基質(zhì)固相分散–反相液相色譜測定蔬菜中二甲戊樂靈農(nóng)藥殘留.doc

基質(zhì)固相分散反相液相色譜測定蔬菜中二甲戊樂靈農(nóng)藥殘留孫福生* 董杰 （蘇州科技學(xué)院 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，蘇州，215011）摘要：應(yīng)用基質(zhì)固相分散反相液相色譜技術(shù)建立了提取、檢測蔬菜中二甲戊樂靈農(nóng)藥殘留的分析方法。研究了不同的提取條件(萃取吸附劑、樣品與吸附劑的比例、洗脫劑和用量等)及測定條件對檢測二甲戊樂靈的影響，確定了最佳提取條件：萃取吸附劑是弗羅里硅土、樣品與弗羅里硅土吸附劑的比例為1：4、20mL乙酸乙酯洗脫劑。二甲戊樂靈的測定線性范圍為0.02-2.0mg/L、 r0.999。應(yīng)用此方法測定了某些蔬菜樣品中二甲戊樂靈農(nóng)藥殘留，測定相對標準偏差為2.2-5.2。在幾種蔬菜中的加標回收率為84.5-92.5，方法檢出限在11-20mg/kg范圍內(nèi)。關(guān)鍵詞：基質(zhì)固相分散；二甲戊樂靈農(nóng)藥殘留；反相液相色譜；蔬菜二甲戊樂靈是二硝基苯胺類選擇性土壤處理除草劑, 是當前除草劑中殺草譜很廣的除草劑之一，用于防除一年生禾本科雜草和某些闊葉雜草,除草效果好,安全性高,現(xiàn)已國產(chǎn)化并得到廣泛應(yīng)用。土壤對其吸附性強，不易淋溶，在土壤中移動性小。其農(nóng)藥殘留對后茬作物會產(chǎn)生藥害。二甲戊樂靈被認為是可疑的內(nèi)分泌干擾劑和可能的致癌物質(zhì)1。歐洲已有國家(組織)禁用或限用此農(nóng)藥,美國已對大豆中二甲戊樂靈殘留量提出了嚴格的限制指標（0.1mg/kg）2。我國規(guī)定二甲戊樂靈在葉菜中的最高殘留限量為0.2mg/kg，日本為0.2mg/kg （結(jié)球甘藍）、韓國也為0.2mg/kg （包心菜）3。測定二甲戊樂靈農(nóng)藥殘留所使用的儀器方法主要有氣相色譜（GC）4-5、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）6-7、液相色譜(LC)8、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)7等法。在已報道的蔬菜中二甲戊樂靈農(nóng)藥殘留的測定中，大多采用傳統(tǒng)的液-液萃取(LLE)法提取樣品中目標物，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮富集，如需要再經(jīng)凈化后進行測定3，5，9。這種方法需消耗大量有毒有害的有機溶劑,繁瑣費時,而且在萃取過程中容易產(chǎn)生大量乳狀液,影響萃取效率。自1989年美國Louisiana州立大學(xué)Barker教授首次提出基質(zhì)固相分散（MSPD）技術(shù)10 后，已在蔬菜、水果等農(nóng)藥殘留檢測中得到一定的應(yīng)用。這是一種嶄新的固相萃取(SPE)新技術(shù)，其基本操作是將試樣直接與弗羅里硅土和反相填料（如C18、C8等）研磨、混勻成半固態(tài)后裝柱洗脫。MSPD簡化了這類樣品的傳統(tǒng)處理中所需的樣品均化、組織細胞破裂、提取、凈化等過程，避免了樣品均化、轉(zhuǎn)溶、乳化、濃縮等造成的目標檢測物的損失。應(yīng)用MSPD樣品處理并分析蔬菜中二甲戊樂靈殘留鮮有報道，而張智超等報道了以涂敷AgNO3 的堿性氧化鋁為分散劑的MSPD法提取、氣相色譜/電子捕獲檢測器檢測大蒜中痕量二甲戊樂靈殘留的分析方法1。本研究采用MSPD技術(shù)，將蔬菜樣品直接與弗羅里硅土研磨，優(yōu)化了MSPD各種條件，并用反相液相色譜（RPLC）測定提取液中的二甲戊樂靈，其結(jié)果令人滿意。1 實驗部分_基金項目：江蘇省環(huán)境工程重點學(xué)科建設(shè)項目（A0030803）作者簡介：孫福生（1945- ），男，教授1.1 儀器與試劑用Agilent 1100液相色譜儀（美國加利福尼亞安捷倫技術(shù)公司）分離檢測二甲戊樂靈，它由一個四元泵、真空脫氣器、恒溫柱箱和可變波長檢測器組成。使用Rheodyne型號7125手動進樣器（美國加利福尼亞Rheodyne公司）和20微升定量管進樣。色譜柱是Hypersil柱（2004.6 mm i.d.，5m ODS C18微粒，美國安捷倫公司）。用甲醇溶解二甲戊樂靈標準品（99，江蘇龍燈化學(xué)有限公司）并定容配置成10000mg/L標準儲備液；二甲戊樂靈標準系列溶液是用甲醇逐級稀釋標準儲備液而得。甲醇、乙腈（色譜純，Merck，Germany）；乙酸乙酯（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑）、正己烷、二氯甲烷、甲苯（分析純，上海化學(xué)試劑有限公司），使用前重蒸并過0.45m濾膜。弗羅里硅土（Florisil分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，100-200目，130C活化4-6小時；無水硫酸鈉（分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司，于馬弗爐450C活化4小時；C18填料（40-63mm，60，SILICYCLE），使用前先進行活化處理，方法如下：在50mL玻璃注射器內(nèi)裝入2.0 gCl8，分別用2倍柱體積的正己烷、二氯甲烷和甲醇依次洗滌，真空干燥，貯于試劑瓶內(nèi)備用。實驗用水為Milli-Q超純水（Milipore，USA）。1.2 色譜條件7采用Agilent 1100可變波長紫外檢測器對100 mg/L二甲戊樂靈標準溶液進行波長掃描，確定最佳檢測波長為235nm。對10 mg/L二甲戊樂靈標準溶液進樣，確定最佳色譜條件：流動相為100%甲醇，流速0.8mL/min，柱溫25C。在該條件下，圖1為10 mg/L二甲戊樂靈標準溶液的色譜圖，二甲戊樂靈的保留時間為2.994min。圖 1 二甲戊樂靈色譜圖 Fig.1 Chromatogram of pendimethalin1.3 MSPD操作步驟取蔬菜樣品若干，用榨汁機打成均勻漿狀，準確稱取0.5g勻漿于玻璃研缽中，加入2.0g已活化的弗羅里硅土作為分散劑，充分研磨至樣品顆粒完全分散在弗羅里硅土中，待裝柱。取10mL注射器，底部填入少量脫脂棉后再放一濾紙片，加入2.0g無水硫酸鈉，然后將上述研缽中的混合物均勻地倒入注射器裝柱，邊裝邊敲實此柱，再加入1.0g無水硫酸鈉，上端再放一濾紙片，用活塞適度壓實樣品，取出活塞。用20mL乙酸乙酯洗脫劑分3次洗脫，燒杯接收洗脫液。40水浴，氮吹儀吹干洗脫液；用2mL甲醇溶解杯中殘留物，并經(jīng)0.45m針頭過濾器濾至2mL定量管中定容，待測定。2 結(jié)果與討論2.1 基質(zhì)固相分散萃取蔬菜中二甲戊樂靈條件的選擇和優(yōu)化在基質(zhì)固相分散萃取中，固相萃取材料的選擇、洗脫劑的極性和用量、樣品與固相萃取材料的比例是影響前處理效果的4個最主要因素，只有優(yōu)化了這些參數(shù)才能同時得到理想的凈化效果和回收率。固相萃取材料和洗脫劑的選擇直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準確性，選擇正確的洗脫劑和固相萃取材料的組合，能有效提高檢測方法的準確性。合適的固相萃取材料可以把目標農(nóng)藥有效提取出來，而較少提取油脂、蛋白、色素等雜質(zhì)；合適的洗脫劑能將目標農(nóng)藥從凈化柱上徹底洗脫下來，而將油脂、蛋白和色素等雜質(zhì)保留在凈化柱上，因此合適的固相萃取材料和洗脫劑及其用量對蔬菜中殘留農(nóng)藥的提取、分離凈化是至關(guān)重要的。除非另有說明，所有條件的選擇和優(yōu)化結(jié)果都是用山藥樣品，添加二甲戊樂靈的濃度為1.0mg/kg，進行三次平行樣測定的平均值。2.1.1 基質(zhì)固相分散萃取吸附劑的選擇在基質(zhì)固相分散中，固相萃取吸附劑同時起著支持劑、吸附劑、凈化劑的作用，待測農(nóng)藥在填料與樣品基質(zhì)之間進行吸附與分配，最終達到提取與凈化雙重效果。對C18和弗羅里硅土兩種吸附劑對檢測結(jié)果的影響進行了試驗，其加標回收率分別為78.8%和90.2%，而相對標準偏差分別為2.3%和1.5%。由此可見，對提取蔬菜中二甲戊樂靈農(nóng)藥來說，弗羅里硅土吸附劑更合適。2.1.2 樣品與吸附劑量的比率選擇 樣品與吸附劑量的比率對分析結(jié)果影響很大。文獻報道，樣品和鍵合相載體的最佳比率是1:4，大多數(shù)MSPD柱中典型的樣品用量為0.5g11。分別試驗了樣品與弗羅里硅土吸附劑量的比率為1：2，1：3，1：4和1：5，其結(jié)果列于表1。從結(jié)果看，當樣品與吸附劑的比率從1；2逐步提高到1；4時，二甲戊樂靈的回收率也隨著增加；但樣品與吸附劑比表 1 不同樣品-吸附劑比率對二甲戊樂靈回收率的影響Tab. 1 Effect of different ratio of sample-sorbent on recovery of pendimethalin樣品-吸附劑比率二甲戊樂靈回收率，%RSD，%1：269.12.51：378.43.71：490.21. 51：588.53.3率提高到1：5時，其回收率反而降低。1：4時二甲戊樂靈回收率和測定的RSD最佳，此與文獻報道的結(jié)果吻合。所以，確定樣品與弗羅里硅土吸附劑量的比率為1：4。2.1.3 洗脫劑和用量的選擇理想的洗脫溶劑應(yīng)滿足以下兩個要求:(1)溶劑強度足夠大，即使用該洗脫溶劑時分析物的保留因子KW盡可能小;(2)溶劑應(yīng)與后續(xù)的檢測方法相適應(yīng)12。分別試驗了正己烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯對二甲戊樂靈的洗脫效果，其結(jié)果見圖2。由圖2可見，正己烷為洗脫劑時洗脫不完全，加標回收率偏低；甲醇和乙腈為洗脫劑時加標回收率已大于70%，二者效果基本相當；而乙酸乙酯對二甲戊樂靈的洗脫效果最好，加標回收率已大于90%。因此確定乙酸乙酯為本工作的洗脫劑。洗脫劑的用量以既能對目標分析物有很好的溶解、洗脫能力，同時又能對基質(zhì)雜質(zhì)洗脫較少為準則。圖3是乙酸乙酯洗脫劑用量對影響洗脫二甲戊樂靈農(nóng)藥的曲線圖。由圖3可看出，隨著乙酸乙酯用量的增大二甲戊樂靈的回收率也增大；當用量為20mL時，其回收率已高于90%；但當用量繼續(xù)增加時，回收率增幅趨于平緩。所以，本研究選擇乙酸乙酯洗脫劑的用量為20mL。2.2 二甲戊樂靈測定的線性范圍用甲醇稀釋二甲戊樂靈標準儲備液，配制不同濃度的二甲戊樂靈標準溶液，在相同的色譜條件下進行測定，其線性范圍為0.02-2.0mg/L，r0.999。圖2 洗脫劑的選擇Fig. 2 Selection of eluting solvent圖3 洗脫劑用量對萃取效率的影響Fig. 3 Effect of amount of eluting solvent on extraction efficiency2.3 樣品測定、加標回收率、精密度和檢出限在馬鈴薯、胡蘿卜和山藥樣品中分別加入不同量的二甲戊樂靈標準溶液，用上述研究的方法測定了樣品。以胡蘿卜樣品為例，加標前后經(jīng)MSPD萃取后洗脫液的色譜圖分別描繪于圖4(a)和圖4(b)中。比較這二張圖可見，在約3min處，能明顯看到加標后的色譜圖上增加的那個峰即二甲戊樂靈。根據(jù)測定結(jié)果，計算了加標回收率、測定精密度和檢出限（S=3s），其結(jié)果列于表2。由表2可知，三種樣品的不同加標量的加標回收率和測定的相對標準偏差（RSD）分別在84.5-92.5%和2.2-5.2%范圍內(nèi)。對添加低濃度水平的樣品的測定，計算得到的方法檢出限在11-20mg/kg范圍內(nèi)。在三種樣品中二甲戊樂靈農(nóng)藥殘留量均小于方法檢出限，未檢出。 3 結(jié)論本文研究了以弗羅里硅土為基質(zhì)固相萃取吸附劑，乙酸乙酯為洗脫劑的基質(zhì)固相分散萃取富集蔬菜樣品中二甲戊樂靈農(nóng)藥殘留的前處理方法，并結(jié)合高效液相色譜法和外標法定性定量測定幾種蔬菜樣品中二甲戊樂靈農(nóng)藥的方法。樣品前處理簡便快速，不需要特殊的儀器設(shè)備，有機溶劑用量較少，成本低，方法的推廣性強?；|(zhì)固相分散萃取富集蔬菜樣品中二甲戊樂靈的最佳條件如下：樣品與弗羅里硅土吸附劑的比率為1：4（0.5g樣：2g弗羅里硅土）；洗脫劑為20mL乙酸乙酯，分3次加入。色譜最佳條件：流動相100%甲醇、流速0.8mL/min、柱溫25C、檢測波長235nm。二甲戊樂靈的測定線性范圍為0.02-2.0mg/L、 r0.999。在幾種蔬菜中的加標回收率在84.5-92.5范圍內(nèi)，測定相對標準偏差為2.2-5.2；方法檢出圖4(a) 胡蘿卜MSPD萃取后洗脫液色譜圖Fig. 4(a) Chromatogram of elution solution after extraction of carrot by MSPD圖4(b) 加標胡蘿卜MSPD萃取后洗脫液色譜圖Fig. 4(b) Chromatogram of elution solution after extraction of spiked carrot by MSPD表2 樣品測定結(jié)果 (n=6)Tab. 2 results of determination of samplesmg/kg樣品名稱樣品測得量加標量測得加標量SD回收率，%RSD，%DL（S=3s）馬鈴薯-200171685.53.518-10008864688.65.2-20001.79x1036x1089.53.4胡蘿卜-200169884.54.720-10008842888.43.2-20001.78x1034x1089.02.2山藥-200179689.53.411-10009082490.82.6-20001.85x1034x1092.52.2“-”：未檢出。 限為11-20mg/kg。參考文獻1張智超，曾 敏，李朝陽等. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2005，7（3）：2642 霍江蓮, 李軍，葛毅強等. 分析化學(xué)，2006，34(特刊)：S633 黃雅麗，毛黎娟，吳慧明等. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2004，23（6）：11474李菊清，周孝瑞，曾仲武. 分析化學(xué)，2001，29（5）：6145 杜紅霞，王文博，丁蕊艷等. 化學(xué)分析計量，2006，15（6）：826Garrido-Frenich A, Arrebola F J, Gonzlez-Rodrguez M J et al. 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The effects of different extraction conditions (extraction sorbent, ratio of sample to sorbent, eluting solvent and their amount, and etc.) and determination conditions were studied; and the op