第三章 細胞生物學研究方法

精選文庫一、章（節(jié)、目）授課計劃 第 頁授課章節(jié)名稱第三章 細胞生物學研究方法授課時數(shù)2教學目的1、使學生掌握細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法，了解主要工具，側(cè)重掌握基本原理和基本應(yīng)用2、了解細胞組分的分析方法及細胞培養(yǎng)3、了解細胞工程技術(shù)教學要求1、掌握細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法，掌握光學顯微鏡技術(shù)2、了解細胞組分的分析方法及細胞培養(yǎng)3、了解細胞工程技術(shù)教學重點1、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法2、細胞組分的分析方法及細胞培養(yǎng)。教學難點1、觀察細胞形態(tài)的主要方法及工具的介紹。2、細胞組分的分析方法教學方法與手段講授法、 互動討論法作業(yè)與思考題部分課后作業(yè)閱讀書目或參考資料1、細胞生物學（第3版）(翟中和等)(高等教育出版社)（2009）2、細胞生物學進展（鄭國錩等）（高等教育出版社）（1994）3、分子細胞生物學（韓貽仁）（高等教育出版社）（2007）教學后記二、課時教學內(nèi)容 第 頁教 學 內(nèi) 容小結(jié)技術(shù)的進步在一門學科的建立與發(fā)展過程中起著巨大的作用。沒有顯微鏡的發(fā)明就沒有細胞的發(fā)現(xiàn)，更不會有細胞學說的建立，沒有電子顯微技術(shù)及其分子生物學技術(shù)的結(jié)合，就不會有細胞生物學今天的發(fā)展。 細胞生物學研究方法：一般來說，凡是用來解決細胞生物學問題所采用的方法，都屬于細胞生物學研究方法。當前細胞生物學研究中常用到的方法有:核酸和蛋白質(zhì)成分的分析和序列測定、研究特異DNA、RNA常用的southern雜交、Northwre雜交及蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)、基因打靶技術(shù)等等。第一節(jié) 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、有關(guān)顯微鏡的一些概念（1）分辨率（resolution）：指分辨物體最小間隔的能力。 光學顯微鏡的分辨率 R=0.61/Nsin（/2） 其中為入射光線波長； N =介質(zhì)折射率；空氣中N =1 =物鏡鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 。（2）放大倍數(shù)（magnification）：是指眼睛看到像的大小與對應(yīng)標本大小的比值。它指的是長度的比值而不是面積的比值。例：放大倍數(shù)為100，指的是長度是1m的標本， 放大后像的長度是100m，要是以面積計算，則放大了10,000倍。 顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。 （3）有效放大倍數(shù)（effective magnification）：物鏡的數(shù)值孔徑（NA）決定了顯微鏡有效放大倍數(shù)。有效放大倍數(shù)，就是人眼能夠分辨的d與物鏡的d間的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍數(shù)： M=d/d二、顯微鏡的分類現(xiàn)代顯微鏡可以分為兩大類：一類是光學顯微鏡，另一類是非光學教 學 內(nèi) 容小結(jié)顯微鏡 。這兩類顯微鏡又可根據(jù)不同的情況分成若干類型。三、光學顯微鏡技術(shù)光學顯微鏡技術(shù)至今仍是細胞生物學研究的重要手段。（一）普通復(fù)式光學顯微鏡技術(shù)1. 構(gòu)成： 照明系統(tǒng)：光源、折光鏡、聚光鏡 光學放大系統(tǒng)：為兩組玻璃透鏡，目鏡與物鏡機械裝置和支架系統(tǒng)，由鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、推動器、粗動螺旋和微動螺旋等部件組成，保證光學系統(tǒng)的準確配置和靈活調(diào)控。2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡放大成虛像。教 學 內(nèi) 容小結(jié)（二）相差和微分干涉顯微鏡技術(shù)光線在通過密度不同的介質(zhì)時，其滯留程度不同，即產(chǎn)生了光程差和相位差。相差顯微鏡的基本原理把光程差變成振幅差(即明暗)。從而提高樣品反差，提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，明暗差別通過密度差形成使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標本，樣品不需染色，適合觀察活細胞。甚至研究細胞核、線粒體等細胞器的動態(tài)。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。1. 環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。2. 相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。 微分干涉顯微鏡用的是偏振光，增加了樣品反差，并具有立體感，可作于研究活體細胞中較大的細胞器。教 學 內(nèi) 容小結(jié)（三）熒光顯微鏡技術(shù) 特點：光源為短波光；有兩個特殊的濾光片（激發(fā)光濾片，阻斷濾片）照明方式通常為落射式（這種照明的光束來自物體的上方通過物鏡后射到被檢物體上，這樣物鏡又起著聚光鏡的作用。這種照明法是適用于非透明物體，檢出能力高；對細胞的刺激?。荒苓M行多重染色）。原理：細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡可對這類物質(zhì)進行定性和定量研究。光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡。是目前在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位最有力的工具應(yīng)用：直接熒光標記技術(shù)間接免疫熒光標記技術(shù)（四）激光共聚焦顯微技術(shù)原理和應(yīng)用：激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope）用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點（所謂共焦，是指物鏡和聚光鏡同時聚焦在同一點上），也是瞬時成像的物點。由于激光束的波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)，調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機重新組合，就能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)，給出細胞內(nèi)各部分之間的定量關(guān)系及各種結(jié)構(gòu)線度。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態(tài)，也可以用于細胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的定量。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。優(yōu)點是排除焦平面以外光的干擾，增強圖像反差和提高分辨率(1.41.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。教 學 內(nèi) 容小結(jié)（五）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)是檢測活體中生物大分了納米距離和納米距離變化的有力工具，可用于檢測某一細胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。FRET現(xiàn)象：當供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團分子的吸收光譜重疊，并且兩個探針的距離在10nm以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，稱FRET現(xiàn)象。采用融合表達方式，可將兩個蛋白的距離拉近于510nm。FRET效率反映了被檢的兩種蛋白是否直接作用及作用的強弱。（六）熒光漂白恢復(fù)技術(shù)又稱光脫色恢復(fù)技術(shù)，可用于檢測活體細胞表達或細胞內(nèi)部的分子運動以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動態(tài)變化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定的區(qū)域的熒光發(fā)生不可逆的淬滅，光漂白區(qū)熒光的恢復(fù)可通過非漂白區(qū)的熒光標記分子在膜上或胞質(zhì)中運動至光漂白區(qū)來完成。用于檢測活體細胞表面或細胞內(nèi)部的分子運動以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動態(tài)變化率的大小四、電子顯微鏡技術(shù)用于研究細胞內(nèi)部的精細結(jié)構(gòu)。（一）、電子顯微鏡的基本知識1、電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差教 學 內(nèi) 容小結(jié)2、電子顯微鏡的特征以電子束作光源，電磁場作透鏡。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等4部分構(gòu)成；分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達106；用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2m）。（二）主要電鏡制備技術(shù)1、超薄切片技術(shù) 用于電鏡觀察的樣本制備。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片，切片厚度20-50nm。 由于電子束的穿透能力有限，為獲得高分辨率的圖像，切片厚度一般僅為40-50nm，即一個直徑為20um的細胞可以切成幾百片，故稱超薄切片。這需要樣品具備一定的剛性和韌性，而生物樣品不具備這些特性，因此需要包埋于特殊的介質(zhì)中，包埋時會破壞樣品的結(jié)構(gòu)，因此在包埋前必須先將樣品固定。（1）固定：保持樣品的真實性，細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和成分保持在原來位置上通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，低溫，防止酶的自溶而破壞樣品結(jié)構(gòu)。（2）包埋：各種細微結(jié)構(gòu)在切片過程中獲得均勻良好的支撐，使獲得的超薄切片連續(xù)完整并有足夠的強度，且能耐受觀察時的電子轟擊、高溫和真空揮發(fā)。常用的包埋劑為環(huán)氧樹脂。注意：生物樣品固定后仍含有大量水分，而包埋劑是與誰不相溶的，因此在包埋前通常需要一系列的脫水處理。（3）切片：通過樣品桿的金屬熱膨脹或機械伸縮控制切片厚度。切片刀：玻璃或磚石。切片需撈在覆有支撐膜的載網(wǎng)上才能在電鏡下觀察。（4）染色：用重金屬鹽染色以形成明暗反差，只能觀察到黑白圖像不同的成分對不同的燃料有不同的親和性：鋨酸脂質(zhì)；鉛鹽蛋白質(zhì)；醋酸鈾核酸。2、負染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸) 染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，襯托出樣品的精細結(jié)構(gòu)，分辨力可達1.5nm左右。教 學 內(nèi) 容小結(jié)3、冰凍蝕刻 freeze-etching亦稱冰凍斷裂蝕刻復(fù)型。標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后將組織溶掉，把鉑和碳的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。復(fù)膜顯示出了標本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜面結(jié)構(gòu)，立體感，不需要包埋、固定深度蝕刻主要用來觀察胞質(zhì)中細胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白。4、電鏡三維重構(gòu)技術(shù)將電子顯微鏡、電子衍射、計算機圖像處理相結(jié)合的技術(shù)。用于分析難形成晶體的膜蛋白、病毒和蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。生物樣品的二維晶體在不同傾角下進行拍照，得到一系列電鏡圖片，傅里葉變換處理，得到三維結(jié)構(gòu)電子密度圖展示生物大分子及其復(fù)合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)，具有高分辨率5、掃描電鏡技術(shù)（SEM） 掃描電子顯微鏡于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結(jié)構(gòu)。工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘枺俳?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。CO 2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。五、掃描隧道顯微鏡（STM）它于1981年由格爾德賓寧 (Gerd K.Binnig)及亨利希羅勒(Heinrich Rohrer)在IBM位于瑞士蘇黎世的蘇黎世實驗室發(fā)明掃描隧道顯微鏡，只一種在納米水平上探測微觀世界物質(zhì)表面形貌的一儀器。 原理：掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在教 學 內(nèi) 容小結(jié)計算機顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。主要裝置： XYZ方向掃描的壓電陶瓷、 逼近裝置、 電子學反饋控制系統(tǒng)、 數(shù)據(jù)采集、處理和顯示系統(tǒng)主要特點： 具有原子尺度的高分辨本領(lǐng)：側(cè)分辨率0.1-0.2nm，縱分辯率0.001nm 真空、大氣、液體條件下工作 非破壞性測量局限性： 掃描隧道顯微鏡(STM)所觀察的樣品必須具有一定程度的導(dǎo)電性，對于半導(dǎo)體，觀測的效果就差于導(dǎo)體；對于絕緣體則根本無法直接觀察。 在掃描隧道顯微鏡(STM)的恒電流工作模式下，有時它對樣品表面微粒之間的某些溝槽不能夠準確探測，與此相關(guān)的分辨率 較差。 第二節(jié) 細胞組分的分析方法 形態(tài)學觀察和細胞成分的分析相結(jié)合是當代細胞生物學研究中長采用的試驗方法。一、細胞組分分離技術(shù) 是分離細胞器及各種大分子基本手段。 轉(zhuǎn)速1025kr/min的離心機稱為高速離心機。 轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89Kg者稱為超速離心機。 超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500kg。 （一）差速離心 Differential centrifugation 特點： 介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級離心。 用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。教 學 內(nèi) 容小結(jié) 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。 可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。 （二）密度梯度離心 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細胞和細胞成分分層、分離。 類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細胞的介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2）PH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）對細胞無毒。1. 速度沉降 velocity sedimentation 用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。2.等密度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分離密度不等的顆粒。 特點： 介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。 力場比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速離心。 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。教 學 內(nèi) 容小結(jié)二、細胞內(nèi)生物大分子的顯示方法：原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量。DNA：福爾根（Feulgen）反應(yīng)紫紅色多糖類：PAS反應(yīng)黃色脂肪：蘇丹III紅色蛋白質(zhì)：米倫（Millon）紅色1、金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。2、Feulgen反應(yīng)：醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸3、四氧化鋨:與不飽和脂肪酸反應(yīng)成黑色， 脂肪滴4、Millon（米倫）反應(yīng)：氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的絡(luò)氨酸殘基反應(yīng)，形成紅色沉淀，（有色復(fù)合物） 蛋白質(zhì)5、聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。6、脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。7、茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)三、特異蛋白抗原的定位與定性細胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位法：免疫熒光技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)蛋白質(zhì)體外定性法：免疫印跡、放射免疫沉淀、蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜分析（一）免疫熒光技術(shù)根據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，并標上標記熒光素，對抗原進行定位測定的技術(shù)?？焖佟㈧`敏、有特異性，但其分辨率有限 。（二）免疫電鏡技術(shù)能有效提高樣品的分辨率，在超微結(jié)構(gòu)水平上研究特異蛋白抗原的定位。n 免疫鐵蛋白技術(shù)教 學 內(nèi) 容小結(jié)n 免疫酶標技術(shù)n 免疫膠體金技術(shù) 應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等四、細胞內(nèi)特異核酸序列的定位和定性分子雜交技術(shù)：具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關(guān)系。 原位雜交（in situ hybridization）。 用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)研究生物大分子在細胞內(nèi)的合成動態(tài) 用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。 原理：將放射性同位素標記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位和半定量研究的一種細胞化學技術(shù)。 一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。 14C半衰期為5730年，3H為12.5年。六、定量細胞化學分析技術(shù)1、流式細胞儀 用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。 可定量地測定某一細胞中的DNA，RNA或某一特異蛋白的含量，以及細胞群體中上述成分含量不同的細胞的數(shù)量。特別是它還可將某一特異染色的細胞從數(shù)以萬計的細胞群體中分離出來，以及將DNA含量不同的中期染色體，甚至X或Y染色體的精子分離出來。 原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢教 學 內(nèi) 容小結(jié)測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞儀（flow cytometer）。2、顯微分光光度測定技術(shù) 實質(zhì)上是顯微鏡技術(shù)和分光光度技術(shù)的結(jié)合。它以物質(zhì)分子的光吸收、熒光發(fā)射和光反射特性作為測量基礎(chǔ)，可以對細胞內(nèi)的某些重要的生物分子（如 DNA、RNA、蛋白質(zhì)等）的含量進行定量測試，是組織化學和細胞生物學中定量研究的必不可少的工具。 顯微吸收光度法時一種光度測量的化學方法，它基于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、多糖、核酸、脂類和酶染顆粒能在不同等電點下電離出不同側(cè)基，因而造成對染料親和力不同，應(yīng)用不同的化學試劑染色，可使不同的細胞組分染上不同的顏色，在顯微鏡下成為可見的結(jié)構(gòu)。染料于組分的結(jié)合必須是特異性的，即染料、細胞組分結(jié)合物的光吸收是遵循朗伯-比爾定律，而且染色深淺與被染細胞組分之間呈化學劑量學關(guān)系，符合這兩者關(guān)系的樣本就可應(yīng)用吸收測量法，通過光檢測器（可使光能變成電能）測量有色化合物吸收單色光的量。第三節(jié) 細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)一、細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)就是將動植物組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞或直接以單細胞 生物，給予必要的生長條件，讓其在培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)基上繼續(xù)生長與增殖。（一）、動物細胞培養(yǎng) 原代培養(yǎng)（primary culture cell）: 從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。 傳代培養(yǎng)（subculture cell）: 適應(yīng)在培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞。 細胞系（cell line）：通過純系化或選擇法從原代培養(yǎng)細胞中分離出來的細胞群體。 細胞株（cell strain）：從培養(yǎng)細胞中篩選出的具有特定性質(zhì)或標志的細胞群。 教 學 內(nèi) 容小結(jié)細胞貼壁：分散的細胞懸液在培養(yǎng)瓶中很快（幾十分鐘貨數(shù)小時內(nèi)）就貼附于瓶壁上的現(xiàn)象。（二）、植物細胞培養(yǎng)1. 原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細胞，特點： 比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA； 便于進行細胞融合，形成雜交細胞； 適宜條件下可產(chǎn)生細胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。2. 單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。(三)、非細胞體系來源于細胞，而不具有完整的細胞結(jié)構(gòu)，但包含了進行正常生物學反應(yīng)所需的物質(zhì)（如供能系統(tǒng)和酶反應(yīng)體系等）組成的體系即為非細胞體系（cell-free system）。 用途：研究DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、高爾基體的膜泡運輸機制以及細胞核裝配等。二、細胞工程（一）細胞融合與細胞雜交技術(shù) 通過培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（cell fusion）或細胞雜交。 同核融合細胞：基因型相同的細胞融合形成的雜交細胞。 異核融合細胞：基因型不同的細胞融合形成的雜交細胞。 自發(fā)融合：同種細胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。 誘發(fā)融合：異種間的細胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。在自然界中細胞自發(fā)融合發(fā)生的機率很小，一般需要誘發(fā)融合。誘發(fā)融合細胞的方法一般有以下幾種：誘發(fā)細胞融合的方法：1、生物法：病毒促進細胞融合，其中仙臺病毒（HVJ）是最早用于動物細胞融合的融合劑。原理：病毒被膜具有凝聚細胞的能力，它一邊黏連一個細胞的表面，另一邊黏連另一個細胞的表面，從而使兩個細胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)，誘導(dǎo)細胞的融合。教 學 內(nèi) 容小結(jié)2、化學法：主要包括鹽類融合劑、聚乙二醇（PEG）、二甲亞砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸鹽、脂質(zhì)、Ca2+配合物等。其中聚乙二醇法是較常用的化學融合方法。其原理是PEG分子具有輕微的負極性，與具有正極性基團的物質(zhì)形成氫鍵，在原生質(zhì)體之間形成分子橋，使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進而促使原生質(zhì)體的融合。3、物理法：電融合法。其原理是改變原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。細胞融合的步驟1、動物細胞的融合（）細胞準備。分貼壁和懸浮細胞兩種。前者可直接將兩親本細胞混合培養(yǎng)，后者需制成一定濃度的細胞懸浮液。 （）細胞融合，加促融因子于將行融合的細胞之中，誘導(dǎo)融合。 （）雜種細胞選擇。利用選擇性培養(yǎng)基等，使親本細胞死亡，而讓雜種細胞存活。 （）雜種細胞克