過程1.圓柱體凝膠制備用封口膜將玻管D4120mm的一端封口，將玻管套上橡膠塞放置在支架上，加入凝膠至10cm處（注意搖動(dòng)玻管，震出底部氣泡），輕輕鋪上一層雙蒸水，放置聚合1h。凝膠T=7.5%，C=2.7%，共4mL30%Acr，0.8%Bis1mL10%過硫酸銨0.02mL雙蒸水2.68mL載體兩性電解質(zhì)0.15mL樣品液（BSA-10mg/mL）0.05mL樣品液（肌紅蛋白-5mg/mL）0.05mLTEMED0.02mL共作三支管，每管加膠液約1.1mL2.聚焦電泳在電泳下槽注入0.2%硫酸500mL，將套有橡膠塞的玻璃管插入電泳上槽(注意塞緊所有孔，以防電極液下漏)，加入上槽溶液0.5%乙醇胺約1000mL（注意排除凝膠下表面的氣泡，凝膠上下表面都要接觸電極液）。接上電源，正極接酸，負(fù)極接堿，恒壓160V至電流為0，再繼續(xù)通電20min。3.蛋白質(zhì)染色及等電點(diǎn)測(cè)定用注射器向膠管注水取出膠條，測(cè)量膠體總長(zhǎng)度及肌紅蛋白距酸端（堿端）距離。將其中一膠條放在玻璃板上用刀片切成1cm長(zhǎng)的小段，按順序放入裝有2mL10mM的KCl溶液中，浸泡過夜，次日用pH計(jì)測(cè)每支管中的pH值。另外兩只膠條在三氯乙酸中浸泡，等出現(xiàn)灰色條帶時(shí)量總長(zhǎng)及其距酸端（堿端）距離。二數(shù)據(jù)記錄和處理1.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制初始數(shù)據(jù)如下表：標(biāo)號(hào)12345678910111213pH值8.769.118.639.178.968.277.636.946.576.125.24.383.89由于存在堿端漂移，舍去前三個(gè)數(shù)據(jù)，將其余數(shù)據(jù)對(duì)凝膠長(zhǎng)度作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖：即所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為pH=11.85576-0.60503*d2.計(jì)算樣品等電點(diǎn)總長(zhǎng)/cm1肌紅蛋白距堿端距離/cm2BSA距堿端距離/cmd1/cmd2/cm膠條19.45.67.77.744710.6489膠條285.356.98.693811.2125注：d=將膠條1和膠條2數(shù)據(jù)帶入求平均值得：肌紅蛋白的等電點(diǎn)pI=6.885；BSA的等電點(diǎn)pI=5.24。三注意事項(xiàng)1.本實(shí)驗(yàn)?zāi)z選用化學(xué)聚合方法，而沒有采用核黃素，是因?yàn)楹它S素很難溶于水，經(jīng)常失效，光照不合適難以聚合。2.灌膠時(shí)要快速細(xì)致，出現(xiàn)氣泡要及時(shí)將其彈震出去。3.剝?nèi)∧z時(shí)應(yīng)將針頭緊貼玻璃管壁，邊向下延伸邊注水，小心剝?nèi)　?.剝出的膠條放置在平皿中，要及時(shí)吸