酶工程PPT課件.ppt

第二章酶的發(fā)酵工程 所有的生物為了維持其正常的生命活動 在一定的條件下都能夠合成其自身生長所需要的各種酶 酶的種類和數(shù)量是受到細胞自身的嚴格調控的 通過人為的操作控制 利用生物細胞的生命活動來大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)人們所需要的酶的技術過程 稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn) 酶的制備方法 提取法 發(fā)酵法 合成法 第一節(jié)酶生物合成的調節(jié)機制第二節(jié)酶的發(fā)酵技術第三節(jié)酶發(fā)酵動力學 第一節(jié)酶生物合成的調節(jié)機制 一 原核生物中酶生物合成的調節(jié) 原核生物酶的合成主要是在轉錄水平上進行調節(jié) 調節(jié)方式主要有酶合成的誘導和酶合成的阻遏兩種方式 原核生物中酶合成的誘導和阻遏作用機制都可以用Jacob和Monod提出的操縱子理論來解釋 一 乳糖操縱子學說 操縱子 由調節(jié)基因 R 啟動子 P 操縱基因 O 和結構基因 S 所構成的一個完整的基因表達單位 1 基本概念 誘導物 誘導酶起始合成的物質 輔阻遏物 阻遏酶產(chǎn)生的物質 調節(jié)蛋白 調節(jié)基因產(chǎn)生的一種變構蛋白 兩個結合位點 操縱基因結合位點 效應物結合位點 兩種類型 阻遏蛋白 阻遏蛋白原 1 乳糖操縱子的結構 I P O Z Y A 半乳糖苷酶 透過酶 乙?；D移酶 誘導物 阻遏蛋白 cAMP CAP RNA聚合酶 2 阻遏蛋白的負性調節(jié) 3 CAP的正性調節(jié) 2 乳糖操縱子的誘導機制 DNA 二 色氨酸操縱子學說 磷酸核糖鄰氨基苯甲酸 分支酸 鄰氨基苯甲酸 羧苯氨基脫氧核糖磷酸 吲哚甘油磷酸 色氨酸 鄰氨基苯甲酸合酶 鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉移酶 磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶 吲哚甘油磷酸合酶 色氨酸合酶 1 操縱子的調節(jié)作用 R P O D B A C E 阻遏蛋白原 輔阻遏物 色氨酸 DNA 2 衰減子的調節(jié)作用 R P O D B A C E 低色氨酸 高色氨酸 前導序列 DNA 三 酶生物合成的誘導作用 誘導物 底物 產(chǎn)物 底物結構類似物 IPTG 生物學意義 節(jié)約機制 環(huán)境適應能力 四 酶生物合成的阻遏作用 1 終產(chǎn)物阻遏 某一代謝 合成 途徑的終產(chǎn)物阻遏合成途徑中酶的合成的現(xiàn)象 A B C D E E1 E2 E3 E4 2 分解代謝物的阻遏作用 當培養(yǎng)基中存在兩種碳源 底物 時 容易利用的碳源的分解代謝產(chǎn)物阻遏分解代謝另一種碳源的酶的合成的現(xiàn)象 葡萄糖效應 葡萄糖抑制微生物利用其他碳源 底物 的現(xiàn)象 I P O Z Y A cAMP CAP 二 真核生物中酶生物合成的調節(jié) 一 細胞分化改變酶的生物合成 如 端粒酶的生物合成 二 基因擴增加速酶的生物合成 如 爪蟾卵細胞形成時 rRNA的基因數(shù)增加4000倍 中國田鼠細胞培養(yǎng)在含有氨甲基蝶呤的培養(yǎng)基中生長時 細胞中編碼二氫葉酸還原酶的基因大量擴增 以合成大量的二氫葉酸還原酶 三 增強子促進酶的生物合成 增強子 是一段能夠提高轉錄效率的特定DNA序列 長約100 200bp 核心組件8 12bp 單拷貝或多拷貝串聯(lián)存在 增強子的作用特點 1 提高同一條DNA鏈上基因的轉錄效率 可遠距離發(fā)揮作用 在基因的上游或下游均可起作用 2 與其序列的正反方向無關 3 要有啟動子才能發(fā)揮作用 但對啟動子沒有嚴格的專一性 4 必須與特定的蛋白質因子結合才能發(fā)揮作用 具有組織和細胞特異性 三 酶生物合成調節(jié)作用機理的實際應用 一 發(fā)酵中的應用 二 酶生產(chǎn)中的應用 三 微生物菌種選育中的應用 第二節(jié)酶的發(fā)酵技術 利用微生物的發(fā)酵作用 運用一些技術手段控制發(fā)酵過程 大規(guī)模產(chǎn)酶的技術 稱為酶的發(fā)酵技術 內(nèi)容主要包括 菌種的選育 培養(yǎng)基的配置 培養(yǎng)條件控制 發(fā)酵方法 一 酶的生產(chǎn)菌種 一 產(chǎn)酶微生物的種類 1 細菌 大腸桿菌 青霉素?；?L 天冬酰胺酶 枯草芽孢桿菌 中性蛋白酶 中溫 淀粉酶 地衣芽孢桿菌 高溫 淀粉 2 放線菌 葡萄糖異構酶 谷氨酰胺轉氨酶 3 酵母菌 凝血激酶 尿激酶 植酸酶 4 霉菌 黑曲霉 米曲霉 淀粉酶 糖化酶 乳糖酶 脂肪酶 理氏木霉 木聚糖酶 纖維素酶 青霉 葡萄糖氧化酶 5 磷酸二酯酶 二 產(chǎn)酶菌種的要求 1 酶的產(chǎn)量高 2 容易培養(yǎng)和管理 產(chǎn)酶細胞容易生長繁殖 適應性強 便于管理 3 菌株遺傳性能穩(wěn)定 不易變異退化 不易感染噬菌體 保證生產(chǎn)的穩(wěn)定性 4 菌株能利用廉價原料 發(fā)酵周期短 生產(chǎn)成本低 5 有利于酶產(chǎn)品的分離純化 最好是分泌型的胞外酶 6 菌株安全可靠 非病原菌 不產(chǎn)毒素及其它有害物質 不影響生產(chǎn)人員的身體健康 7 基因工程菌必須符合安全性要求 三 菌種篩選 1 含菌樣品的采集 根據(jù)不同微生物的生態(tài)分布特點 從自然界中采樣 產(chǎn)酶微生物的分布基本規(guī)律 1 相近菌種產(chǎn)生的酶性質一般相近或相似 2 胞外酶的穩(wěn)定性和最適條件通常和菌的最適生長條件接近 3 為獲得能降解某種物質的產(chǎn)酶菌株 一般可從該物質分布比較豐富的地方尋找 2 菌種的分離純化 平板劃線法 稀釋涂布分離法 3 產(chǎn)酶性能的測定 初篩 快速 簡便 平板篩選法 有色圈 復篩 精確 液體或固體培養(yǎng)發(fā)酵 測定產(chǎn)酶水平 4 菌種的選育 誘變育種 雜交育種 原生質體融合育種 基因工程育種 5 菌種的保藏 斜面低溫保藏法 沙土管保藏法 石蠟油封藏法 真空冷凍干燥法 超低溫保藏法 固體曲法等 6 菌種的退化與復壯 1 菌種退化現(xiàn)象 隨著菌種保藏時間的延長或多次的轉接傳代 菌種本身所具有的優(yōu)良遺傳性狀發(fā)生了不利于發(fā)酵生產(chǎn)的遺傳變異現(xiàn)象 2 防止退化措施 創(chuàng)造合適的培養(yǎng)條件 采取有效的菌種保藏方法 盡量減少傳代次數(shù) 3 退化菌種的復壯 純種分離和性能測定 包括已發(fā)生退化菌種的復壯和菌種退化之前的復壯和提高 四 菌種活化與擴大培養(yǎng) 1 菌種擴大培養(yǎng) 保藏菌種 試管斜面活化 三角瓶培養(yǎng) 種子罐培養(yǎng) 2 種子制備的過程 防止雜菌污染 減少轉接次數(shù) 避免種子培養(yǎng)基的長時高溫滅菌 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件是細胞生長繁殖的最適條件 培養(yǎng)時間以對數(shù)生長期為宜 2020 3 21 22 3 種子質量的控制 1 影響種子質量的因素及其控制 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富 盡可能滿足細胞生長繁殖 營養(yǎng)成分盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基接近 pH值穩(wěn)定 培養(yǎng)條件必須是菌種細胞生長繁殖的最適條件 包括溫度 pH值 通氣攪拌 通風 翻曲 濕度 種齡生命力最為旺盛的對數(shù)生長期 細菌 7 24h 霉菌 16 50h 放線菌 21 64h 種子質量的判斷細菌 酵母菌 菌體健壯 菌形一致 均勻整齊 一定的排列和形態(tài) 霉菌 放線菌 菌絲粗壯 染色力強 生長旺盛 菌絲分枝和內(nèi)含物情況良好 種子的異常情況菌種生長緩慢或過快 菌絲結團 接種量與菌種特性 種子質量和發(fā)酵條件有關 0 1 10 2 種子質量的控制措施 菌種穩(wěn)定性檢查 保藏菌種 無 雜 菌檢查 顯微鏡觀察 肉湯或瓊脂斜面培養(yǎng) 生化分析 養(yǎng)分消耗速度 pH變化 溶解氧利用 色澤 氣味等 二 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響與調節(jié) 一 培養(yǎng)基成分對產(chǎn)酶的影響 1 碳源淀粉及其水解物 2 氮源無機氮和有機氮 3 無機鹽類大量元素和微量元素 4 生長因子氨基酸 嘌呤 嘧啶 維生素 激素 5 產(chǎn)酶促進劑表面活性劑 植酸鈣鎂 LS 聚乙烯醇 EDTA等 二 培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響與調節(jié)控制 1 pH對產(chǎn)酶的影響與調節(jié)控制 細菌 放線菌 中性至微堿性 霉菌 酵母菌 微酸性 培養(yǎng)基pH的改變會影響產(chǎn)酶的種類或比例 調節(jié)控制 控制培養(yǎng)基的組分或比例 添加pH緩沖物種 流加酸堿溶液或補料 提高空氣流量 2 溫度對產(chǎn)酶的影響與調節(jié)控制 不同的微生物生長與產(chǎn)酶的最適溫度各不不同 很多微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與生長繁殖的最適溫度不同 且往往低于生長最適溫度 在酶發(fā)酵生產(chǎn)的不同階段控制不同的溫度條件 進行變溫發(fā)酵 調節(jié)控制 液態(tài)發(fā)酵可利用發(fā)酵罐的夾套 盤管或蛇管等通過溫 冷 水進行調節(jié)控制 固態(tài)發(fā)酵可通過通風量或風溫來進行調節(jié) 3 溶解氧對產(chǎn)酶的影響與調節(jié)控制 臨界氧濃度 不影響細胞正常代謝的最低氧濃度 溶氧濃度是由溶氧速率和耗氧速率來決定的 調節(jié)控制 調節(jié)氧分壓改變進氣壓力或罐壓 改變氧含量 添加氧載體 增加通氣量 延長氣液接觸時間 增加氣液接觸面積 改變培養(yǎng)液的性質改變組分或濃度 添加消泡劑 4 泡沫對產(chǎn)酶的影響與控制 泡沫的不利影響 阻礙CO2的排除 影響O2的溶解 發(fā)酵液溢出 造成原料浪費 引起雜菌污染 發(fā)酵罐裝料量受限 降低發(fā)酵罐的利用率 控制泡沫的方法 選育不易產(chǎn)生泡沫的菌種 調節(jié)培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分 減少或緩加易起泡的原料 機械消泡或化學消泡 化學消泡劑 天然油類 甘油聚 醚 泡敵 聚環(huán)氧丙烷環(huán)氧乙烷甘油 勤加 少加較好 5 濕度對產(chǎn)酶的影響與控制 對固體發(fā)酵產(chǎn)酶而言 影響微生物的產(chǎn)酶量 也會影響產(chǎn)酶達到高峰的時間 特定菌種 發(fā)酵過程的不同時期 對濕度要求不同 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶 前期濕度低 后期濕度高 有利于產(chǎn)酶 調節(jié)控制 配制培養(yǎng)基時 控制物料的含水量 控制鼓風量大小 或調節(jié)空氣的濕度 噴灑水分 三 發(fā)酵方法 一 液體深層發(fā)酵 優(yōu)點 產(chǎn)酶純度高 質量穩(wěn)定 較易控制發(fā)酵條件 易自動化控制 機械化程度高 勞動強度小 設備利用率高 缺點 設備投資大 二 固體發(fā)酵 固體發(fā)酵方式 淺盤培養(yǎng) 轉鼓培養(yǎng) 厚層通風培養(yǎng) 優(yōu)點 設備簡單 環(huán)境污染少 產(chǎn)酶率高 適合霉菌的培養(yǎng) 困難 傳質傳熱效率低 發(fā)酵條件不易控制 產(chǎn)酶不穩(wěn)定 不能進行胞內(nèi)酶的生產(chǎn) 缺點 勞動強度大 原料利用率低 產(chǎn)酶純度差 提取精制 三 分批發(fā)酵 四 連續(xù)發(fā)酵 特點 操作簡單 發(fā)酵初期營養(yǎng)物過多可能抑制微生物的生長 中后期可能因為營養(yǎng)物的減少及有害代謝產(chǎn)物的積累而降低培養(yǎng)效率 優(yōu)點 可有效實現(xiàn)自動化 降低勞動強度 設備利用率高 可消除反饋阻遏作用 酶產(chǎn)率高 適合于與生長相偶聯(lián)的發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn) 缺點 菌種易變異退化 易染雜菌 原料利用率低 生產(chǎn)成本增加 五 補料分批發(fā)酵 優(yōu)點 可解除營養(yǎng)基質的抑制和分解代謝物阻遏作用 可改善好氧發(fā)酵的溶氧狀況 減少菌體生成量 提高 有用產(chǎn)物的轉化率 菌絲減少可降低發(fā)酵液的粘度 便于發(fā)酵培養(yǎng)物的輸送及后處理 不易產(chǎn)生菌種退化和變異 雜菌污染易控制 使用范圍廣 四 提高產(chǎn)酶的措施 一 添加誘導物 誘導物類型 作用底物 反應產(chǎn)物 底物類似物 二 降低阻遏物濃度 分解代謝物阻遏 末端產(chǎn)物 反饋 阻遏 三 添加表面活性劑 非離子型表面活性劑 如吐溫80 四 添加產(chǎn)酶促進劑 植酸鈣鎂 聚乙烯醇等 第三節(jié)酶發(fā)酵動力學 一 酶生物合成的模式 一 細胞生長曲線 細胞生長曲線圖 二 酶生物合成的模式 1 同步合成型 酶的合成與細胞的生長同步 合成可以誘導 但不受分解代謝物阻遏和反饋阻遏 酶對應的mRNA很不穩(wěn)定 特點