分生實驗報告DNA的限制性酶切與回收.docx

實驗五DNA的限制性酶切與回收【實驗原理】1.限制性核酸內切酶是能夠識別特異DNA序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。其中類限制性內切酶是重組DNA技術的基本工具酶。經其切過的DNA有兩種不同的切口：平端切口和黏端切口。本實驗利用EcoR和BamH對質粒DNA進行雙酶切，產生帶有粘性末端的DNA片段。粘性末端連接，DNA片段兩端的互補堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高。2.經過電泳的DNA條帶需要回收，進一步分離純化以獲得純度較高的DNA片段?？上群笫褂萌苣z液，漂洗液，和洗脫液將DNA回收。3.酶切緩沖液成分及作用： Tris-HCl，維持pH在7.48.0； Mg2+，內切酶活性所必需； NaCl/KCl，增加離子濃度，利于酶活性； 二硫蘇糖醇(DTT)，保護酶，防止二硫鍵的形成4.星號活力限制性核酸內切酶在非標準反應條件下，能夠切割一些與其特異識別順序類似的序列，這種現象稱為星號活力。星號活力出現的原因：酶用量太大 100U / ug DNA。酶切體系中離子強度太低，12%)；有機溶劑的存在。5. 反應混合物中DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的DNA會形成粘性DNA溶液抑制酶的擴散，并降低酶活性。建議酶切反應的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。6. 酶切反應所加入的酶量應適中，根據底物的種類、量的多少和體積的大小而定，對不同的限制酶，各廠家均有一最大的消化量指標可參考。7.酶切底物DNA應具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、乙醚，大于10mM的EDTA，去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會不同程度地影響限制酶的活性。8.要保證酶作用時的最佳反應條件(ph, 溫度)和底物用量，酶反應才能有效地進行。9.高于37或需長時間保溫時，可加入礦物油覆蓋在反應液上以減少水分蒸發(fā)。10.反應混合物混勻時，應避免強烈振蕩以保證不使內切酶變性及DNA大分子的完整。11. 不同廠家的試劑不可混用，需要時請查明相關條件及數據。12.緩沖系統：在沒有離子存在時，電導率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強度的緩沖液中，電導很高并產熱，可能導致DNA變性，因此應注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時，常更新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循環(huán)是可取的。13.瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。14.凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現氣泡，影響電泳結果。15. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據加樣孔的大小及DNA中片段的數量和大小而定，過多的量會造成加樣孔超載，從而導致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現象更明顯?！緦嶒灲Y果】【實驗分析】1. pUC18的凝膠中，右邊凝膠條帶色淺，混作一團，實驗失敗，可能是酶活性不足。左邊凝膠條帶分割明顯，但顏色較淺，可能因為含量較少?；蛘咭驗槟z失水過多，或者有碎膠影響其游走。pUC18經EcoR和BamH兩種酶切之后，預期結果得到21bp和2.67kb兩種DNA片段，本實驗則要選取2.67kb作為載體。在marker中，最亮的那條條帶為2kb的DNA片段，2.67kb的目的載體DNA條帶片段正好在marker最亮條帶的下方，另一條21bp的片段由于分子量太小，游動快，位于marker的最小條帶的前方，符合實驗預期。因此，該凝膠中，左邊條帶實驗比較成功，回收時只需切割2.67kb的條帶即可。2.Sp1的凝膠中，中間組凝膠中DNA游走不明顯，DNA混作一團，可能是酶活性不足等導致實驗失敗。而左側組較為成功，凝膠中的條帶分成較為明顯的三條條帶，較符合實驗預期。切割凝膠時，應選擇左邊凝膠，但是其在膠最前面仍有小的亮帶，可能是有RNA混雜。而右側組出現了不應該出現的DNA條帶分離，可能是將SP1和Puc18誤混導致。分析原因， DNA由于酶切不完全，大部分DNA沒有被切開，導致上樣的DNA樣本分子量大，游走緩慢，結果中只有一條明顯的條帶，與少數不明顯的淺條帶。經與marker相比較，左邊條帶的結果較符合預期。Sp1所在基因經EcoR和BamH兩種酶酶切得2.2kb和4.9kb兩