血脂各個(gè)項(xiàng)目的不同測(cè)定方法.doc

血清脂類測(cè)定血漿中的脂類包括膽固醇、膽固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。目前，對(duì)有關(guān)脂類代謝疾患的診斷和治療過程，均必須檢測(cè)血漿（清）中的脂類，通過其含量的變化，對(duì)臨床疾患提供協(xié)助診斷的依據(jù)。有關(guān)醫(yī)學(xué)科研工作，脂類的定量檢測(cè)也是一項(xiàng)必備的研究項(xiàng)目。1膽固醇測(cè)定血漿中膽固醇及其酯的含量檢測(cè)，從方法學(xué)上可分為兩大類：一類是化學(xué)法包括抽提法和直接測(cè)定法，這類方法目前仍在沿用；另一類是酶法測(cè)定，方法敏感特異快速，并能自動(dòng)化分析，已常規(guī)應(yīng)用?；瘜W(xué)測(cè)定法種類多，由于顯色反應(yīng)的特異性不同，其結(jié)果有一定的差異。目前公認(rèn)的參考方法是Abell-Kendall(L-B反應(yīng))法。另外，三氯化鐵-硫酸反應(yīng)法（Zak法）具有顯色穩(wěn)定法、操作簡便、靈敏度約5倍于L-B反應(yīng)法，膽固醇酯與游離膽固醇顯色程度比較接近等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是特異性差，干擾因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血清樣品中的血紅蛋白，膽紅素以及硫酸的質(zhì)量等因素均可影響Zak方法的準(zhǔn)確性，Zak法更適合于科研使用。酶法測(cè)定血清膽固醇的方法已被廣泛采用，國產(chǎn)試劑已能滿足臨床的需要。膽固醇測(cè)定用的標(biāo)準(zhǔn)品，按美國國家標(biāo)準(zhǔn)局（NBS）出品純度達(dá)99.8%,是國際公認(rèn)的參考物，國內(nèi)李健齋等已純化制成符合這一要求的膽固醇純品，已供臨床檢測(cè)血清膽固醇使用。2甘油三酯測(cè)定血漿甘油三酯的測(cè)定，目前多以化學(xué)法和酶法定量。化學(xué)法測(cè)定甘油三酯是以脂蛋白變性，水解成甘油，并以甘油為計(jì)算依據(jù)。酶法是以特異酶水解甘油三酯，除去脂肪酸，再測(cè)定甘油，方法特異，準(zhǔn)確而快速，臨床廣為應(yīng)用。目前甘油三酯測(cè)定的方法主要以定量甘油為依據(jù)，然而血清樣品中存在有游離甘油，如何從反應(yīng)過程中的總甘油中減去游離甘油，多年來一直在研究討論這一問題。若不減去，其測(cè)定值將會(huì)高于血清樣品中的真值，如果要減去，就必須先測(cè)出血清樣品中的游離甘油，甘油三酯的測(cè)定方法將增加一個(gè)繁雜的步驟，實(shí)際工作中難以做到。有報(bào)道血清樣品中的游離甘油實(shí)際量是0.070.13mmol/L，相當(dāng)于甘油三酯的0.56.0mmol/L，為此建議，實(shí)測(cè)的甘油三酯量減去一個(gè)校正系數(shù)即：甘油三酯（mmol/L）=0.98總甘油（mmol/L）-0.07（mmol/L）。這一校正系數(shù)也僅適用于健康人，對(duì)臨床病人并不一定適用。據(jù)報(bào)道，血清樣品的游離甘油一直是個(gè)未知數(shù)，無法測(cè)準(zhǔn)。為此，目前臨床測(cè)定血清甘油三酯時(shí)，基本上未考慮游離甘油，因?yàn)槠浜亢苌伲瑫呵液雎圆挥?。甘油三酯測(cè)定的參考物，推薦三油酸甘油酯和三軟脂酸甘油酯混合物（2：1，W/W），此參考物適用于化學(xué)法。在酶法測(cè)定中，仍以高純度的三油酸甘油酯為參考物。3磷脂測(cè)定血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神經(jīng)磷脂、腦磷脂和其他少量磷脂。如需要分別檢測(cè)各種磷脂，可以通過薄層層析法、柱層析法和高壓液相色譜法。目前，臨床僅測(cè)定血清磷脂總量。血清磷脂總量的測(cè)定方法有化學(xué)方法和酶法兩大類?；瘜W(xué)法是以磷脂中的磷為定量依據(jù)，因?yàn)槊苛字肿又卸己幸粋€(gè)磷酸根，故將磷脂的磷稱為脂性磷。由于血清中磷脂大部分為卵磷脂，其分子量中磷約占4%，故將脂性磷換算成磷脂的系數(shù)，一般為25。由于化學(xué)法均需要抽提，再測(cè)抽提液中的磷脂的磷，血清中的磷酸鹽不可能混入抽提液中，因此血清中的磷酸鹽對(duì)磷脂測(cè)定的干擾很少。酶法是利用磷脂酶進(jìn)行定量測(cè)定。生物體中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四種。磷脂酶D特異性差，均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神經(jīng)磷脂，三者約占血清總磷脂的95%，臨床多用含磷脂酶D 的試劑進(jìn)行磷脂的定量測(cè)定。4游離脂肪酸測(cè)定游離脂肪酸屬于未酯化的一類脂肪酸，故又稱為非酯化脂肪酸，其量很少，采用方法必須是靈敏的方法，還需要避免脂肪水解產(chǎn)生脂肪酸的干擾。測(cè)定方法有：滴定法需要微量滴定裝置，因?yàn)橐ㄟ^肉眼觀察顏色，難免會(huì)有主觀因素的影響，所以難以測(cè)定準(zhǔn)確，很難用于常規(guī)；光度法，以銅皂法常用；酶法，主要采用特異性不強(qiáng)的脂肪酶D進(jìn)行檢測(cè)，方法特異，快速準(zhǔn)確，已常規(guī)應(yīng)用于臨床。第一節(jié) 膽固醇測(cè)定血清中膽固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，F(xiàn)C占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分別結(jié)合亞油酸（43%）、油酸（24%）、軟脂酸（10%）、亞麻油酸（6%）、花生四烯酸（6%）、硬脂酸（3%）等脂肪酸結(jié)合而成。血清中膽固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清總膽固醇測(cè)定方法分為化學(xué)法和酶法兩大類。1化學(xué)法化學(xué)法一般包括：抽提；皂化；毛地黃皂苷沉淀純化；顯色比色四個(gè)階段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通過步驟操作過程。常規(guī)操作中多采用省去了、?；蛘哂檬∪?、步驟的Zak-Henly法及省去步驟的Abell-Kendall法，現(xiàn)將此法作為標(biāo)準(zhǔn)參考方法予以引用。2酵法測(cè)定CE在膽固醇酯酶（cholesterol esterase）作用下水解成FC和NFFA，TC再經(jīng)膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase,COD）氧化成4膽甾烯酮和H2O2。再分別定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者4膽甾烯酮生成量,以作為TC的定量依據(jù)。該法是目前常規(guī)的應(yīng)用方法，快速準(zhǔn)確，標(biāo)本用量少，便于自動(dòng)生化分析儀作批量測(cè)定。一、Abell-Kendall改良法1原理血清加入醇溶性氫氧化鉀，使膽固醇從脂蛋白中分離出來，同時(shí)使膽固醇酯加水分解成游離膽固醇，加石油醚振搖、抽提，使膽固醇移入石油醚層，分離并取一定量的石油醚層，蒸發(fā)至干，再進(jìn)行Liebermann-Burchard 顯色反應(yīng)，620nm比色定量。該法可用于基本功訓(xùn)練及組織細(xì)胞膽固醇的提取定量。2試劑組成代號(hào)種類濃度組 成貯存28有效時(shí)間R1乙醇優(yōu)質(zhì)純R2石油醚沸點(diǎn)68，特級(jí)純R3水醋酸分析純R4無水醋酸膽固醇分析用，不含HCIR5濃硫酸分析純R6KOH液33%(W/W)KOH10g+H2O 20mlR7乙醇性KOH液R194ml+R66ml臨用前配制R8Liebermann配制后BurchardR420體積+R51體積+R310體積1h試劑*內(nèi)用完R9膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液5.17mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品200mg+R1100ml0*：在三角燒瓶內(nèi)，加入無水醋酸，于冰水中冷至10以下，再慢慢加入濃硫酸，混合，靜置10min，又加冰醋酸混勻，備用。3操作 圖15-1 血清膽固醇（Abell法）測(cè)定操作圖4計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST5.17(mmol/L)二、酶法（CEH、COD-POD法）首先將血清中膽固醇酯在膽固醇酯酶（CEH）水解為游離膽固醇和脂肪酸，膽固醇在膽固醇氧化酶（COD）作用下，生成4-膽甾烯酮和H2O2，再H2O2經(jīng)過氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS）參與下，生成紅色醌亞胺色素。H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林紅色醌亞胺色素（一）手工測(cè)定法1試劑組成代號(hào)種類濃度組成貯28有效時(shí)間Na2HPO450mmol/LNa2H2PO450mmol/L膽酸鈉3mmol/L4-氨基安替比林0.82mmol/LR1*ESPAS14mmol/L24hCarbowax-60000.17mmol/LCEH33U/LCOD117U/LPOD6700U/LR2標(biāo)準(zhǔn)液5.17mmol/L用異丙醇溶解膽固醇*混勻，調(diào)pH至6.700.10(25)，或購買試劑盒。酶以活性單位表示。2操作按圖15-2操作。3計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST5.17(mmol/L)（二）自動(dòng)化分析儀測(cè)定以CL-7200型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)為例。1試劑組成A液：CEH、POD、抗壞血酸氧化酶等。B液：COD、4-氨基安替比林等。圖15-2 血清膽固醇測(cè)定（酶法）操作圖2上機(jī)參數(shù)項(xiàng) 目參 數(shù)方 法終點(diǎn)法波 長雙波長（540nm，700nm）反應(yīng)溫度3