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文檔簡介

血清脂類測(cè)定血漿中的脂類包括膽固醇、膽固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。目前,對(duì)有關(guān)脂類代謝疾患的診斷和治療過程,均必須檢測(cè)血漿(清)中的脂類,通過其含量的變化,對(duì)臨床疾患提供協(xié)助診斷的依據(jù)。有關(guān)醫(yī)學(xué)科研工作,脂類的定量檢測(cè)也是一項(xiàng)必備的研究項(xiàng)目。1膽固醇測(cè)定血漿中膽固醇及其酯的含量檢測(cè),從方法學(xué)上可分為兩大類:一類是化學(xué)法包括抽提法和直接測(cè)定法,這類方法目前仍在沿用;另一類是酶法測(cè)定,方法敏感特異快速,并能自動(dòng)化分析,已常規(guī)應(yīng)用?;瘜W(xué)測(cè)定法種類多,由于顯色反應(yīng)的特異性不同,其結(jié)果有一定的差異。目前公認(rèn)的參考方法是Abell-Kendall(L-B反應(yīng))法。另外,三氯化鐵-硫酸反應(yīng)法(Zak法)具有顯色穩(wěn)定法、操作簡便、靈敏度約5倍于L-B反應(yīng)法,膽固醇酯與游離膽固醇顯色程度比較接近等優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn)是特異性差,干擾因素比L-B法多,如冰醋酸中含有的乙醛酸,血清樣品中的血紅蛋白,膽紅素以及硫酸的質(zhì)量等因素均可影響Zak方法的準(zhǔn)確性,Zak法更適合于科研使用。酶法測(cè)定血清膽固醇的方法已被廣泛采用,國產(chǎn)試劑已能滿足臨床的需要。膽固醇測(cè)定用的標(biāo)準(zhǔn)品,按美國國家標(biāo)準(zhǔn)局(NBS)出品純度達(dá)99.8%,是國際公認(rèn)的參考物,國內(nèi)李健齋等已純化制成符合這一要求的膽固醇純品,已供臨床檢測(cè)血清膽固醇使用。2甘油三酯測(cè)定血漿甘油三酯的測(cè)定,目前多以化學(xué)法和酶法定量。化學(xué)法測(cè)定甘油三酯是以脂蛋白變性,水解成甘油,并以甘油為計(jì)算依據(jù)。酶法是以特異酶水解甘油三酯,除去脂肪酸,再測(cè)定甘油,方法特異,準(zhǔn)確而快速,臨床廣為應(yīng)用。目前甘油三酯測(cè)定的方法主要以定量甘油為依據(jù),然而血清樣品中存在有游離甘油,如何從反應(yīng)過程中的總甘油中減去游離甘油,多年來一直在研究討論這一問題。若不減去,其測(cè)定值將會(huì)高于血清樣品中的真值,如果要減去,就必須先測(cè)出血清樣品中的游離甘油,甘油三酯的測(cè)定方法將增加一個(gè)繁雜的步驟,實(shí)際工作中難以做到。有報(bào)道血清樣品中的游離甘油實(shí)際量是0.070.13mmol/L,相當(dāng)于甘油三酯的0.56.0mmol/L,為此建議,實(shí)測(cè)的甘油三酯量減去一個(gè)校正系數(shù)即:甘油三酯(mmol/L)=0.98總甘油(mmol/L)-0.07(mmol/L)。這一校正系數(shù)也僅適用于健康人,對(duì)臨床病人并不一定適用。據(jù)報(bào)道,血清樣品的游離甘油一直是個(gè)未知數(shù),無法測(cè)準(zhǔn)。為此,目前臨床測(cè)定血清甘油三酯時(shí),基本上未考慮游離甘油,因?yàn)槠浜亢苌伲瑫呵液雎圆挥?。甘油三酯測(cè)定的參考物,推薦三油酸甘油酯和三軟脂酸甘油酯混合物(2:1,W/W),此參考物適用于化學(xué)法。在酶法測(cè)定中,仍以高純度的三油酸甘油酯為參考物。3磷脂測(cè)定血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神經(jīng)磷脂、腦磷脂和其他少量磷脂。如需要分別檢測(cè)各種磷脂,可以通過薄層層析法、柱層析法和高壓液相色譜法。目前,臨床僅測(cè)定血清磷脂總量。血清磷脂總量的測(cè)定方法有化學(xué)方法和酶法兩大類?;瘜W(xué)法是以磷脂中的磷為定量依據(jù),因?yàn)槊苛字肿又卸己幸粋€(gè)磷酸根,故將磷脂的磷稱為脂性磷。由于血清中磷脂大部分為卵磷脂,其分子量中磷約占4%,故將脂性磷換算成磷脂的系數(shù),一般為25。由于化學(xué)法均需要抽提,再測(cè)抽提液中的磷脂的磷,血清中的磷酸鹽不可能混入抽提液中,因此血清中的磷酸鹽對(duì)磷脂測(cè)定的干擾很少。酶法是利用磷脂酶進(jìn)行定量測(cè)定。生物體中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四種。磷脂酶D特異性差,均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神經(jīng)磷脂,三者約占血清總磷脂的95%,臨床多用含磷脂酶D 的試劑進(jìn)行磷脂的定量測(cè)定。4游離脂肪酸測(cè)定游離脂肪酸屬于未酯化的一類脂肪酸,故又稱為非酯化脂肪酸,其量很少,采用方法必須是靈敏的方法,還需要避免脂肪水解產(chǎn)生脂肪酸的干擾。測(cè)定方法有:滴定法需要微量滴定裝置,因?yàn)橐ㄟ^肉眼觀察顏色,難免會(huì)有主觀因素的影響,所以難以測(cè)定準(zhǔn)確,很難用于常規(guī);光度法,以銅皂法常用;酶法,主要采用特異性不強(qiáng)的脂肪酶D進(jìn)行檢測(cè),方法特異,快速準(zhǔn)確,已常規(guī)應(yīng)用于臨床。第一節(jié) 膽固醇測(cè)定血清中膽固醇包括CE和FC,酯型的CE占70%,F(xiàn)C占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下,可分別結(jié)合亞油酸(43%)、油酸(24%)、軟脂酸(10%)、亞麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸結(jié)合而成。血清中膽固醇在LDL中最多,其次是HDL和VLDL、CM最少。血清總膽固醇測(cè)定方法分為化學(xué)法和酶法兩大類。1化學(xué)法化學(xué)法一般包括:抽提;皂化;毛地黃皂苷沉淀純化;顯色比色四個(gè)階段。代表性的方法有Sperry-Webb法,通過步驟操作過程。常規(guī)操作中多采用省去了、?;蛘哂檬∪?、步驟的Zak-Henly法及省去步驟的Abell-Kendall法,現(xiàn)將此法作為標(biāo)準(zhǔn)參考方法予以引用。2酵法測(cè)定CE在膽固醇酯酶(cholesterol esterase)作用下水解成FC和NFFA,TC再經(jīng)膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成4膽甾烯酮和H2O2。再分別定量O2的消耗或者H2O2的生成量,或者4膽甾烯酮生成量,以作為TC的定量依據(jù)。該法是目前常規(guī)的應(yīng)用方法,快速準(zhǔn)確,標(biāo)本用量少,便于自動(dòng)生化分析儀作批量測(cè)定。一、Abell-Kendall改良法1原理血清加入醇溶性氫氧化鉀,使膽固醇從脂蛋白中分離出來,同時(shí)使膽固醇酯加水分解成游離膽固醇,加石油醚振搖、抽提,使膽固醇移入石油醚層,分離并取一定量的石油醚層,蒸發(fā)至干,再進(jìn)行Liebermann-Burchard 顯色反應(yīng),620nm比色定量。該法可用于基本功訓(xùn)練及組織細(xì)胞膽固醇的提取定量。2試劑組成代號(hào)種類濃度組 成貯存28有效時(shí)間R1乙醇優(yōu)質(zhì)純R2石油醚沸點(diǎn)68,特級(jí)純R3水醋酸分析純R4無水醋酸膽固醇分析用,不含HCIR5濃硫酸分析純R6KOH液33%(W/W)KOH10g+H2O 20mlR7乙醇性KOH液R194ml+R66ml臨用前配制R8Liebermann配制后BurchardR420體積+R51體積+R310體積1h試劑*內(nèi)用完R9膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液5.17mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品200mg+R1100ml0*:在三角燒瓶內(nèi),加入無水醋酸,于冰水中冷至10以下,再慢慢加入濃硫酸,混合,靜置10min,又加冰醋酸混勻,備用。3操作 圖15-1 血清膽固醇(Abell法)測(cè)定操作圖4計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST5.17(mmol/L)二、酶法(CEH、COD-POD法)首先將血清中膽固醇酯在膽固醇酯酶(CEH)水解為游離膽固醇和脂肪酸,膽固醇在膽固醇氧化酶(COD)作用下,生成4-膽甾烯酮和H2O2,再H2O2經(jīng)過氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)參與下,生成紅色醌亞胺色素。H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林紅色醌亞胺色素(一)手工測(cè)定法1試劑組成代號(hào)種類濃度組成貯28有效時(shí)間Na2HPO450mmol/LNa2H2PO450mmol/L膽酸鈉3mmol/L4-氨基安替比林0.82mmol/LR1*ESPAS14mmol/L24hCarbowax-60000.17mmol/LCEH33U/LCOD117U/LPOD6700U/LR2標(biāo)準(zhǔn)液5.17mmol/L用異丙醇溶解膽固醇*混勻,調(diào)pH至6.700.10(25),或購買試劑盒。酶以活性單位表示。2操作按圖15-2操作。3計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST5.17(mmol/L)(二)自動(dòng)化分析儀測(cè)定以CL-7200型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)為例。1試劑組成A液:CEH、POD、抗壞血酸氧化酶等。B液:COD、4-氨基安替比林等。圖15-2 血清膽固醇測(cè)定(酶法)操作圖2上機(jī)參數(shù)項(xiàng) 目參 數(shù)方 法終點(diǎn)法波 長雙波長(540nm,700nm)反應(yīng)溫度3

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