分子生物學.doc

免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。 免疫組織化學的全過程包括：1.抗原的提取與純化；2.免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化；3.將顯色劑與抗體結(jié)合形成標記抗體；4.標本的制備；5.免疫細胞化學反應以及呈色反應；6.觀察結(jié)果。幾種常用免疫組織化學方法的原理1 免疫熒光方法它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。 2 免疫酶標方法基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內(nèi)的各種抗原成分進行定位研究。本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。目前在病理診斷中廣為使用的當屬PAP法、ABC法、SP法等。 3 免疫膠體金技術(shù)膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內(nèi)的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。1原位雜交 將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交！ 使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細菌或其他真核細胞中的位置。 RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學或RNA原位雜交。該技術(shù)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內(nèi)RNA表達的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是：在細胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細胞或組織中相應的基因片段相結(jié)合（雜交），所形成的雜交體經(jīng)顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內(nèi)相應的mRNA、rRNA和tRNA分子。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已 成為最有效的分子病理學技術(shù) FISH是一種原位雜交技術(shù)，因其所用探針被熒光物質(zhì)標記（間接或直接）而得名，基本原理是熒光標記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火 溫度下復性；通過熒光顯微鏡觀察熒光信號可在不改變被分析對象（即維持其原位）的前提下對靶核酸進行分析。DNA熒光標記探針是其中最常用的一類核酸探針。利用此探針可對組織、細胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平 的分析。熒光