蛋白樣本制備與 western blot課件

蛋白樣本制備與WesternBlot CompanyLogo 主要內(nèi)容 CompanyLogo 一蛋白樣本制備 成功蛋白分析的基礎(chǔ) 蛋白樣本 immunoblotting massspectrometry 蛋白樣本制備的目的 后續(xù)應(yīng)用 CompanyLogo 二蛋白樣本制備的原則 蛋白樣本制備原則 方法應(yīng)具備標準化 具有重現(xiàn)性 可靠性 簡便性 盡量抽提完全 應(yīng)使所有蛋白全部處于溶解狀態(tài) 防止發(fā)生蛋白的降解 聚集 沉淀 變性 防止在抽提過程中發(fā)生化學(xué)修飾 如做2D則需去除高豐度蛋白或無關(guān)蛋白 必要時去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白 CompanyLogo 二蛋白樣本制備的策略 制備蛋白的目的活性分析免疫印跡雜交免疫沉淀或共沉淀1D2DEMSACHIP等 實驗材料細胞組織固定組織或石蠟包埋組織微生物酵母植物提取RNA后的剩余的蛋白樣本等 目的蛋白的結(jié)性質(zhì)與分布分布于胞槳 胞核 膜可溶 不可溶含量多少分子量大小四級結(jié)構(gòu)特征磷酸化等修飾 方法的選擇1自行配制抽提試劑 根據(jù)文獻方法或經(jīng)驗提取2購買商品化試劑盒 按其說明書的方法提取 CompanyLogo 三案例分析 細胞中總蛋白的制備 CompanyLogo 細胞裂解液 RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點 CompanyLogo 細胞裂解液 RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點 CompanyLogo 細胞裂解液 RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點 CompanyLogo 各類表面活性劑特點 1陰離子型 SDS脫氧膽酸鹽2陽離子型 CPB和CTAB3雙性離子型 CHAPSZwittergent系列4非離子型 Brij系列Triton 100NonidetP40Tween系列等 CompanyLogo 選用表面活性劑考慮的因素 參考文獻報告保持生物活性時使用的表面活性劑 選用表面活性劑考慮的因素 工作條件下表面活性劑的溶解性 使用分子生物學(xué)級的表面活性劑 無核酸酶蛋白酶等 根據(jù)樣本下游的應(yīng)用來選擇表面活性劑的種類 考慮表面活性劑的去除方法 表面活性劑的純度影響提取蛋白的質(zhì)量 保護蛋白活性時 不僅考慮表面活性劑的種類還有濃度 盡量使用毒性較低的表面活性劑 因不明原因某些蛋白適用專門的表面活性劑進行分離 使用非表面活性劑NDSB結(jié)合表面活性劑來增加膜蛋白溶解性 有時比較難僅一種表面活性劑既能溶解蛋白又適用于蛋白分析 常先用一種表面活性劑將蛋白溶解 而另一種表面活性劑取代進行蛋白的后續(xù)分析 CompanyLogo 去除未結(jié)合的表面活性劑 根椐表面活性劑的疏水性 CMC 凝聚數(shù)目 和電荷等性質(zhì)來去除 CompanyLogo 細胞裂解液 RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點 CompanyLogo 蛋白酶抑制劑及其雞尾酒 CompanyLogo 細胞裂解液 RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點 CompanyLogo 磷酸酶抑制劑選擇 磷酸酶主要包括非特異性的磷酸酶 例如 堿性磷酸酶 酸性磷酸酶 特異性的絲氨酸 蘇氨酸磷酸酶 例如 PP1 PP2A PP2B 酪氨酸蛋白磷酸酶 例如 PTP 常規(guī)的抑制劑主要包括 CompanyLogo 細胞裂解液 RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點 CompanyLogo 細胞裂解液 RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點 CompanyLogo 全蛋白抽提時注意事項 CompanyLogo 細胞裂解液 RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點 CompanyLogo 四蛋白樣本制備產(chǎn)品選擇指南 CompanyLogo 核蛋白樣本制備 抽提原理低滲裂解細胞膜 釋放出胞漿蛋白與胞核 離心分離出胞核 高滲破裂胞核 釋放出可溶性核蛋白 加核酸酶降解DNA 釋放出DNA結(jié)合蛋白 組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子 實驗注意事項試劑和器皿冰上預(yù)冷裂解液的用量細胞總量抑制蛋白酶蛋白酶抑制劑 CompanyLogo 膜蛋白樣本制備 CompanyLogo 膜蛋白的抽提 方法及原理方法多直接抽提法分級抽提法1 先機械法等非表面活性劑方法裂解細胞 再用表面活性劑抽提2 按溶解性分級抽提3 按亞細胞分級抽提產(chǎn)物細胞膜蛋白細胞器質(zhì)膜蛋白注意事項根椐膜蛋白種類和后續(xù)研究目的的不同 選擇不同的產(chǎn)品或表面活性劑變性劑等 抑制蛋白酶 樣本量 CompanyLogo 膜蛋白的直接提取 CompanyLogo 蛋白的分級提取 按蛋白溶解度不同進行分級抽提 降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)第一步 用非表面活性劑溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白 第二步 把未溶解的pellet用裂解液溶解 提取高疏水性蛋白 膜蛋白 第三步 用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液 最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11 W W CompanyLogo 亞細胞分級抽提 用超離心技術(shù)分離出細胞器 質(zhì)膜和細胞核等成分 再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進行溶解 其優(yōu)點是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性 而且可對分離的蛋白質(zhì)進行亞細胞定位 但該法需要專業(yè)儀器 有時會出現(xiàn)假陽性 根椐胞漿 胞膜 胞核 骨架蛋白的亞細胞策略用不同提取液逐級溶解 CompanyLogo 四種亞細胞組分分離提取的結(jié)果 CompanyLogo 線粒體蛋白樣本制備 首先用密度梯度離心方法分別分離出線粒體 胞質(zhì) 胞核 再用線粒體抽提Buffer溶解線粒體蛋白 CompanyLogo 其它蛋白抽提產(chǎn)品 高豐度蛋白去除試劑盒信號蛋白提取試劑盒糖蛋白提取試劑盒細菌蛋白提取試劑盒酵母蛋白提取試劑盒植物蛋白提取試劑盒 CompanyLogo 五蛋白定量產(chǎn)品選擇指南 CompanyLogo BCA法蛋白定量 BCA bicinchoninicacid 是理想的蛋白質(zhì)定量方法 該方法因快速靈敏 穩(wěn)定可靠 對不同種類蛋白質(zhì)檢測的變異系數(shù)非常小而倍備受專業(yè)人士的青睞 該方法的原理是 在堿性條件下 蛋白將Cu2 還原為Cu Cu 與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物 測定其在562nm處的吸收值 并與標準曲線對比 即可計算待測蛋白的濃度 BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響 在組織細胞裂解實驗中 低濃度的去垢劑SDS TritonX 100 Tween不影響檢測結(jié)果 但螯合劑 EDTA EGTA 還原劑 DTT 巰基乙醇 和脂類會對檢測結(jié)果有一定影響 實驗中 若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高 可試用Bradford法測定蛋白濃度 CompanyLogo Bradford法蛋白定量 考馬斯亮蘭G 250染料 在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合 使染料的最大吸收峰的位置 lmax 由465nm變?yōu)?95nm 溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色 經(jīng)研究認為 染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 特別是精氨酸 和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合 測定快速 簡便 只需加一種試劑 完成一個樣品的測定 只需要5分鐘左右 由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程 大約只要2分鐘即可完成 其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定 且在5分鐘至20分鐘之間 顏色的穩(wěn)定性最好 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差 去污劑 TritonX 100 十二烷基硫酸鈉 SDS 干擾此法的測定 CompanyLogo Lowery法蛋白定量 Lowry法蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一 過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法 在堿性條件下 蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物 Folin 酚試劑中的磷鉬酸鹽 磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原 產(chǎn)生深蘭色 鉬蘭和鎢蘭的混合物 在一定的條件下 蘭色深度與蛋白的量成正比 這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高 缺點是費時間較長 要精確控制操作時間 標準曲線也不是嚴格的直線形式 且專一性較差 干擾物質(zhì)較多 CompanyLogo 六成功的WesternBlot Diagram 通過電泳區(qū)分不同的組分 并轉(zhuǎn)移至固相支持物 通過特異性試劑 抗體 作為探針 對靶物質(zhì)進行檢測 蛋白質(zhì)的Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點 可檢測到低至1 5ng 最低可到10 100pg 中等大小的靶蛋白 原理 CompanyLogo 六成功的WesternBlot CompanyLogo 蛋白變性 Tris cl PH6 8 SDSGlycerolBromphend blue 巰基乙醇DTT 高溫變性 形成蛋白質(zhì) SDS膠束 加入Samplebuffer 沸水浴5min CompanyLogo SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 產(chǎn)物 三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠 Tris Cl 四甲基乙二胺 TEMED 丙烯酰胺 Acr 過硫酸胺或核黃素 AP 甲叉雙丙烯酰胺 Bis CompanyLogo SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳緩沖液 PH8 3Tris 甘氨酸 SDS系統(tǒng) CompanyLogo SDS 聚丙烯酰胺凝膠最佳分離范圍 不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度 CompanyLogo 聚丙烯酰胺分離膠配方 CompanyLogo SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 灌制分離膠隔絕空氣 灌好后一般室溫放置30 40分鐘 CompanyLogo SDS 聚丙烯酰胺凝膠濃縮膠配方 CompanyLogo SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 灌制積層膠插入梳子 CompanyLogo SDS PAGE膠制備注意事項 過硫酸銨一般現(xiàn)配現(xiàn)用 如連續(xù)實驗可在4度放置2 3天 配制30 丙烯酰胺儲存液要過濾 配制過程中每加入一種試劑要充分混勻 防止膠出現(xiàn)濃度不均的情況 要根據(jù)溫度調(diào)整TEMED的使用量 水封的時候水要慢慢加入 太快會導(dǎo)致膠面不平 插梳子的時候要用力均勻 一次成型 在上樣前可20V恒壓預(yù)電泳20分鐘 可去除泳道中的雜質(zhì) CompanyLogo 上樣及電泳 提前將樣品沸水浴5分鐘 12000 14000rpm離心5分鐘 根據(jù)自己的設(shè)計上樣 80V恒壓跑濃縮膠 看溴酚藍壓縮成一條線后把電壓調(diào)為100V 當(dāng)溴酚藍跑至離膠的下面還有0 4 0 6mm時停止電泳 CompanyLogo 轉(zhuǎn)膜 蛋白質(zhì)帶負電荷 凝膠在負極一側(cè) 膜在正極一側(cè) 接通電源以后 蛋白質(zhì)由負極向正極轉(zhuǎn)移至膜上 CompanyLogo 轉(zhuǎn)膜 CompanyLogo 轉(zhuǎn)膜注意事項 PVDF膜要預(yù)先用甲醇活化 NC膜要預(yù)先泡水 除去中間的氣泡 然后在轉(zhuǎn)膜也中平衡20分鐘 膜 膠 濾紙夾好后要將中間的氣泡全部趕出來 否則有氣泡的地方就會斷路 蛋白無法轉(zhuǎn)到膜上 轉(zhuǎn)膜要在冰浴中進行 防止散熱量太大導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜溫度過高 根據(jù)蛋白分子量大小選擇適合的轉(zhuǎn)膜條件 CompanyLogo 膜的封閉 為避免膜與作為檢測試劑的特異性第一抗體發(fā)生非特異性結(jié)合 使非特異性背景提高 需對膜上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理 一般用5 的脫脂奶粉或者3 的BSA室溫或37度封閉2小時 CompanyLogo 轉(zhuǎn)好蛋白的膜 Protein Protein CompanyLogo 封閉 Protein Protein BlockingAgent BlockingAgent BlockingAgent CompanyLogo 一抗孵育 Protein Protein BlockingAgent BlockingAgent BlockingAgent PrimaryAntibody CompanyLogo 二抗孵育 Protein Protein BlockingAgent BlockingAgent BlockingAgent E E PrimaryAntibody SecondaryAntibody CompanyLogo 顯影 Protein Protein BlockingAgent BlockingAgent BlockingAgent E E PrimaryAntibody SecondaryAntibody Enzyme E s s s s s P P P P Substrate CompanyLogo 顯色方法 HRP酶促底物直接顯色 CompanyLogo 顯色方法 化學(xué)發(fā)光 CompanyLogo 成功的要素 質(zhì)優(yōu)量足的蛋白樣本科學(xué)的對照正確的抗體選擇保存和使用細致的實驗操作步步監(jiān)測 CompanyLogo 科學(xué)的對照 蛋白Marker 預(yù)染或非預(yù)染各種分子量的蛋白 用于標示電泳中蛋白的大小和示蹤陽性對照 目的蛋白或明確表達目的蛋白的組織或細胞的蛋白提取物 用于檢驗整個實驗體系和過程的正確性有效性 特別是一抗的質(zhì)量和效率陰性對照 非目的蛋白或明確不表達目的蛋白組織或細胞的蛋白提取物 用于檢驗抗體的特異性二抗對照 不加一抗 用于檢驗二抗的特異性內(nèi)參對照 管家基因編碼的 很多組織和細胞中都穩(wěn)定表達的蛋白 用于檢測整個WB實驗過程及體系是否正常工作 并作為半定量檢測目的蛋白表達量的標準對照空白對照 不加一抗和二抗 用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果 CompanyLogo 蛋白Marker CompanyLogo WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù) antibody AC 15 ab6276 at1 5000dilution Lysates proteinsat20ugperlaneLane1 HeLanuclearLane2 HeLawholecelllysateLane3 A431celllysateLane4 JurkatcelllysateLane5 HEK293celllysate CompanyLogo 正確的抗體選擇保存和使用 一抗的選擇 1 樣本的種屬2 適用于WB實驗方法3 單克隆抗體經(jīng)親和純化的多克