菌種鑒定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程.doc

精品文檔菌種鑒定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程目的：建立菌種鑒定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程范圍：適用于*鑒定標(biāo)準(zhǔn)操作職責(zé)： 內(nèi)容：1整體操作步驟1.1純化、分離待鑒定菌 用接種環(huán)挑取待鑒定菌落或少許含菌溶液到相應(yīng)的培養(yǎng)基上（如TSA），劃線分離，以出現(xiàn)微生物單菌落為止。1.2挑取純化后的單菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，以確定待鑒定菌的革蘭屬性。1.3如鏡檢結(jié)果為革蘭陰性桿菌，則先進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。如發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，則選用API20NE試劑條進(jìn)行鑒定；如發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，則在經(jīng)過細(xì)胞色素氧化酶實(shí)驗(yàn)后選用API20E試劑條進(jìn)行鑒定。1.4如鏡檢結(jié)果為革蘭陽性球菌，則先進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。如實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性則選用API Strep試劑條進(jìn)行鑒定，如實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性則選用API Staph試劑條進(jìn)行鑒定。1.5假如鏡檢結(jié)果為革蘭陽性桿菌并且有內(nèi)生芽胞，則選用API 50CHB試劑條進(jìn)行鑒定；否則，根據(jù)運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用API Coryne或其他試劑條進(jìn)行鑒定。1.6選定正確的試劑條以后，根據(jù)不同的API試劑條的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程準(zhǔn)備接種物，進(jìn)行接種、培養(yǎng)等操作并將結(jié)果形成數(shù)碼，用API鑒定軟件鑒定或查詢待檢菌的名稱均可。鑒定結(jié)果應(yīng)記錄，必要時(shí)，給出相應(yīng)解釋。2革蘭氏染色2.1染色劑的配制2.1.1結(jié)晶紫染色液：甲液：結(jié)晶紫 1.0g95%的酒精 20ml乙液：草酸銨 0.8g水 80ml將甲液和乙液混合均勻，靜置48h使用，置密閉棕色瓶中儲(chǔ)存。2.1.2碘液：碘 1.0g碘化鉀 2.0g水 300ml配制時(shí)先用35ml水將碘化鉀溶解，再加入碘，用力搖勻，使之全部溶解后，再加水稀釋至300ml，搖勻，分裝在棕色瓶中儲(chǔ)存。2.1.3稀石碳酸紅溶液:堿性品紅 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇 10.0ml配制時(shí)用乙醇溶解堿性品紅，然后加入石碳酸溶液，使用時(shí)加水稀釋至100ml，搖勻。2.2操作:2.2.1涂片：用接種環(huán)挑取液體培養(yǎng)物中菌體在載玻片上涂成薄層，固體培養(yǎng)物則先在載玻片上滴一滴蒸餾水或生理鹽水，用接種環(huán)挑取少量菌體在載玻片上涂成薄層。2.2.2干燥固定：涂片自然干燥或在酒精燈火焰上方微熱烘干，并在火焰上通過23次，以固定涂片。2.2.3染色：在已固定的標(biāo)本上滴加結(jié)晶紫溶液數(shù)滴，使染色液覆蓋整個(gè)涂片標(biāo)本，染色1分鐘。2.2.4水洗：斜置玻片使很細(xì)水流的純化水從染色標(biāo)本的上端流下，勿使水流直接沖刷涂片處，直至洗下的水呈無色為止。2.2.5滴加碘液沖去殘水并媒染約1分鐘，用純化水沖去碘液吸干。2.2.6滴加95%的乙醇脫色約2030秒，脫色時(shí)應(yīng)將玻片微振動(dòng)，使酒精分布均勻，立即用水沖凈。2.2.7稀石碳酸紅溶液染色1分鐘后，用水洗凈晾干或吸干。2.2.8鏡檢：先用低倍鏡觀察，找到適合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用100倍物鏡觀察細(xì)菌革蘭氏屬性。革蘭氏陽性菌染色成藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色，同時(shí)做陽性對(duì)照。3簡單染色3.1用于真菌與細(xì)菌的鑒別。3.2操作:3.2.1 涂片：用接種環(huán)挑取液體培養(yǎng)物中菌體在載玻片上涂成薄層，固體培養(yǎng)物則先在載玻片上滴一滴蒸餾水或生理鹽水，用接種環(huán)挑取少量菌體在載玻片上涂成薄層。3.2.2干燥固定：涂片自然干燥或在酒精燈火焰上方微熱烘干，并在火焰上通過23次，以固定涂片。3.2.3染色：在已固定的標(biāo)本上滴加結(jié)晶紫溶液數(shù)滴，使染色液覆蓋整個(gè)涂片標(biāo)本，染色1分鐘。3.2.4水洗：斜置玻片使很細(xì)水流的自來水從染色標(biāo)本的上端流下，勿使水流直接沖刷涂片處，直至洗下的水呈無色為止，自然晾干或吸干。3.2.5鏡檢：先用低倍鏡觀察，找到適合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用100倍物鏡觀察菌體形態(tài)。4 3%氫氧化鉀試驗(yàn)4.1材料3%KOH溶液（W/V）、無菌木質(zhì)牙簽、待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物（1824小時(shí)）。4.2操作 4.2.1在一潔凈的載玻片上等距離滴上3滴3%KOH水溶液。4.2.2用銅綠假單胞菌或具有等同反應(yīng)的菌種作為陽性對(duì)照。4.2.3用枯草芽胞桿菌或具有等同反應(yīng)的菌株作為陰性對(duì)照。4.2.4用木質(zhì)牙簽從培養(yǎng)基上分別挑取陽性，陰性和待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物（1824小時(shí)）于載玻片上的3滴KOH水溶液中。4.2.5然后用牙簽快速環(huán)形攪動(dòng)3060秒后，輕輕地向外拉該菌懸液，如果是革蘭陰性細(xì)菌，在菌懸液和牙簽之間有黏絲出現(xiàn)，如果是革蘭陽性細(xì)菌則無黏絲出現(xiàn)。4.2.6結(jié)果判斷 4.2.6.1如果在15秒鐘之內(nèi)溶液的黏性增強(qiáng)并有黏絲形成，則認(rèn)為該試驗(yàn)菌株的氫氧化鉀呈陽性，試驗(yàn)菌株為G-。4.2.6.2如果溶液不產(chǎn)生粘絲，則試驗(yàn)菌株被判斷為氫氧化鉀試驗(yàn)陰性，試驗(yàn)菌株為G+。4.2.6.3當(dāng)陽性和陰性試驗(yàn)結(jié)果均為典型反應(yīng)時(shí)，該實(shí)驗(yàn)才有效。5 觸酶試驗(yàn)（過氧化氫酶試驗(yàn)）5.1細(xì)菌代謝產(chǎn)生的過氧化氫對(duì)細(xì)菌細(xì)胞具有毒副作用，而細(xì)胞內(nèi)的接觸酶能催化過氧化氫，將其分解為分子態(tài)氧，使其解毒。向含有接觸酶的細(xì)菌培養(yǎng)物滴加過氧化氫溶液后即產(chǎn)生大量氣泡（陽性）。5.1材料3%過氧化氫溶液、無菌木質(zhì)牙簽、潔凈載玻片、滴管。5.2操作 5.2.1用無菌木質(zhì)牙簽挑取新鮮待檢菌的純菌苔置于潔凈的載玻片上。5.2.2向玻片上的菌落滴加3%過氧化氫溶液一滴；或于瓊脂培養(yǎng)物上直接滴加3%過氧化氫溶液試液。5.2.3結(jié)果判斷：立即觀察結(jié)果，產(chǎn)生氣泡為陽性反應(yīng)，不產(chǎn)生氣泡者為陰性反應(yīng)。用金黃色葡萄球菌或具等同性質(zhì)的菌種重復(fù)以上步驟作為陽性對(duì)照，并用銅綠假單胞菌或具等同性質(zhì)的菌種作為陰性對(duì)照。5.2.4注意事項(xiàng)5.2.4.1陰性控制和陽性控制必須為典型反應(yīng)時(shí)，該實(shí)驗(yàn)才有效。5.2.4.2當(dāng)將過氧化氫溶液加到生長于血瓊脂平板上的菌落時(shí)會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果（因?yàn)榧t細(xì)胞中含有過氧化氫酶）。5.2.4.3必須將過氧化氫酶溶液滴到菌落上，操作順序不能顛倒，否則會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果。5.2.4.4不要用鉑金類接種針或接種環(huán)去混合培養(yǎng)物和過氧化氫酶水溶液，因?yàn)榻臃N針的鉑金可以會(huì)引起假陽性結(jié)果。因此在這個(gè)試驗(yàn)中，應(yīng)用木質(zhì)無菌牙簽或是塑料類無菌接種環(huán)。6葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗(yàn)6.1 氧化發(fā)酵培養(yǎng)基中含有較低濃度蛋白胨和較高濃度碳水化合物，待檢細(xì)菌通過氧化或發(fā)酵利用葡萄糖產(chǎn)酸，使其pH值下降，培養(yǎng)基中的指示劑由綠色變成黃色。6.1材料6.1.1無菌礦物油：液體石蠟121半小時(shí)高壓蒸汽滅菌。6.1.2氧化發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10g，胰蛋白胨2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀0.3g，瓊脂4g，溴麝香酚藍(lán)0.08g，去離子水1000ml，pH6.6-7.0。分裝于13100mm小試管中，121滅菌15分鐘。豎直放置待其凝固后使用。6.2操作 6.2.1打開小試管。6.2.2用接種針挑取分離的單個(gè)純菌落，刺入氧化發(fā)酵培養(yǎng)基約1cm深，分別接種兩個(gè)試管。6.2.3向其中一只試管內(nèi)加入無菌礦物油，覆蓋在培養(yǎng)基表面約1cm高，作為發(fā)酵管（OF/F）；另一支不加礦物油作為氧化管（OF/O）。6.2.4以同樣的方法在試管中接種大腸埃希菌或者是等同菌株作為陽性對(duì)照，接種銅綠假單胞菌或者是類同菌株作陽性對(duì)照。6.3培養(yǎng)：將接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基放入3537的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果，若結(jié)果呈陰性，則繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。6.4結(jié)果判斷 6.4.1培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，反應(yīng)結(jié)果記為陽性。6.4.2培養(yǎng)基仍保持均勻的綠色，反應(yīng)結(jié)果記為陰性。6.4.3如果培養(yǎng)基的顏色由綠色變?yōu)樗{(lán)色，是由微生物產(chǎn)堿反應(yīng)所致，記為陰性。7 細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)細(xì)胞色素氧化酶是一種鐵卟啉類的酶，它將還原的細(xì)胞色素C氧化后以非活性的還原態(tài)存在。而還原的細(xì)胞色素氧化酶因?qū)㈦娮觽鬟f給分子氧而又變成活性態(tài)。在分子氧的存在下，細(xì)胞色素氧化酶和細(xì)胞色素C系統(tǒng)能還原一系列有機(jī)物。其中，它將指示條反應(yīng)區(qū)的萘酚和二甲基對(duì)苯二胺還原，會(huì)形成吲哚酚藍(lán)分子，通過這一反應(yīng)將細(xì)菌進(jìn)行分類和鑒別。7.1材料細(xì)胞色素氧化酶檢測指示條,指示條反應(yīng)區(qū)的主要成分：二甲基對(duì)苯二胺0.1mol、-奈酚1.0mol。7.2操作7.2.1用牙簽從培養(yǎng)基上挑取生長良好的單一菌落（菌落的pH值不得低于6.0，否則會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果）。7.2.2將菌落均勻涂在反應(yīng)帶上，過2060秒后，比較反應(yīng)帶的顏色。7.2.3若反應(yīng)帶變?yōu)樽系缴钭仙珓t為陽性反應(yīng)，不變色或黃色為陰性反應(yīng)。8 基于系統(tǒng)發(fā)育分析的16S rDNA序列測定與比對(duì)8.1當(dāng)藥品無菌檢查陽性或培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)陽性時(shí)，需對(duì)基污染菌及與該污染菌相似的菌種進(jìn)行分子水平上的菌種鑒定。該類樣品則其中送往測序公司進(jìn)行序列測定。9 潔凈區(qū)環(huán)境控制-微生物鑒定表環(huán)境級(jí)別區(qū) 域鑒定范圍A級(jí)空 氣鑒定至種人 員表 面B級(jí)空 氣鑒定至屬（地面-革蘭氏染色）人 員表 面C級(jí)空 氣超標(biāo)鑒定至屬，其他革蘭氏染色表 面其他革蘭氏染色 附件：附錄1 菌種鑒定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程流程圖相關(guān)文件與記錄：無培訓(xùn)范圍：質(zhì)量控制部全體人員參考文獻(xiàn)：無編制歷史與變更原因 ：本規(guī)程屬于海南*制藥有限公司第一版文件。版次號(hào)修訂內(nèi)容描述生效日期