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蛋白質檢測研究進展 1 Contents 1 蛋白質簡介2 蛋白質的檢測方法3 蛋白質與疾病的關系 2 蛋白質簡介 蛋白質是由氨基酸脫水縮合形成的空間結構復雜的大分子有機物 其主要化學元素為C 約50 O 約23 N 約16 H 約7 S 約0 3 氨基酸是蛋白質的基本組成單位 蛋白質既具有氨基酸的部分理化特性 也具有其它有機物的一些共性以及眾多的自身獨有特點與性質 高分子 兩性解離及等電點 水合作用 變性作用 顯色反應 雙縮脲反應 Folin 酚反應 茚三酮反應 米倫反應 黃蛋白反應 乙醛酸反應 坂口反應 偶氮反應 考馬斯亮藍反應 氨基酸的 氨基及 羧基反應 蛋白質的異常表達與體內多種疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關 3 蛋白質的檢測方法 傳統(tǒng)蛋白質檢測方法 免疫印跡法 酶聯(lián)免疫吸附試驗常規(guī)方法 物理法 紫外吸收法化學法 凱氏定氮法 比色法高效液相色譜法毛細管凝膠電泳法近紅外光譜法質譜法熒光法 4 免疫印跡法 Westernblot 原理 蛋白樣品經(jīng)過電泳分離后 轉移并固定于膜上 然后應用抗原抗體反應進行特異性檢測的方法 Western雜交是將蛋白質電泳 印跡 免疫測定相結合的特異性蛋白質的檢測方法免疫印跡法是檢測蛋白質混合溶液中某種特定目的蛋白的定性方法 也可以作為確定同一種蛋白質在不同細胞或同一種細胞在不同條件下的相對含量的半定量方法 5 免疫印跡法檢測樣品中特異蛋白質的基本流程 樣品的凝膠電泳 蛋白印跡 封閉反應 與特異性抗體 一抗 孵育 與酶耦聯(lián)的二抗孵育 顯色或化學發(fā)光顯影 觀察和記錄結果 6 酶聯(lián)免疫吸附試驗 原理 酶聯(lián)免疫吸附試驗 enzymelinkedimmunosorbantassay ELISA 是一種固相免疫測定技術 先將已知的抗原或抗體包被到某種固相載體表面 并保持其免疫活性 測定時 將待檢樣本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗原或抗體發(fā)生特異性反應 最后加入酶反應底物 根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其光密度 OD 值的大小進行定性或定量分析 優(yōu)點 靈敏度高 特異性好 簡便 重復性好 ELISA和Western雜交都利用抗原抗體間的分子識別作用 借助不同的抗體分子標記實現(xiàn)蛋白質的檢測 7 紫外吸收法 理論基礎 蛋白質分子中的酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在280nm處具有紫外吸收 其吸光度與蛋白質含量成正比 此外 蛋白質溶液在238nm的吸光度值與肽鍵含量成正比 利用一定波長下蛋白質溶液的吸光度值與蛋白質濃度的正比關系可以測定蛋白質含量 優(yōu)點 簡便 靈敏 快速 不消耗樣品 測定后能回收缺點 準確度較差 專一性差 干擾物質多 若樣品中含有嘌呤 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質 會出現(xiàn)較大的干擾 8 凱氏定氮法 理論基礎 各種蛋白質的含氮量很接近 通常占其總重量的16 左右 蛋白質樣品用濃硫酸消化后 可以轉變?yōu)榱蛩徜@ 硫酸銨中的NH4 與NaOH反應又可轉變?yōu)镹H3 用硼酸液吸收后 可由標準鹽酸滴定并定量 凱氏定氮法由于蛋白質是體內的主要含氮物 因此 通過測定生物樣品的含氮量便可估算出樣品中的總蛋白質含量 蛋白質含量 含氮量 6 25此方法的測定范圍為0 2 1 0mg氮 優(yōu)點 應用范圍廣 重現(xiàn)性好 準確度高缺點 局限于樣品中總蛋白的檢測 破壞蛋白質結構 易受到被測樣品中其它有機含氮化合物的干擾 9 比色法 雙縮脲法 原理 蛋白質含有兩個以上的肽鍵 故有雙縮脲 NH2 CO NH CO NH2 反應 在堿性條件下 肽鍵的質子被解離 Cu2 和失去質子的多肽鏈的氮相結合產(chǎn)生穩(wěn)定的紫色絡合物 在540 560nm的光吸收值與蛋白質的含量在一定范圍內呈線性關系 由于與雙縮脲試劑與不同種類的蛋白質反應產(chǎn)物的顏色差別極小 使得該方法比較適合總蛋白質的檢測 優(yōu)點 操作簡單 測量速度快缺點 靈敏度較差 精度不高 10 比色法 Folin 酚試劑 Lowry法 原理 1 蛋白質在堿性條件下與試劑甲 雙縮脲試劑 中的Cu2 形成絡合物 2 由于蛋白質含芳香族氨基酸殘基 如Tyr和Trp 生成的絡合物可還原試劑乙 Folin 酚試劑 中的磷鉬酸和磷鎢酸而產(chǎn)生鉬藍和鎢藍復合物 該復合物顯藍色 其顏色深淺與蛋白質濃度在一定范圍內呈線性關系 可用于定量分析 優(yōu)點 反應靈敏 檢測限低 比較適合微量蛋白質的測量缺點 Folin 酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定因而要求精確控制操作時間 且容易受去酚類 糖類 尿素等多種物質的干擾 此外 而不同的蛋白質的酪氨酸和色氨酸的含量不同 導致在不知道蛋白質種類的情況下測量結果存在部分偏差 11 比色法 BCA法 BCA Bicinchoninicacid 試劑的主要成分為二喹啉甲酸鈉 BCA并不能直接與蛋白質發(fā)生化學或是物理上的反應 而是對雙縮脲反應的強化 BCA極易與Cu 結合形成紫色的復合物 該復合物在562nm處有最大吸收峰 對入射光的吸收程度與Cu 的濃度成正比 12 比色法 BCA法 優(yōu)點 穩(wěn)定性好 顯色靈敏度高 顯色靈敏度與Folin 酚法相當 且不受去垢劑 變性劑的影響缺點 反應速度慢 易受糖類 尿素 B2巰基乙醇等物質的干擾 比Folin 酚法對糖類更加敏感 13 比色法 考馬斯亮藍法 理論基礎 1 考馬斯亮藍屬于三苯甲烷類染料 分為G 250和R 250兩種 是目前使用最為廣泛的一種蛋白質染色劑 2 考馬斯亮藍G 250在游離狀態(tài)下呈紅色 吸收峰位置為488nm左右 容易與蛋白質中的精氨酰和賴氨酰殘基結合 結合后顏色變?yōu)樗{色 最大吸收峰的位置轉移到595nm 優(yōu)點 結合穩(wěn)定 反應速度快 顯色靈敏度高 操作簡便 不受酚類 游離氨基酸 絡合劑等成分干擾缺點 不同蛋白質中的精氨酰和賴氨酰殘基的含量不同 因此其與不同的蛋白質結合有強有弱 導致測量不同的蛋白質時存在較大偏差 14 比色法 茚三酮法 茚三酮 又名苯并戊三酮 溶于水后與水分子結合形成水合茚三酮 進而可與氨 一級胺 二級胺發(fā)生化學反應生成紫藍色或黃色縮合物 茚三酮法可用于水解蛋白質的檢測 15 比色法 茚三酮法 以氨基酸為例 首先在弱酸性加熱條件下氨基酸與水合茚酸酮發(fā)生氧化反應 氨基酸脫去氨基和羥基變成醛類化合物 水合茚三酮吸收氨基并脫去分水子變成胺合茚三酮 隨后胺合茚三酮與茚三酮反應生成席夫堿 并最終形成紫藍色或黃 棕色化合物 產(chǎn)物顏色的深淺與蛋白質的濃度相關 最大吸收波長為570nm左右 優(yōu)點 極高的顯色靈敏度和良好的檢出限缺點 水合茚三酮和不同的氨基酸顯色程度有所差異 蛋白質水解程度的不同容易對測量結果造成較大誤差 此外 茚三酮顯色劑的穩(wěn)定性較差 不利于長期存儲 16 高效液相色譜法 原理 1 利用組分在兩相中的熱力學分配系數(shù)和動力學擴散系數(shù)差異來實現(xiàn)混合組分分離2 由于不同的物質的溶解度 蒸汽壓 吸附能力等物理化學性質存在差異 它們在流動相和固定相之間的分配系數(shù)有所不同 當兩相做相對運動時樣品組分在兩相之間進行多次連續(xù)分配 最終實現(xiàn)各組分的彼此分離優(yōu)點 其分離柱壽命長 分離效率高 分析時間短 進樣量小 檢測靈敏度高缺點 對組成單位相似 分子極性相近 分子大小不同的動植物蛋白組分分離效果不佳 17 近紅外光譜法 原理 當紅外光照射樣品分子時 極性共價鍵選擇性地吸收某些波長的光后產(chǎn)生振動能級躍遷 吸收光子的頻率與躍遷前后的能量差相關 吸收的強度取決于化學鍵振動的非諧性 分子的基頻振動產(chǎn)生的吸收譜帶位于波長2500 25000nm的中紅外區(qū)域 發(fā)生780 1100nm的短波近紅外區(qū)1100 2500nm的長波近紅外區(qū)的吸收譜帶對應著基頻振動的倍頻和組合頻 含氫基團 X H 的振動躍遷非諧性常數(shù)最高 其在有機物的近紅外吸收光譜中占主導地位 優(yōu)點 絕大多數(shù)的有機物都有吸收響應 所以測量時幾乎無需進行樣品前處理缺點 吸收系數(shù)小 其檢測限通常不到0 1 不利于對蛋白質的衡量分析 18 質譜法 原理 質譜分析法是將化合物形成母離子和碎片離子 根據(jù)離子的質荷比 m z 進行分離 從而對化合物的成分和結構進行分析的方法質譜分析的一般過程是 樣品由合適的進樣裝置引入并進行氣化 氣化后的樣品進入離子源后被電離 電離后的離子經(jīng)過適當加速后進入質量分析器 根據(jù)不同的m z進行分離 到達檢測器 產(chǎn)生不同的信號 利用專業(yè)的生物軟件進行后續(xù)分析 優(yōu)點 準確性高 靈敏度高 與傳統(tǒng)的生物學技術手段相比 基于質譜的蛋白質組學技術更適合于臨床疾病的研究缺點 技術發(fā)展不夠完善 19 毛細管凝膠電泳法 原理 電泳也稱作電遷移 是指溶液中帶電粒子在電場中所發(fā)生的遷移運動 運動的遷移率與組分分子的大小 極性 親和能力 等電點 相分配系數(shù)以及所帶電荷的多少等多個因素有關 毛細管電泳又稱為毛細管電分離 是以毛細管為分離通道 以高壓直流電場為驅動力 根據(jù)帶電粒子遷移率的不同來實現(xiàn)組分分離的一種液相分離技術 在毛細管內充滿凝膠介質的電泳稱為毛細管凝膠電泳 電泳過程中 不同分子在電場作用下發(fā)生電泳遷移時受到網(wǎng)狀凝膠的阻礙作用不同 使其遷移速度不同 最終被分離 優(yōu)點 分離度極高 分離速度較快 樣品消耗量少 進樣量為nL級 缺點 分離檢測成本高 大分子容易積留 清洗困難 重現(xiàn)性差 20 熒光法 熒光探針具有靈敏度高 選擇性好 體積小 受生物體內活性小分子及金屬離子干擾小等優(yōu)點基于小分子熒光探針檢測蛋白質小分子與蛋白質相互作用后可引起小分子熒光光譜和蛋白質自身熒光內源熒光光譜以及同步熒光光譜的變化 如熒光強度和偏振度的改變 新熒光峰的出現(xiàn)等 這些均可以提供小分子與蛋白質結合的信息 小分子與蛋白質作用引起體系熒光性質改變有兩種情況 小分子無熒光 在蛋白質溶液中加入小分子后 蛋白質的內源熒光淬滅小分子有熒光 蛋白質與小分子作用后 內源熒光被淬滅 而小分子的熒光被敏化增強 21 基于蛋白質疏水作用 在水介質中球狀蛋白質的折疊總是傾向于把疏水性殘基包埋在分子內部而形成疏水空腔 疏水作用及親水和疏水平衡在蛋白質結構與功能方面起著關鍵作用 利用極性敏感有機小分子熒光探針與蛋白質結合前后基于其疏水空腔提供了一個非極性環(huán)境從而導致探針熒光性質的改變 22 基于蛋白質與有機染料結合作用蛋白質與熒光染料結合后 能使溶液熒光強度增強或淬滅 并且其變化量與蛋白質濃度成正比 有機染料包括 血管黃素 曙紅Y 鉻天青S 溴酚藍 四羧基苯基卟啉 Evansblue 偶氮染料 方酸菁染料 酞菁染料等 曙紅Y鉻天青S 23 溴酚藍 四羧基苯基卟啉 Evansblue 24 偶氮染料方酸菁染料 酞菁染料 25 基于AIE機理檢測蛋白質此外 小分子熒光探針還可基于熒光能量共振轉移 fluorescenceresonanceenergytransfer FRET 光誘導電子轉移 photo inducedelectrontransferPET 分子內電荷轉移 Intramolecularchargetransfer ICT 等效應對蛋白質進行選擇性識別 26 基于自組裝機理檢測蛋白質超分子化學 分子聚集體結構和功能為研究對象 旨在研究分子基于弱相互作用的組裝 自組裝和自組織行為 并研究這些行為可能帶來的結構和功能的改變 以期建立結構和功能之間的關系 超分子的組裝的實現(xiàn)依賴于分子間鍵 它包括氫鍵 范德華力 親脂 疏水作用 金屬離子的配位鍵 堆積作用等 PalapuravanAnees etal J Am Chem Soc 2014 136 13233 13239 27 比色 比率型熒光探針檢測蛋白質利用催化消除氨基甲酸酯保護基團合成了反應型探針 BSA的存在使得氨基萘二甲酰亞胺的綠色熒光增強 根據(jù)溶液顏色變化和熒光強度比值識別并定量檢測 X Zhang etal Analyst 2011 136 19 4008 4012 28 基于熒光有機納米材料檢測蛋白質納米材料 是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍 100nm 或由該尺度范圍的物質作為基本單元構成的材料 納米材料的特殊結構 使其具有不同于常規(guī)材料和單個分子的一些特性 主要包括比表面積大 高化學活性 特殊的光 電 磁性質等 而熒光納米材料 由于其特殊的結構與光學特性 為化學 物理 醫(yī)學和生物領域的發(fā)展帶來了新的機遇 29 半導體量子點量子點是主要由 族及 族元素構成的半導體納米顆粒 量子點在研究蛋白質方面具有許多優(yōu)勢 首先 可以用同一激發(fā)波長的光源同時激發(fā)多種不同熒光的量子點 并且由于其發(fā)射譜帶窄而對稱 多種顏色的發(fā)射峰不易出現(xiàn)重疊與紅移拖尾 熒光光譜易于區(qū)分和識別 另外 量子點的斯托克斯位移較大 可以有效避免激發(fā)峰與發(fā)射峰的重疊 減少干擾 此外 量子點的光學特征可以通過控制反應條件有效控制量子點熒光可調的光學特征為蛋白質多色標記及同步檢測奠定了基礎 30 嵌入式核殼熒光納米顆粒嵌入式核殼熒光納米顆粒是指一些負載有機熒光染料分子的無機納米顆粒或多聚生物大分子包被型納米顆粒 這種材料在蛋白質標記成像中有固有優(yōu)點 首先 納米顆粒對內部所包裹的熒光染料有保護作用 使其熒光穩(wěn)定性增強 可以克服外界環(huán)境對熒光材料的影響 其次 一個納米顆粒內所包裹的熒光分子往往多達幾千甚至幾萬個 因此 更多的熒光分子可以連接在生物分子上 當產(chǎn)生信號響應時 很多熒光分子同時產(chǎn)生熒光信號 起到了信號放大的作用 從而提高檢測靈敏度 31 碳點碳點是一種近似球型且直徑小于10nm的零維半導體納米晶體 是由極少分子或是原子組成的納米團簇 熒光性能是碳點最突出的性能 碳點具有熒光穩(wěn)定性高 熒光波長可調 抗光漂白能力強 激發(fā)光寬且連續(xù) 能夠實現(xiàn)一元激發(fā) 多元發(fā)射等特點 制備碳點的碳源來源豐富且價廉 毒性低 利用碳點表面的 NH2和 OH 在碳點表面接上對生物分子有特異性識別作用的核酸適體或分子印跡聚合物 可提高分析的靈敏度和選擇性 在蛋白質研究中 碳點通過與蛋白質的作用 改變了表面電子空穴對之間的復合效率 從而發(fā)生熒光的增強或猝滅 實現(xiàn)對蛋白質的標記和分析 32 貴金屬元素納米簇貴金屬元素納米簇的尺寸通常小于2nm 具有強的可見 近紅外熒光 同其他熒光納米材料相比 貴金屬元素納米簇更加穩(wěn)定 分散性更好 近幾年來 貴金屬納米簇分子橋的研究是一大熱點 由于金屬納米簇的低毒性 近紅外光譜特征 超小尺寸及優(yōu)良的熒光性質 它們已廣泛用于蛋白質檢測 標記成像及蛋白質間相互作用的研究領域 33 磁性熒光納米顆粒磁性熒光納米顆粒是一種結合了磁性和發(fā)光性能的納米材料 磁性熒光納米材料集合了磁性納米顆粒的快速磁響應性以及熒光材料的光致發(fā)光能力 在分離的同時還能進行光學檢測 34 35 蛋白質與疾病的關系 妊娠期高血壓疾病妊娠期特有的疾病 發(fā)生率為9 4 10 4 可導致腦出血 腦水腫 心力衰竭 肺水腫 新生兒死亡等不良妊娠結局 尤其是早發(fā)型重度子癇前期 是導致產(chǎn)婦及新生兒死亡的主要原因之一 嚴重危害母嬰健康 該疾病以 妊娠20周后高血壓 蛋白尿 水腫 為主要表現(xiàn) 正常人每日自尿中排出約40 80mg蛋白 上限不超過150mg 其中主要為白蛋白 其次為糖蛋白和糖肽 通過檢測尿蛋白含量 可以有效預防妊娠期高血壓疾病的發(fā)生 36 慢性腎臟病及糖尿病慢性腎臟病 CKD 的進展是一個不可逆轉的過程 其發(fā)展是以腎功能進行性下降 細胞外基質 ECM 在細胞外大量聚集而致的廣泛腎纖維化為特征 最終出現(xiàn)終末期腎功能衰竭 非選擇性蛋白尿是大多數(shù)腎臟病共有的表現(xiàn)之一 其中存在的大量毒性 炎性物質 大量蛋白尿 特別是大量非選擇性蛋白尿出現(xiàn)時 能夠通過一系列不同的機制表現(xiàn)出腎臟毒性加速腎臟病的進展 蛋白尿不僅僅是腎臟病進行性發(fā)展過程中的表現(xiàn) 又是其重要危險因素之一 37 冠心病指由于脂質代謝不正常 血液中的脂質沉著在原本光滑的動脈內膜上 在動脈內膜一些類似粥樣的脂類物質堆積而成白色斑塊 稱為動脈粥樣硬化病變 這些斑塊漸漸增多造成動脈腔狹窄 使血流受阻 導致心臟缺血 產(chǎn)生心絞痛 高密度脂蛋白 HDL 富含大量