頭孢菌素ccc 2.doc

21中北大學課程設計說明書發(fā)酵工程課程設計說明書年產(chǎn)300噸頭孢菌素C的發(fā)酵工藝設計學生姓名： 學號： 學 院： 專 業(yè)： 指導教師： 2013年 12月目錄引言.41 菌種的選育.6 1.1 菌種的選育及制備.61.1.1 實驗材料 .61.1.2 培養(yǎng)基的配置 .61.1.3 菌種選育方法 .61.1.3.1 自然選育.61.1.3.2 頭孢菌素 C 抗性平皿的制備 .71.1.3.3 紫外線誘變.7 1.2 菌種的保藏.82 培養(yǎng)基的配制.8 2.1 培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求.82.1.1 水 .92.1.2 碳源.92.1.3 氮源.92.1.4 無機鹽類及微量元素.92.1.5 生長因子和產(chǎn)酶促進劑.9 2.2培養(yǎng)基的種類.92.2.1 孢子培養(yǎng)基.102.2.2 種子培養(yǎng)基.102.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 .10 2.3 培養(yǎng)基的滅菌.10 2.3.1 滅菌方法.11 2.3.2 培養(yǎng)基的濕熱滅菌.11 2.4 空氣滅菌.11 2.4.1 過濾除菌流程及設備 .11 2.4.2 無菌空氣的檢查.13 2.5 發(fā)酵罐的滅菌.133 種子擴大培養(yǎng).13 3.1 種子制備.13 3.2 發(fā)酵罐培養(yǎng).134 發(fā)酵罐的設計.14 4.1發(fā)酵罐的結構.14 4.2發(fā)酵罐的工藝尺寸.14 4.3封頭壁厚.16 4.3物料衡算.165 發(fā)酵過程的工藝控制.175.1 發(fā)酵過程的補料策略.175.2 發(fā)酵過程pH值的控制.175.3 發(fā)酵過程溫度的控制.185.4溶氧的控制.185.5 染菌的控制.186 下游加工.18 6.1 發(fā)酵液的過濾和預處理.19 6.2 提取.197 總結和討論.198 頭孢菌素發(fā)酵工藝總流程圖.199 參考資料.20 引言 頭孢菌素 C（Cephalosporin C）屬 -內(nèi)酰胺類抗生素，是國際上抗生素類藥物之一，在抗生素藥物中所占比例也逐年上升。頭孢菌素C為兩性化合物，分子中有兩個羧基和一個氨基，其PK值為等于 2.6（側鏈羧基）3.1(核羧基)，9.8（側鏈NH4+基）。在甲基吡啶-醋酸鹽緩沖液（pH7）和吡啶-醋酸鹽（pH4.5）緩沖液中，電泳趨向于正極，表明頭孢菌素C在中性和偏酸性下呈現(xiàn)酸性，能與堿金屬結合成鹽類。 頭孢菌素 C 鈉鹽含有兩個結晶水，為白色或淡黃色結晶性粉末，易溶于水，不溶于有機溶劑。對稀酸以及重金屬離子均穩(wěn)定，當 pH 大于 11 時迅速失活。同時失去在 260nm 下的吸收峰，紫外光照射也可失活。對葡萄球菌產(chǎn)生的青霉素酶穩(wěn)定，但易被某些革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的頭孢菌素酶水解。 頭孢菌素 C 對茚三酮、雙縮脲反應呈陽性，對亞硝基鐵氰化鈉反應呈陰性，紫外最大吸收為 260nm。 頭孢菌素 C 中最富有反應性的基團是 3-乙酰氧基。溫和條件下用酸水解頭孢菌素 C 可得到少量除去側鏈的母核7-氨基頭孢烷酸簡稱 7-ACA。經(jīng)酸水解或乙酰酯酶處理頭孢菌素 C，則生成去乙酰頭孢菌素，簡稱 DCPC。其為頭孢菌素 C 發(fā)酵液中的主要副產(chǎn)物，理化性質(zhì)與頭孢菌素 C 及其相似。其 PK 值等于 2.5、3.0、9.7。紫外最大吸收波長為 261nm；紅外光譜與頭孢菌素 C 相似。 頭孢菌素 C 及其它頭孢菌素在弱堿性條件下發(fā)生水解、胺解等反應，或在酶催化水解時不能生成類似于青霉噻唑基那樣穩(wěn)定的頭孢噻唑基，因為反應不僅打開 -內(nèi)酰胺環(huán)，而且還進一步使二氫噻嗪環(huán)也破裂，最終形成以側鏈為主的派那地酸或派那地酸結構的衍生物。 頭孢菌素 C 抗菌活性及臨床應用 ，頭孢菌素類抗生素自 1970 年以來是國外發(fā)展最迅速，上市品種最多的一類抗生素，是包括頭孢烯、氧頭孢烯、碳頭孢烯和 7-甲氧基頭孢烯在內(nèi)的一類藥物。它們的作用機制是抑制細菌細胞壁的合成，而人類和其他哺乳動物的細胞無細胞壁，因此對人應是無害的。臨床應用證明它是一類抗菌譜廣、抗菌活性強、療效高、毒性低的抗生素，為人類戰(zhàn)勝各種細菌感染作出極大的貢獻。 國內(nèi)從 1980 年開始至今進行了兩輪較大規(guī)模的開發(fā)研究，引進消化提高，至此已達到一定水準。主要由于其抗菌譜廣，殺菌力強，對-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性高，毒副反應低，臨床療效好。同時具有較高商業(yè)利潤。故國外眾多制藥公司、研究部門相繼投入巨資，從事開發(fā)和生產(chǎn)，取得了許多令人矚目的成果。而我國 20世紀末頭孢菌素工業(yè)才有長足發(fā)展。對頭孢菌素的廣泛而深入的研究，改造后的衍生化合物作為化療劑有的已突破了抗細菌感染的范圍，具有蛋白酶抑制劑的功效，可用于抗退化、治療癌癥、骨質(zhì)疏松、類風濕關節(jié)炎、阿爾茨海默病、白內(nèi)障等。這很可能為頭孢菌素帶來新的前景。 頭孢菌素的發(fā)展速度、臨床使用率和銷售利潤大大超過半合成青霉素，從而引起國內(nèi)外制藥行業(yè)高度重視。自發(fā)現(xiàn)頭孢菌素C以來，將近半個多世紀實驗研究，使生產(chǎn)工藝不斷完善，頭孢菌素C發(fā)酵單位目前已突破 40000uml以上（均按CPC游離酸計算，以HPLC測定）。發(fā)酵罐規(guī)模均在 100m3以上。同時也篩選出不加蛋氨酸的頭孢菌素C菌種，并摸索出最佳發(fā)酵溫度、培養(yǎng)pH及攪拌轉速，以最大限度減少DCPC（脫乙酰頭孢菌素）含量。因為過多DCPC不僅會影響CPC的提取收率與質(zhì)量，而且也給以后CPC的化學裂解收率或酶法裂解收率及 7ACA純度帶來不良影響。提取方法大都采用大孔吸附劑-離子吸附樹脂-鋅鹽沉淀工藝路線所取代。一般提取總收率（自發(fā)酵液計算）約 75左右。目前多采用超濾工藝，進一步提高了濾液質(zhì)量，從而把提取總收率提高到 7880左右。目前國內(nèi)所有生產(chǎn) 7ACA廠家都已采用此項工藝路線，收率高，對后工序有利。 目前化學裂解法對環(huán)境污染大，殘污液處理費用較昂貴。自 1970 年以來，英國、日本、荷蘭等國相繼研發(fā)酶法產(chǎn)生 7ACA、7ADCA 工藝。國內(nèi)隨著對環(huán)保重視程度的提高，近幾年部分藥廠已實施了酶法 7ACA 的規(guī)?；a(chǎn)。 雖然頭孢菌素的前景廣闊，但是由于國內(nèi)外抗生素企業(yè)頭孢原料藥項目的競相上馬，頭孢產(chǎn)品已經(jīng)出現(xiàn)過熱現(xiàn)象。目前國際上有意大利、韓國、日本等頭孢原料廠商，國內(nèi)有石家莊制藥集團、福州抗生素廠、哈爾濱制藥集團、山東抗生素廠、山西威奇達、齊魯藥業(yè)等廠家，近幾年頭孢菌素原料藥已經(jīng)出現(xiàn)像青霉素一樣的世界大戰(zhàn)，提高技術指標、降低成本成為各個企業(yè)的唯一出路。 目前，頭孢菌素 C 的發(fā)酵大致劃分為兩種類型：一種是低菌濃、短周期、低單位、高質(zhì)量發(fā)酵液、高收率的發(fā)酵類型；二是高菌濃、長周期、高單位、收率相對略低的發(fā)酵類型。目前國內(nèi)廠家多采用前一種發(fā)酵類型，周期 120-140h，放罐菌濃 45-52%；而國外大多數(shù)廠家，如韓國、意大利等多采用后一種發(fā)酵類型，周期 160-170h，放罐菌濃 60-65%。1 菌種的選育1.1 菌種的選育及制備1.1.1 實驗材料 l 菌株：Cephalosporium acremonium HB-2，石藥集團河北中潤制藥提供。 l 試劑：培養(yǎng)基用試劑為市售分析純及生化試劑。蛋氨酸、蛋白胨，上海生化試劑廠。無機鹽：MgSO47H2O ， FeSO47H2O ， ZnSO47H2O ， MnSO4H2O ，l CuSO47H2O，（NH4）2SO4，KH2PO4，北京奧博星生物技術有限公司。 l 儀器設備：安捷侖 HPLC 1100s 高效液相色譜儀；雷茲 LDZ52 離心機，北京醫(yī)用離心機廠；麥克奧迪 B5 professional series 顯微鏡；SPY-50 雙層搖床，上海離心機械研究所；NDJ1 旋轉式黏度計，上海精密科學儀器有限公司。 1.1.2 培養(yǎng)基的配置 l 深冷管保護液（ml/2ml）：甘油 1.0，脫脂乳 1.0。 l 斜面、分離培養(yǎng)基（g/L）：麥芽糖 60，酵母粉 20，蛋白胨 10，瓊脂 20，l 自來水配制，pH7.07.2。 l 種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 5，蔗糖 6，玉米漿 20，谷朊粉 15，硫酸銨10，D/L蛋氨酸 5，CaCO3 5，自來水配制，pH6.26.4。 l 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 10，淀粉 30，糊精 60，玉米漿 50，谷朊粉12，-淀粉酶 0.2，MgSO47H2O1.0，F(xiàn)eSO47H2O 0.2，ZnSO47H2O 0.01 MnSO4H2O 0.01，CuSO47H2O0.02，（NH4）2SO410，KH2PO4 5，蛋氨酸 6，輕質(zhì)CaCO35，豆油 50，自來水配制，pH6.06.2。 1.1.3 菌種選育方法 1.1.3.1 自然選育 l 單菌落分離：將出發(fā)菌株采用 10 倍稀釋法稀釋，取 10-410-6倍涂平皿，每皿滴加 25 滴，用三角耙把菌液涂勻。單菌落于 28培養(yǎng) 1418 天，第三天倒置培養(yǎng)。每天觀察生長情況，待菌落生長飽滿，即可傳斜面。 l 斜面種子制備：取無菌小試管數(shù)只放在試管架上，各加 1ml 菌水。用竹鏟鏟下選好的單菌落，分別放入小試管，攪勻。用吸管吸取菌液接入試管斜面，涂布均勻。每個單菌落對應一個斜面，標明相應編號，斜面放 28培養(yǎng)間培養(yǎng)，定期觀察。長好的試管斜面加入等體積的保護液制作深冷管保藏，備用。 l 生產(chǎn)能力驗證：取試管斜面，加無菌水 5-10ml，吸取 0.5ml 菌液接種 250ml種子搖瓶（內(nèi)裝 25ml 種子培養(yǎng)基）。種子搖瓶于 28、180r/min 搖床培養(yǎng) 96h。l 吸取 4.0ml 種子液接種 500ml 發(fā)酵搖瓶（內(nèi)裝 50ml 發(fā)酵培養(yǎng)基）。發(fā)酵搖瓶于28、200r/min 搖床培養(yǎng) 48h 后移至 25恒溫室，200r/min 搖床培養(yǎng)至放瓶。放瓶檢測 pH、PCV、濾速、頭孢菌素 C 效價、雜質(zhì)含量。 選取放瓶效價較高的菌株，經(jīng)過中試發(fā)酵設備一、二級種子罐擴大培養(yǎng)后接種發(fā)酵罐，確定菌株生產(chǎn)能力。一級種子在通氣比 1：0.8、溫度 28條件下培養(yǎng) 96 小時后移種至二級種子罐，接種量 11%。二級種子罐在相同條件下培養(yǎng) 40小時移種至發(fā)酵罐，接種量 15%。發(fā)酵罐 050 小時 28、通氣比 1：1.2，51144小時 25、通氣比 1：1.5。發(fā)酵過程中補油、硫銨、氨水，并保證溶氧不小于20%、氨氮不低于 0.5g/ml。 1.1.3.2 頭孢菌素 C 抗性平皿的制備 將滅菌后的固體分離培養(yǎng)基放涼至50左右，加入頭孢菌素C溶液，使最終頭孢菌素C的濃度為5gL-1，混勻后吸取10ml加入到無菌平皿中，平皿呈15o角擺放，自然冷卻待凝固后，將平皿放平。另取一瓶滅菌后并放涼至50左右的固體分離培養(yǎng)基，取出10ml加入上述已凝固的平皿中，水平擺放，自然冷卻備用。 1.1.3.3 紫外線誘變 l 菌懸液的制備：選擇培養(yǎng)好的斜面，加入 10ml無菌水，用吸管將孢子輕輕刮下后吸出，用研磨器將菌懸液研磨，得到單細胞菌懸液。用血球計數(shù)板計算孢子數(shù)在 20-30 億個ml-1。 l 菌懸液的預培養(yǎng)：取 10ml 研磨后的菌懸液接入裝量為 25ml 的液態(tài)斜面培養(yǎng)基中預培養(yǎng) 2h。 l 紫外誘變：將預培養(yǎng)的單細胞菌懸液加入平皿中，每皿 1ml，用磁力攪拌器緩慢攪拌菌懸液，在紅外光下操作，用 30W 紫外燈管，距離 25cm，照射30sec5min。在照射受試菌前，燈管須預熱 20min。照射后平皿用黑布包嚴，防止發(fā)生可見光的修復作用。 l 培養(yǎng)：用吸管吸取誘變后的孢子懸液，稀釋 10-110-3倍涂布頭孢菌素C性平皿，用三角耙把菌液涂勻。單菌落于 28培養(yǎng) 1418 天，第二天倒置培養(yǎng)。l 篩選：每天觀察生長情況，待菌落生長飽滿，挑選高頭孢菌素C濃度區(qū)的單菌落即可傳斜面。 1.2 菌種的保藏 菌種保藏是進行微生物學研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務是使菌種不死亡，同時還要盡可能設法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉化。菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平、缺氧狀態(tài)、干燥和低溫，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。常用的菌種寶藏方法有：斜面冰箱寶藏法、沙土管寶藏法、菌絲速凍法、石蠟油封存法、真空冷凍干燥保藏法、液氮超低溫保藏法。 在這里我們采用斜面冰箱寶藏法中的甘油冷凍管保存法。甘油冷凍管保存法適用于保存?zhèn)鞔镁N，一般可保存2年。 將待保存用菌種接種至平板或瓊脂斜面，經(jīng)282448h培養(yǎng)后，用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，移至預先裝有無菌蒸餾水的試管中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于1單位麥氏比濁管。 向已制備好的菌懸液中加入等體積，濃度為20%的無菌甘油，得到10%甘油菌懸液。 輕輕振搖，使10%甘油菌懸液充分混合，分裝于無菌小試管中，在-30條件下貯存。 2 培養(yǎng)基的配制2.1 培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求培養(yǎng)基的成分大致分為碳源、氮源、無機鹽、微量元素、特殊生長因子、促進劑、前體和水等幾大類。對不同的微生物，微生物不同的生長階段，不同的發(fā)酵產(chǎn)物以及不同發(fā)酵工藝條件等，所使用的培養(yǎng)基都是不同的，這些也都是培養(yǎng)基配制需要考慮的因素。2.1.1 水 水是所有培養(yǎng)基的主要成分，也是微生物機體的重要組成成分。水是良好的溶劑，又是活細胞中一切代謝反應的媒介物，還可以維持細胞中的滲透壓，同時水又是熱的良好導體，有利于散熱，可調(diào)節(jié)細胞溫度。 2.1.2 碳源 碳源的主要為微生物細胞的生長繁殖提供能源。目前生產(chǎn)中性淀粉酶的菌種為異養(yǎng)型微生物，所以只能利用有機碳；大量的農(nóng)副產(chǎn)品是主要的有機碳源，如山芋、麩皮、玉米粉、米糠、馬鈴薯、木薯、土茯苓等淀粉質(zhì)原料，這里用到的碳源是玉米粉（淀粉含量90%）。2.1.3 氮源氮源是組成蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，酶自身即為蛋白質(zhì)。因此，氮源是必不可少的重要原料。常用的有機氮源油花生餅粉、豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。我們用到的氮源是瓊脂，谷朊粉（含蛋白質(zhì)86%）和蛋白胨。常用的無機氮源有銨鹽、硝酸鹽和氨水等。2.1.4 無機鹽類及微量元素酶在生長和繁殖生長過程中，需要某些無機鹽及微量元素如磷、鎂、硫、鉀、鈉、鈣、鐵、錳、鋅等。鈉離子具有控制細胞和培養(yǎng)基之間的滲透壓的作用，從而促進產(chǎn)酶，添加適量亞硝酸鈉可提高酶活力；鈣對淀粉酶有穩(wěn)定和活化作用。2.1.5 生長因子和產(chǎn)酶促進劑酶的生產(chǎn)中所需的生長因子大多由天然原料提供。玉米漿、麥芽汁、豆芽汁等，都含有豐富的生長因子。產(chǎn)酶促進劑一般是該酶的底物和底物類似物。2.2培養(yǎng)基的種類 培養(yǎng)基的種類很多，可以根據(jù)組成、狀態(tài)和用途等進行分類，按照用途可以分成孢子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。微生物大規(guī)模發(fā)酵設計主要用到孢子,種子和發(fā)酵培養(yǎng)基這三種類型。2.2.1 孢子培養(yǎng)基 孢子培養(yǎng)基配制的目的是供菌體繁殖孢子的，常采用的是固體培養(yǎng)基，對這類培養(yǎng)基的要求是能使菌體生長快速，產(chǎn)生數(shù)量多而優(yōu)質(zhì)的孢子，并且不會引起菌體變異。對孢子培養(yǎng)基的要求：營養(yǎng)不要太豐富；所用無機鹽的濃度要適量；注意培養(yǎng)基的pH和濕度。 斜面、分離培養(yǎng)基（g/L）：麥芽糖 60，酵母粉 20，蛋白胨 10，瓊脂 20，自來水配制，pH7.07.2。2.2.2 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體長得粗壯成為活力強的種子。對于種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也比較高些，濃度以稀薄為好，可以達到較高的溶解氧，供大量菌體生長和繁殖。 頭孢菌素c的種子培養(yǎng)基的配比為（g/L）：玉米粉90，谷朊粉 22，硫酸銨 10，輕質(zhì)CaCO 5，-淀粉酶 1。培養(yǎng)基配后 pH 為 6.46.6。2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基的要求是營養(yǎng)要適當豐富和完全適合于菌種的生理特性和要求，使菌種迅速生長、健壯，能在比較短的周期內(nèi)充分發(fā)揮產(chǎn)生菌合成發(fā)酵產(chǎn)物的能力，但要注意成本和能耗。頭孢菌素c的發(fā)酵培養(yǎng)基配比為（g/L）：玉米粉100，谷朊粉 90，-淀粉酶 1，MgSO 7H O 3，KH PO 5，（NH ）SO4 30，微量元素10，輕質(zhì)CaCO3 5。其中微量元素：ZnSO 7H O 0.01，MnSO4 .H2O 0.01, CuSO47H 2O 0.02，F(xiàn)eSO 47H 2O 0.2。培養(yǎng)基配后 pH 為 6.46.6。2.3 培養(yǎng)基的滅菌生物化學反應過程中，特別是細胞培養(yǎng)過程，往往要求在沒有雜菌污染的情況下進行，這是由于生物反應系統(tǒng)中通常含有比較豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，因而很容易受到雜菌污染，進而產(chǎn)生各種不良后果：l 由于雜菌的污染，使生物化學反應的基質(zhì)或產(chǎn)物消耗，造成產(chǎn)率下降；l 由于雜菌所產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物，或染菌后發(fā)酵液的某些理化性質(zhì)的改變，使產(chǎn)物的提取變得困難，造成收得率降低或使產(chǎn)品質(zhì)量下降；l 污染的雜菌可能會分解產(chǎn)物而使生產(chǎn)失??；l 污染的雜菌大量繁殖，會改變反應介質(zhì)的pH，從而使生物化學反應發(fā)生異常變化；l 發(fā)生噬菌體污染，微生物細胞被破裂而使生產(chǎn)失敗等。2.3.1 滅菌方法所謂滅菌，就是指用物理或化學方法殺滅或去除物料或設備中一切有生命物質(zhì)的過程。常用的滅菌方法有：化學滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌和過濾滅菌等。本實驗采用濕熱滅菌。2.3.2 培養(yǎng)基的濕熱滅菌濕熱滅菌即利用飽和水蒸氣進行滅菌，是工業(yè)中最重要的滅菌方法。在同樣的溫度下，溫熱的殺菌效果比干熱好，其原因有：蛋白質(zhì)凝固所需的溫度與其含水量有關，含水量愈大，發(fā)生凝固所需的溫度愈低。濕熱滅菌中菌體蛋白質(zhì)吸收水分，較同一溫度的干熱空氣中易于凝固而殺滅各種微生物。溫熱滅菌過程中蒸氣放出大量潛熱，加速提高溫度。因而濕熱滅菌比干熱所要溫度低。如在同一溫度下，則濕熱滅菌所需時間比干熱短。濕熱的穿透力比干熱大，使深部也能達到滅菌溫度，故濕熱比干熱收效好。 影響滅菌效果的因素微生物的種類和數(shù)量；培養(yǎng)基性質(zhì)、濃度、成分；滅菌的溫度、時間。 熱阻：微生物對熱的阻抗能力。 滅菌原理：對數(shù)殘留定律，經(jīng)加工滅菌，死亡微生物速度和存在的微生物數(shù)量成正比。v 本次條件為在121（表壓約0.1MPa）維持30分鐘。2.4 空氣滅菌 此課題為好氧發(fā)酵，以空氣作為氧源。根據(jù)國家藥品質(zhì)量管理規(guī)范的要求，生物制品、藥品的生產(chǎn)場地業(yè)需要符合空氣潔凈度的要求。獲得無菌空氣的方法有：輻射滅菌、化學滅菌、加熱滅菌、靜電除菌、過濾介質(zhì)除菌等。過濾介質(zhì)除菌是目前發(fā)酵工業(yè)中空氣除菌的主要手段，其介質(zhì)有棉花過濾器、超細玻璃纖維紙、石棉濾板、金屬燒結管等。2.4.1 過濾除菌流程及設備 流程如下：采風塔空氣粗過濾器空氣壓縮機儲氣罐冷卻器旋風分離器冷卻器絲網(wǎng)除沫器空氣加熱器總空氣過濾器。設備如下： 采風塔：采風塔建在工廠的上風頭，高至少10 m,氣流速度8 m/s。 粗過濾器：主要作用是攔截空氣中較大的灰塵以保護空氣壓縮機，同時起一定的除菌作用，減輕總過濾器的負擔。 空氣壓縮機：作用是提供動力，以克服隨后各設備的阻力。 空氣儲罐：作用是消除壓縮空氣的脈動。 要求：H/B=22.5 V=（0.10.2）V1 其中，H為罐高；B為罐直徑；V1為空壓機每分鐘排氣量（20，1105Pa狀況下）。 旋風分離器：是利用離心力進行氣-固或氣-液沉降分離的設備。作用是分離空氣中被冷卻成霧狀的較大的水霧和油霧粒子。 冷卻器：空壓機出口溫度氣溫在120左右，必須冷卻。另外在潮濕的地域和季節(jié)還可以達到降濕的目的。 絲網(wǎng)除沫器：可以除去空氣中絕大多數(shù)的20m 以上的液滴和1m以上的霧滴，一般采用規(guī)格為直徑0.2540孔且高度為150的不銹鋼絲網(wǎng)。 空氣加熱器：列管內(nèi)走空氣，管外走蒸汽?？蓪⒖諝鉂穸扔?00%降低到70%以下。 總過濾器：填充物按下面順序安裝：孔板鐵絲網(wǎng)麻布活性炭麻布棉花麻布鐵絲網(wǎng)孔板。介質(zhì)要緊密均勻，壓緊一致，上下棉花層厚度為總過濾層厚度的1/4，中間活性炭層為1/3。2.4.2 無菌空氣的檢查現(xiàn)在采用的無菌檢查實驗方法有肉湯培養(yǎng)法、斜面培養(yǎng)法和雙碟培養(yǎng)法。這里采用斜面培養(yǎng)法來檢查。具體方法如下：500ml三角瓶內(nèi)裝斜面培養(yǎng)基50m1，其組成為麥芽糖 60，酵母粉 20，蛋白胨 10，瓊脂 20，自來水配制，pH7.07.2，接種后置旋轉式搖床，(25-28)下培養(yǎng)48h左右備用。斜面、分離培養(yǎng)基（g/L）：麥芽糖 60，酵母粉 20，蛋白胨 10，瓊脂 20，自來水配制，pH7.07.2。2.5 發(fā)酵罐的滅菌發(fā)酵罐的滅菌可采用空罐滅菌和實罐滅菌，此處采用空罐滅菌?？展逌缇菍⑺械耐饪诙忌晕⒋蜷_，然后通入熱水蒸汽，讓水蒸汽盡量通過每一個菌落達到滅菌效果。具體方法是：在121滅菌30分鐘。3 種子擴大培養(yǎng)本發(fā)酵屬于二級種子罐擴大培養(yǎng)，三級發(fā)酵。設計流程如下：孢子錐形瓶種子罐種子罐發(fā)酵罐3.1 種子制備 工業(yè)生產(chǎn)采用斜面孢子懸浮液或接種菌絲接入46立方米的一級種子罐，（玉米粉90，谷朊粉 22，硫酸銨 10，輕質(zhì)CaCO3 5，-淀粉酶 1。培養(yǎng)基配后 pH 為 6.46.6。）28培養(yǎng)約需7296h，移入11立方米的二級種子罐，28培養(yǎng)約 3540h。此時菌種進入對數(shù)生長期菌絲代謝比較旺盛，以雙種法轉入發(fā)酵罐，控制在 2528。3.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基配比為（g/L）：玉米粉100，谷朊粉 90，-淀粉酶 1，MgSO47H2O 3，KH2PO 5，（NH4）2SO4 30，微量元素10，輕質(zhì)CaCO3 5。其中微量元素：ZnSO47H2O 0.01，MnSO4 .H2O 0.01, CuSO47H 2O 0.02，F(xiàn)eSO47H2O 0.2。培養(yǎng)基配后 pH 為 6.46.6。 發(fā)酵罐培養(yǎng)基經(jīng)消毒滅菌冷卻后接入21%種子培養(yǎng)成熟液。培養(yǎng)條件為：罐壓0.5kgcm2，發(fā)酵罐通風量為1：1.5vvm ，培養(yǎng)時間為48h，發(fā)酵溫度 48h 前 28控制，48h后采用 25控制。4 發(fā)酵罐的設計 4.1發(fā)酵罐的結構通用發(fā)酵罐的主要組成部件有：l 罐體：是發(fā)酵罐的主要結構，其內(nèi)壁有擋板，作用是防止液內(nèi)中心產(chǎn)生漩渦，一般用35塊擋板。l 攪拌裝置：主要功能是使罐內(nèi)物料混合均勻，攪拌器葉輪多采用攪拌渦輪式，攪拌軸要與罐體密封嚴實，防止漏液和染菌。攪拌轉速為210r/min.l 傳熱裝置：有夾套，列管等，這里采用外夾套。l 通氣部分：通過空氣分布器將通入的無菌空氣均勻分布到發(fā)酵液中，發(fā)酵罐通風量為1：1.5vvm 。分布器有單管式和環(huán)形管式。l 消泡裝置：用于消除產(chǎn)生的泡沫，最簡單實用的消泡裝置是耙式消泡器，直接裝在攪拌軸上。l 進出料口：罐頂設有進料口，罐底有出料口。其他附屬設備還包括試鏡、人孔（手孔）、取樣管等，用以觀測和檢修。4.2發(fā)酵罐的工藝尺寸 常用的機械通風發(fā)酵罐的結構和主要幾何尺寸標準化設計（見下圖） 其幾何尺寸比例如下： H0/D=1.73.5 H/D=25 d/D=1/31/2 W/D=1/121/8 B/D=0.81.0 (S/d)2=12 (2表示攪拌器擋數(shù)) h/D=1/4 單位全部為m 發(fā)酵罐大小用公稱體積表示，V0=D2H/4+0.13D3 其中：H0-發(fā)酵罐圓柱形筒身高度 D-發(fā)酵罐內(nèi)徑 H-罐頂?shù)焦薜椎母叨?d-攪拌器直徑 W-擋板寬度 h-底封頭或頂封頭高度 計算： 已知年產(chǎn)量為300噸，頭孢菌素c產(chǎn)量為25.683g/L,一年有260個工作日，發(fā)酵周期為96小時，即4天，清理發(fā)酵罐1天，裝料系數(shù)為0.8，預處理收率90%，提取率為85%，發(fā)酵罐個數(shù)為2個，V0是公稱容積，指筒身容積與底封頭容積之和，則：一年需放罐的次數(shù)：2605=52次每批次產(chǎn)酸性蛋白酶：300000/52=5770kg假設用一臺發(fā)酵罐，則發(fā)酵罐的體積：V=5770/90%/85%/0.8/25.683=367 m3設定使用倆臺發(fā)酵罐，每個發(fā)酵罐體積為：V0=200 m3由: V0=D2H/4+0.15D3=D3/2+0.13 D3=200m3得：D=4.3 m那么：H0=2.5D=2.54.3=10.75 m H=3D=34.3=12.9 m d=D/2=0.54.3=2.15 m W=D/12=4.3/12=0.36 m B=0.9D=0.94.3=3.87 m S=2D=24.3=8.6 m h=D/4=4.3/4=1.08 m 液面高度HL=0.8(H+h)=0.8(12.9+1.08)=11.24 m 封頭內(nèi)表面積F=22.5162，容積V=2.24173m3人孔取f800mm，視鏡D視200mm，選取Ds=4500mm的支腿式支座，并根據(jù)工廠實際情況做適當?shù)母淖儭?4.3封頭壁厚 2=pDy/(2) +C 式中：p耐受壓強（取0.25MPa） y開孔系數(shù)，取2.3 焊縫系數(shù)，雙面焊取0.8，無縫焊取1.0 設計溫度下的許用應力（不銹鋼焊接壓力容器許用應力為 150,137 MPa） C腐蝕裕度，當 - C10mm時，C=3mm解得封頭壁厚 2=pDy/(2)+C=0.2543002.3/（21370.8）+3=14.3 mm 取整為2=15mm 4.4物料衡算本系統(tǒng)采用2個發(fā)酵罐，每個為200 m3，頭孢菌素C產(chǎn)量為25.683g/L,一年有260個工作日，發(fā)酵周期為96小時，即4天，清理發(fā)酵罐1天，裝料系數(shù)為0.8，預處理收率90%，提取率為85%，則： 每個發(fā)酵罐在一個發(fā)酵周期頭孢菌素C產(chǎn)量為： 2000.80.850.925.683=3143.6（kg） 那么2個發(fā)酵罐1年的總產(chǎn)量為： （3143.6260/5）2 = 326934.3（kg）= 327噸 故符合年產(chǎn)量為300噸的生產(chǎn)要求。計算每一批次所需培養(yǎng)基成分的質(zhì)量：玉米粉：100200=20000（kg）=20噸谷朊粉：90200=18000（kg）=18噸-淀粉酶 ：1200=200（kg）MgSO47H2O：3200=600（kg）KH2PO4：5200=1000（kg）(NH4)2SO4：30200=6000（kg）輕質(zhì)CaCO3：5200=1000（kg）其中微量元素(kg)：ZnSO47H 2O 2 （kg）MnSO4 .H2O 2（kg）CuSO47H 2O 4（kg）FeSO47H 2O 40（kg）5 發(fā)酵過程的工藝控制5.1 發(fā)酵過程的補料策略中間補料是在發(fā)酵過程中補充某些營養(yǎng)物料、水或產(chǎn)酶促進劑，以滿足微生物的代謝活動和產(chǎn)酶的需要。為了發(fā)酵時間，提高了酶活力和單罐產(chǎn)量。在發(fā)酵罐上增加了一路補水流加器，依據(jù)各季節(jié)的蒸發(fā)量以及空氣濕度的大小，在運轉過程中進行補水，保持裝料系數(shù)的穩(wěn)定，用3倍年度濃度碳源的培養(yǎng)基補料，體積相當基礎料的1/2，從培養(yǎng)12h開始，每三小時1次，分28余次補加完畢。5.2 發(fā)酵過程pH值的控制各種微生物需要在一定的pH環(huán)境中方能正常生長繁殖。培養(yǎng)基中C/N比值高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH偏低；C/N比值低，發(fā)酵液傾向于中性或堿性，pH偏高。頭孢菌最適 pH為6.46.6。因此，在發(fā)酵過程中，可通過添加適量的尿素或碳酸鈣等來調(diào)節(jié)pH上升或下降。5.3 發(fā)酵過程溫度的控制溫度對微生物的生長、產(chǎn)物的合成和代謝調(diào)節(jié)有重要作用。溫度變化一方面影響各種酶反應的速率和蛋白的性質(zhì)，另一方面影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。不同的菌種有著不同的最適溫度。頭孢菌的發(fā)酵溫度控制在2528最適宜。5.4溶氧的控制頭孢菌發(fā)酵是需氧發(fā)酵，無論是基質(zhì)的氧化，菌體的生長還是產(chǎn)物的合成均需大量的氧氣。若發(fā)酵液中氧氣不足，可通過加大通氣量，適當降低溫度，提高罐壓，補水，提高攪拌速度來控制。頭孢菌發(fā)酵過程中，通氣量為發(fā)酵罐通風量為1：1.5vvm 攪拌轉速210r/min。 罐壓0.5kg/cm2。5.5 染菌的控制在工業(yè)發(fā)酵中，染菌輕則影響產(chǎn)品的質(zhì)和量、重則倒罐或停產(chǎn)、影響工廠效益。因此要嚴格無菌操作，種子滅菌要徹底，凈化空氣設備，操作要慎重，設備滅菌要徹底。若在前期染菌，應重新滅菌；中期染菌，應偏離雜菌生長條件；后期染菌，可提前或及時放罐?？赡艹霈F(xiàn)的異常發(fā)酵現(xiàn)象：l 培養(yǎng)基變?。嚎赡苁鞘删w污染或營養(yǎng)成分缺乏；l 培養(yǎng)基過濃：會抑制微生物的生長，考慮可能是污水污染；l 耗糖較慢：可能原因是種子生長能力降低，檢測種子是否衰退，發(fā)酵條件是否合適，以及營養(yǎng)成分是否全面，尤其注意缺磷；l pH值不正常： 用緩沖對來調(diào)節(jié)，檢查是否染雜菌，碳氮比是否合適；l 生長緩慢：最可能的原因就是營養(yǎng)成分不足。6 下游加工下游加工過程是生物工程的一個組成部分，是生物化工產(chǎn)品通過微生物發(fā)酵過程、酶反應過程或動植物細胞大量培養(yǎng)獲得，以上述發(fā)酵、反應液或培養(yǎng)液分離、精制有關產(chǎn)品的過程。下游加工過程的一般工藝流程為：固體細胞破碎分離發(fā)酵液預處理固液分離液體初步純化高度純化成品加工6.1 發(fā)酵液的過濾和預處理預處理就是除去高價離子和蛋白質(zhì)，對高價離子的去除可以采用草酸或磷酸，草酸它與鈣離子生成的草酸鈣，還能促使蛋白質(zhì)沉淀，加磷酸既能降低鈣離子也能降低鎂離子。對于蛋白質(zhì)的沉淀可以加入絮凝劑，調(diào)節(jié)pH值或加熱。過濾：采用鼓式真空過濾器，過濾前加去乳化劑并降溫。6.2 提取 頭孢菌素C常用的提取方法有：發(fā)酵液酸化后過膜分離，經(jīng)過兩次樹脂吸附解吸后得到頭孢菌素 C 解吸液，加入醋酸鋅進行結晶并經(jīng)過濾、洗滌、干燥得到頭孢菌素 C 鋅鹽成品。目前，生產(chǎn)頭孢菌素 C 是以頭孢菌素 C 的絡鹽鋅鹽、鈉鹽或鉀鹽為終端產(chǎn)物。7 總結和討論通過本次課程設計,大量翻閱有關資料，進一步掌握了發(fā)酵工程課程的基本知識，掌握了發(fā)酵工藝設計要點及其相關工程設計要點，鍛煉了自己初步的發(fā)酵工程工藝及設備的獨立設計能力；培養(yǎng)了綜合運用所學的理論知識獨立分析和解決發(fā)酵工程實際問題的實踐能力。