細胞培養(yǎng)試劑的配置

器材與試劑 干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、磁力攪拌器等具體步驟1. 水： 細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)： 主要用于免疫組化染色時組織或細胞的漂洗溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH調(diào)PH到7.4。移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發(fā)掉的水份。 3. 胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37時，胰酶溶液的作用能力最強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。 稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4內(nèi)過夜。 用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20保存以備使用。 4. 0.05胰蛋白酶0.02%EDTA溶液稱取胰蛋白酶粉末（1：250） 0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔濾膜過濾除菌，分裝，于20保存。5. 青、鏈霉素溶液： 所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。 具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。 分裝于20保存。使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。6. RPMI1640： 溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氫鈉調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。 安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。 抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。 分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4冰箱內(nèi)待用。 使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4時兩周有效）。 7. 血清的滅活： 細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56水浴中滅活30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。 8. HEPES溶液： HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。 1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下： 準確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。0.22um微孔濾膜過濾除菌，分裝后4保存。 注意：因為現(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。 9. 谷氨酰胺： 合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4下放置1周可分解50，故應單獨配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。 一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 10. 肝素溶液的配制： 含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為? 。使用時，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。 11. 型膠原酶： 0.1型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20保存。 12. 明膠溶液： 因為明膠難于過濾，所以配制0.1明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克（配成100ml溶液）即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌操作分裝入50ml小瓶中，4保存。 13. Hanks液： 稱取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4.H2O0.06g，加H2O至 1000ml 注：Hanks液可以高壓滅菌。分裝于4下保存。14. D-hanks液：1液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配500毫升；2液：NaHCO3：0.35g/L，配100毫升；3液：酚紅：0.02g，用數(shù)滴NaHCO3溶解酚紅將2，3液移入1液中。定