質(zhì)粒DNA 的提取與檢測.doc

質(zhì)粒DNA 的提取與檢測1 概述細(xì)菌質(zhì)粒是一些雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，其大小范圍從1kb至2000kb不等。已經(jīng)存在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒，這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的遺傳單位。然而，它們又依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。通常，質(zhì)粒含有編碼某些酶的基因，這些酶事實(shí)上在一定的環(huán)境下可能對細(xì)菌宿主有利。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對抗生素的抗性、產(chǎn)抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物以及產(chǎn)生大腸桿菌素、腸毒素及限制酶與修飾酶等。質(zhì)粒DNA的復(fù)制由負(fù)責(zé)復(fù)制細(xì)菌染色體的多種酶來完成，但是不同的質(zhì)粒在宿主體內(nèi)所采用的酶迥然不同，而且在宿主中復(fù)制的程度也相差懸殊。一些質(zhì)粒的拷貝數(shù)可高達(dá)700個(gè)細(xì)胞，而另一些則只能維持在每套宿主細(xì)胞染色體僅對應(yīng)l個(gè)質(zhì)粒分子的最低水平上。控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因處于包括DNA 復(fù)制起點(diǎn)在內(nèi)的一個(gè)質(zhì)粒DNA 區(qū)域內(nèi)。通常情況下，一個(gè)質(zhì)粒只含有一個(gè)復(fù)制起始區(qū)（復(fù)制子）。目前使用的大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來源于pMB1質(zhì)粒的復(fù)制子。在正常生長條件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中可維持至少1520個(gè)拷貝（帶有該復(fù)制子的質(zhì)粒）。一般認(rèn)為，這種多拷貝的質(zhì)粒是以松弛方式進(jìn)行復(fù)制的。pMB1 復(fù)制子的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半壽期較長的酶。因此，即使蛋白質(zhì)合成并非正在進(jìn)行，復(fù)制依然能夠進(jìn)行。這樣，當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素存在時(shí)，帶有pMB1復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞中可以積聚兩三千個(gè)拷貝。單向復(fù)制從DNA 復(fù)制起點(diǎn)開始，由一個(gè)RNA 引物所引導(dǎo)，該引物的啟動(dòng)子位于復(fù)制起點(diǎn)上游大約550bp處。新生的RNA與DNA模板形成穩(wěn)定的雜交體，作為RNA 酶H 的底物，由RNA 酶H 切割從而產(chǎn)生引導(dǎo)DNA 合成的引物。而RNA的成熟則由另一個(gè)不翻譯的RNA小分子（RNA I）所控制。RNA I編碼RNA的同一區(qū)段的DNA 的互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄而來，它可與RNA 結(jié)合，并阻止RNA 折疊為三葉草結(jié)構(gòu)，而三葉草結(jié)構(gòu)對于形成穩(wěn)定的DNA-RNA 雜交體又是必不可少的。一個(gè)只有63個(gè)氨基酸的小蛋白（Rop蛋白）可以增強(qiáng)RNA I和RNA 的結(jié)合，這一蛋白由位于復(fù)制起點(diǎn)下游400個(gè)核苷酸處的基因所編碼。Rop 蛋白強(qiáng)化了RNA I對復(fù)制的負(fù)調(diào)節(jié)作用（圖）。圖 帶pMB1 （或ColE1）復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒在復(fù)制起始階段所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的方向及其粗略大小因此，可削弱RNA I 和RNA 之間相互作用的突變，將會(huì)增加帶有pMB1 復(fù)制子的載體的拷貝數(shù)。這些突變位于rop基因區(qū)或編碼RNA I 和RNA 的復(fù)制起點(diǎn)上游區(qū)內(nèi)。例如,pUC質(zhì)粒之所以拷貝數(shù)較高，是因?yàn)樵赗NA I的正常起始位點(diǎn)上游1 個(gè)核苷酸的位置帶有G-A突變，結(jié)果RNA I轉(zhuǎn)錄物的起始位點(diǎn)位于正常起始位點(diǎn)下游3個(gè)核苷酸的位置。RNA I 5-端的完整對于RNA I和RNA 間的相互作用至關(guān)重要。因此，pUC 質(zhì)粒拷貝數(shù)的增加看起來很可能是由縮短的RNA I和RNA 結(jié)合效率降低所致。除了控制拷貝數(shù)以外，質(zhì)粒上編碼RNA I、RNA 和Rop蛋白的區(qū)段也決定兩個(gè)不同的質(zhì)粒是否可以在同一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中共存。利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定地和平共處，可以稱之為不相容質(zhì)粒。當(dāng)兩個(gè)上述質(zhì)粒被導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí)，它們在復(fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中會(huì)彼此競爭。由于質(zhì)粒是從細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒庫中隨機(jī)選取出來進(jìn)行復(fù)制的，所以兩個(gè)不同的質(zhì)粒在一個(gè)單細(xì)胞中的拷貝數(shù)并不是總能保持相同。最初在隨機(jī)過程中產(chǎn)生的微小差異，將很快導(dǎo)致兩種質(zhì)粒在拷貝數(shù)上更嚴(yán)重的失衡。在一些細(xì)胞中，一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢；而在另一些細(xì)胞中，與之不相容的另一種質(zhì)粒卻占盡上風(fēng)。細(xì)菌生長幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)喪失殆盡，在原始細(xì)胞的后代中可能含有兩種質(zhì)粒的任意一種，但不會(huì)兼而有之。在分子克隆的所有操作中最基本的或許要算核酸的分離純化，分離純化核酸總的原則是： 應(yīng)保證核酸的一級結(jié)構(gòu)完整性； 排除其他分子的污染。為了保證對核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，完整的一級結(jié)構(gòu)是最基本的要求，因?yàn)檫z傳信息全部貯存在一級結(jié)構(gòu)中。核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式及其和其他大分子結(jié)構(gòu)結(jié)合的方式。核酸的純化方式應(yīng)符合以下三個(gè)條件： 核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子； 其他生物大分子（如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）的污染應(yīng)降低到最低程度； 排除其他核酸分子的污染，如提取DNA 分子時(shí)，應(yīng)去除RNA 分子，反之亦然。為了保證分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)注意以下事宜。 盡量簡化操作步驟、縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞。 減少化學(xué)因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH410 的條件下進(jìn)行。 減少物理因素對核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。機(jī)械剪切力的主要危害對象是大分子量的線型DNA 分子，如真核細(xì)胞的染色體DNA ；對分子量小的環(huán)狀DNA 分子，如質(zhì)粒DNA 及RNA 分子則威脅相對少一些。高溫（如長時(shí)間的煮沸）對核酸的完整性有很大破壞，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的有些化學(xué)鍵也有破壞作用。核酸提取過程中，常規(guī)操作溫度為04 ，此溫度環(huán)境可降低核酸酶的活性與降解反應(yīng)速率，減少其對核酸的生物降解。 防止核酸的生物降解，細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶會(huì)降解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)。其中DNA 酶需要二價(jià)金屬離子Mg2+、Ca2+的激活，使用二價(jià)金屬離子螯合劑EDTA、檸檬酸鹽基本上可以抑制DNA 酶的活性。不同的研究目的對DNA 的純度和量的要求不盡相同，一個(gè)好的DNA 分離程序應(yīng)符合以下三個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)。 所得的DNA 的純度應(yīng)滿足下游操作的要求，用于RFLP 分析的DNA ，其純度的要求為可用限制性內(nèi)切酶完全酶解并可成功地轉(zhuǎn)移到膜上進(jìn)行Southern 雜交；用于PCR 分析的DNA 則不應(yīng)含干擾PCR 反應(yīng)的污染物，PCR 過程對模板的要求不是很高，模板不需要達(dá)到超純。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，存在一定量的蛋白質(zhì)或SDS等對實(shí)驗(yàn)過程影響不大，所以只要沒有交叉污染，模板DNA 的制備可以不必像克隆、酶切、連接、標(biāo)記等反應(yīng)所用DNA的制備那樣嚴(yán)格。但在DNA 模板中，不能有影響擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)存在。例如蛋白酶、核酸酶、結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)等；另一類是尿素、十二烷基磺酸鈉、卟琳類物質(zhì)等；還有一類是二價(jià)金屬離子的螯合劑（如EDTA 等），會(huì)與鎂離子絡(luò)合，影響Taq DNA 聚合酶的活性。上述物質(zhì)的存在會(huì)影響擴(kuò)增效果，甚至使擴(kuò)增失敗。 所得的DNA應(yīng)當(dāng)完整，電泳檢查時(shí)應(yīng)能得到精確性高、重復(fù)性好的遷移帶型。 所得DNA應(yīng)有足夠的量。因此，核酸提取的主要步驟不外乎破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等。核酸提取的方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點(diǎn)而定，然而一些核酸純化和濃縮的基本方法都是一致的。核酸純化的關(guān)鍵步驟是去除蛋白質(zhì)，通常只要用苯酚氯仿和氯仿抽提核酸的水溶液即可。每當(dāng)需要把克隆操作中的某一步所用的酶滅活或去除以便進(jìn)行下一步操作時(shí)，即可進(jìn)行這種抽提。然而，如果要從細(xì)胞裂解液等復(fù)雜的混合物中純化核酸，則需要增加一些處理措施。這些情況下，通常先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)，然后再用有機(jī)溶劑抽提。這些廣譜的蛋白水解酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等，它們對多種天然蛋白均有活性。從核酸溶液中去除蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法是先用苯酚氯仿抽提，然后再用氯仿抽提，這是因?yàn)槭褂脙煞N不同的有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)比用單一有機(jī)溶劑效果更佳。此外，苯酚雖能有效地使蛋白質(zhì)變性，卻不能完全地抑制RNA 酶的活性，而且它還能溶解帶有長poly ( A）的RNA 分子。使用苯酚氯仿異戊醇（2524 1）混合液可使這兩個(gè)問題迎刃而解。然后再用氯仿抽提則可去除核酸制品中殘留的痕量苯酚。應(yīng)用最為廣泛的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價(jià)陽離子存在下形成的核酸沉淀物，可通過離心進(jìn)行回收并按所需濃度重新溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中。這一技術(shù)不但快速，而且對含量極低（皮克級）的DNA和RNA也可定量回收。主要的可變因素包括以下三個(gè)。(l）形成沉淀的溫度在 0 且沒有載體存在的情況下，濃度低至2Ong / mL的DNA也能形成沉淀，用微量離心機(jī)進(jìn)行離心即可定量回收。( 2 ）在沉淀混合液中使用的單價(jià)陽離子的類型和濃度 常用于沉淀核酸的陽離子及其濃度表，其選擇很大程度上取決于人們的習(xí)慣。表 常用于沉淀核酸的陽離子及其濃度提供陽離子的化合物貯存液濃度/molL-1終濃度/molL-1乙酸銨LiClNaCl乙酸鈉10.08.05.03.02.02.50.80.20.3乙酸銨常用于減少dNTP 的共沉淀。例如，在2mol/L乙酸銨存在下連續(xù)沉淀兩次，可從DNA 制品中除去99 的dNTP。但是，如果沉淀的核酸將要用于磷酸化則不能使用乙酸銨，因?yàn)殇@離子會(huì)抑制T4 噬菌體多核苷酸激酶的活性。若用較高濃度的乙醇沉淀核酸，例如在沉淀RNA 時(shí)，常用LiCl 。LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高而且不隨核酸共沉淀。如果沉淀的RNA 將用于無細(xì)胞翻譯或反轉(zhuǎn)錄過程，則應(yīng)避免使用LiCl。在大多數(shù)無細(xì)胞體系中，氯離子可抑制蛋白質(zhì)合成的起始，也抑制依賴于RNA的DNA聚合酶活性。由于不同大小的RNA 在高濃度LiCl中的溶解度各不相同，故LiCl可用于選擇性地純化大分子RNA。含有SDS的DNA樣品應(yīng)使用NaCl ( 0.2mol /L）進(jìn)行沉淀，這時(shí)去污劑在70的乙醇中仍保持可溶狀態(tài)。DNA和RNA的沉淀大多使用乙酸鈉（0.3mol /L , pH5.2）。（3） 離心的時(shí)間與速度 在沒有載體DNA的情況下，用微量離心機(jī)于04以1200g離心15min，可定量回收含量低于20ng /mL的核酸。然而，處理更低濃度的DNA或較短（少于100個(gè)核苷酸）的片斷時(shí)，則應(yīng)延長離心時(shí)間以使核酸沉淀緊貼于離心管上。用微量離心機(jī)離心以后，并非所有的DNA都聚集于管底，多達(dá)50的DNA可附著于管壁上。要回收所有的DNA，就必須要用液滴來回沖洗管壁的相應(yīng)扇面。可使用1倍體積的異丙醇代替2 倍體積的乙醇來沉淀DNA，使用異丙醇的優(yōu)點(diǎn)是待離心的體積較小。但是，異丙醇的揮發(fā)性比乙醇低，因而更難去除。此外，使用異丙醇時(shí)，蔗糖或氯化鈉等溶質(zhì)更容易與DNA共沉淀。一般來說，乙醇沉淀更受青睞，只有必須盡量減少溶液體積時(shí)除外。提取質(zhì)粒DNA有多種方法，所有這些方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA?？刹捎萌芫钙茐木w細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）可使細(xì)胞壁裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS處理后，在堿性條件下，細(xì)菌染色體DNA和質(zhì)粒DNA都變性，而閉環(huán)的質(zhì)粒DNA由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)加人乙酸鉀等物質(zhì)（在中性條件下）時(shí)，巨大的染色體DNA分子難以復(fù)性，而質(zhì)粒DNA很快得以復(fù)性。同時(shí)，在高鹽濃度的條件下，宿主染色體DNA、蛋白質(zhì)等形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心可去除大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，而質(zhì)粒DNA仍留在上清中，然后采用異丙醇或乙醇沉淀可得到質(zhì)粒DNA。通常在DNA樣品的分析中，往往通過測量OD值來確定其濃度。DNA的吸收峰在260nm 處，蛋白質(zhì)的吸收峰在280nm處。用標(biāo)準(zhǔn)樣品測得，在波長260nm 下，1g / mL DNA鈉鹽溶液的OD值為0.02，即在OD260=1時(shí)，雙鏈DNA含量為50g /mL ，單鏈DNA與RNA 含量為40g /mL，寡聚核苷酸的含量為30g /mL（由于底物不同而有差異）。這些標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)使人們能定量測定核酸，但是當(dāng)核酸的GC百分含量發(fā)生較大變化時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致這些數(shù)據(jù)的偏差。紫外分光光度法除可以測定核酸的含量外，還可以測定核酸的純度。已知核酸在260nm 處有堿基引起的強(qiáng)吸收峰，230nm處有一吸收低谷，蛋白質(zhì)在280nm處有一個(gè)由酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸引起的吸收峰，所以O(shè)D260OD280的值能說明蛋白質(zhì)對核酸的污染程度。一般認(rèn)為純凈DNA 的OD260OD280約為1.8，而純凈RNA的OD260OD280約為1.8 2.0，樣品中若含有蛋白質(zhì)，會(huì)使OD260OD280的值下降。當(dāng)OD260OD280小于1.75時(shí)，該樣品可適當(dāng)稀釋，用氯仿異戊醇抽提，重新用無水乙醇沉淀后再進(jìn)行測定。當(dāng)DNA 樣品的OD260OD280大于2時(shí)，則RNA濃度過高，需要去除RNA。但這樣的評估對于不純的樣品沒有意義，因?yàn)槿鬌NA同時(shí)含有蛋白質(zhì)和RNA也會(huì)使比值落在1.8左右，這時(shí)應(yīng)進(jìn)行電泳鑒定，以排除蛋白質(zhì)和RNA同時(shí)存在的可能性。此外，還可以輔以O(shè)D230測定，OD260/OD230的值應(yīng)大于2.0，小于該值時(shí)表明樣品中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)。所提取的質(zhì)粒DNA可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。一般情況下，提取的質(zhì)粒為3 條帶（圖）。在細(xì)胞內(nèi)，質(zhì)粒DNA是共價(jià)閉環(huán)DNA (covalently Closed circular DNA )，常以超螺旋形式存在。如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處缺刻，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開環(huán)DNA（open circular DNA )；若兩條鏈在同一處或相近的部位斷裂，則變成線性DNA 分子。在電泳時(shí)，同一質(zhì)粒的電泳速度因DNA的構(gòu)型不同而異，其速度從大到小的次序?yàn)椋篶ccDNA線性DNA ocDNA，共價(jià)閉環(huán)DNA的泳動(dòng)速度最快。但在優(yōu)化條件下，如在冰浴中或用試劑盒提取時(shí)，可以只出現(xiàn)一條帶或主要出現(xiàn)一條帶，即超螺旋帶。圖 質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖MHind ；1，2，3，4-pBI121；5，6pActlIsGFP-1提取的質(zhì)粒DNA 經(jīng)RNase 消化后，可直接使用或經(jīng)進(jìn)一步純化后用于其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。純化后的質(zhì)粒DNA可用分光光度計(jì)檢測其純度和濃度。本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，包括載體質(zhì)粒DNA和重組質(zhì)粒DNA，用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化、酶切和PCR等實(shí)驗(yàn)。2. 目的掌握質(zhì)粒DNA 的提取和檢測方法。3. 主要試劑和材料(1)LB液體培養(yǎng)基 胰蛋白胨10g /L，酵母提取物5g /L ,NaCl 10g/L, pH7.0。(2)STE溶液 0.lmol/L NaCI, 10mmol/L TrisCl ( pH8.0), 1mmol / L EDTA ( pH8.0）。(3)溶液I 50mmol/L 葡萄糖，25rnmol/L TrisCl(pH8.0 ) ,10mmol / LEDTA ( pH8.0）。(4)溶液 0.2mol /L NaOH, l % SDS；使用前用0.4mol / L NaOH 和2%SDS等量混合。(5)溶液 5mol/L 乙酸鉀60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL。(6)TE 10mmol/L TrisCl(pH8.0),lmmol/L EDTA (pH8.0）。(7)其他 氯仿異戊醇（24 : 1），無水乙醇，70乙醇。4 主要儀器設(shè)備恒溫?fù)u床，離心機(jī)，渦旋振蕩器，微量移液器，水浴鍋。5. 實(shí)驗(yàn)步驟（1）從選擇性培養(yǎng)平板上挑取單菌落，移至含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 振蕩培養(yǎng)過夜（不要超過16h ）。（2）將1.4mL培養(yǎng)物移至1.5mL離心管中，12000r / min離心lmin 。（3）棄上清（一次性地將液體倒出，并用濾紙吸凈管口殘余的液體，盡量避免液體重新流回管底），用lmL STE溶液重懸細(xì)菌沉淀，12000r/min離心