ISO-FDIS-4831-2006(E)食品和動物飼料的微生物學-大腸菌群計數(shù)水平法-最大可能數(shù)技術(shù)

ISO/FDIS 4831:2006(E)食品和動物飼料的微生物學 大腸菌群計數(shù)水平法-最大可能數(shù)技術(shù)序ISO是國際標準的全球性組織。準備國際標準這項工作通常由ISO技術(shù)聯(lián)盟來完成。每一個團體成員負責各自的學科。與ISO有合作的國際性機構(gòu)、政府與非政府機構(gòu)，也有參與這項工作。ISO與國際電子組織（IEC）在電子標準化方面有著密切的合作關(guān)系。國際性標準的起草原則在ISO/IEC 細則第三部分中有給出。起草的國際性標準被技術(shù)委員會采用是通過全體成員投票決定的。發(fā)布一個國際性標準需要至少75成員投贊成票。國際性標準ISO 4831 由ISO/IEC 34技術(shù)委員會（農(nóng)產(chǎn)品，小組委員會SC9，微生物）起草的。這個第三版的ISO 4831取代了ISO 4831:1991和ISO 5541-2:1986。ISO 4831:1991的條款4、9和10已作了技術(shù)性的修改。主要的修改內(nèi)容如下：在35下培養(yǎng)這個可選擇的程序已被刪除；檢測和計數(shù)大腸菌群被覆蓋（條況4和9）；MPN和CCT的描述被省略（條況10），可參照ISO 7218?？紤]到本標準的上一個版本已被修改，已確認ISO 4831:1991的選擇性方法不受影響。緒論 由于食品與飼料的種類繁多，這個標準不一定適合某一類產(chǎn)品。在這種情況下，可使用不同的方法，但必須有絕對的技術(shù)上的理由。否則，要盡可能地完全遵循本標準。當這個標準下一次回顧時，將會對這個標準的使用做數(shù)據(jù)統(tǒng)計，特殊產(chǎn)品偏離本標準使用也會做相關(guān)統(tǒng)計。同一類產(chǎn)品的檢測方法也有可能不統(tǒng)一，國際性標準和/或國家標準也不一定完全與本標準相符合。希望相關(guān)標準做回顧時，會遵循本標準做出相關(guān)的修改，以使只有已被證明的技術(shù)上的理由才能與本標準偏離。本標準在技術(shù)上的描述沒有ISO 4832那樣精確，但大部分的微生物檢測能根據(jù)本標準開展，較低數(shù)量的每克或每毫升樣品中的大腸菌群的數(shù)量能給出。此外，由于另外兩個標準中對“大腸菌群”的定義也不一致，因此檢測出的微生物含量也不一定一致。針對一些特殊的產(chǎn)品，方法的選擇可參照相關(guān)的國際性標準?；谝粋€可實行的方法的目的，在條況3中給出的“大腸菌群”的定義并作為操作程序的基礎(chǔ)，并不需要與其它相關(guān)文獻保持一致。在其它文獻中定義的“大腸菌群”，部分通過發(fā)酵管檢測并不能產(chǎn)氣。因此本標準中的檢測方法并不能用于所有其它文獻中提及的“大腸菌群”。1 范圍本標準給出常規(guī)的方法檢測及計數(shù)大腸菌群。它可適用于：人類的食物及動物飼料；食品生產(chǎn)和食品處理領(lǐng)域的環(huán)境樣品。通過液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度控制在30或37，可得出最大可能值（MPN）。注意：必須注意使用的溫度，牛奶或奶制品的培養(yǎng)溫度為30。當估計每克或每毫升樣品的數(shù)量在1到100之間時，可使用本標準檢測。本標準的測試限度已通過大量的實踐得出。在條況11中給出相關(guān)的細則。2 參考文獻本標準的參考文獻如下。已過期的文獻，后來改善或修訂的，部分這種文獻已經(jīng)不適用。未過期的文獻，最新版本都是適用的。ISO 6887（所有部分），食物與動物飼料原料微生物學樣品準備原則，微生物檢測樣品原液及十倍法稀釋第一部分：樣品原液和十倍法稀釋的指導準則。ISO 7218，食物與動物飼料原料微生物學微生物檢驗指導準則。ISO 8261，牛奶和奶制品樣品原液和十倍法稀釋的指導準則。ISO/TS 11133-1，食物與動物飼料原料微生物學準備和配制培養(yǎng)基的指導方針第一部分：實驗室中培養(yǎng)基的配制及質(zhì)控。ISO/TS 11133-2:2003，食物與動物飼料原料微生物學準備和配制培養(yǎng)基的指導方針第二部分：培養(yǎng)基配制的指導方針。3 術(shù)語和定義以下術(shù)語和定義適用于本標準。3.1 大腸菌群在特殊的溫度下（例如30或37），按照本標準的操作，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的一類細菌。3.2 檢測大腸菌群按照本標準操作，檢測在某一類特別的產(chǎn)品中，大腸菌群是否存在。3.3 大腸菌群計數(shù) 按照本標準操作，得出每克或每毫升樣品中大腸菌群的最大可能值。4 原理4.1 大腸菌群檢測4.1.1 樣品接種至選擇性增菌肉湯中，30或37培養(yǎng)24h或48h。4.1.2 當選擇性增菌肉湯出現(xiàn)混濁或/和產(chǎn)氣，轉(zhuǎn)接至確證培養(yǎng)基中，30或37培養(yǎng)24h或48h。4.1.3 當確證培養(yǎng)基中出現(xiàn)混濁和產(chǎn)氣時，可證實大腸菌群的存在。4.2 MPN法計數(shù)4.2.1 當樣品為液體或其它樣品有特定的接種量時，接種三管雙倍濃度的選擇性培養(yǎng)基。4.2.2 當樣品為液體或其它樣品有特定的接種量時，接種三管單倍濃度的選擇性培養(yǎng)基。然后，后續(xù)的十倍稀釋梯度同樣接種三管單倍濃度的選擇性培養(yǎng)基。4.2.3 選擇性培養(yǎng)基試管在30或37下培養(yǎng)，雙倍管培養(yǎng)24h，單倍管培養(yǎng)24h或48h。4.2.4 雙倍管和出現(xiàn)混濁或產(chǎn)氣的單倍管接種至確證培養(yǎng)基中。4.2.5 30或37下培養(yǎng)24h或48h后檢查結(jié)果。4.2.6 計數(shù)確證管的產(chǎn)氣管數(shù)，通過查表可得出每克或每毫升樣品中大腸菌群的最大可能值。5 培養(yǎng)基與稀釋液5.1 概述參照ISO 7218，ISO/TS 11133-1和ISO/TS 11133-2中準備和配制培養(yǎng)基，及培養(yǎng)基性能測試部分。5.2 稀釋液參照ISO 6887（相關(guān)部分），ISO 8261 或相關(guān)的國際性標準。5.3 選擇性增菌培養(yǎng)基：月桂醇硫酸鹽胰蛋白肉湯5.3.1 成分a)雙倍濃度培養(yǎng)基b)單被濃度培養(yǎng)基牛奶和動物蛋白消化酶40g20g乳糖10g5g磷酸氫二鉀5.5g2.75g磷酸二氫鉀5.5g2.75g氯化鈉10g5g硫酸鈉0.2g0.1g水1000ml1000ml5.3.2 準備溶解所有成分或培養(yǎng)基干粉于水中，如需要可加熱。如需要，可在25調(diào)整pH值至6.80.2。分裝培養(yǎng)基至試管中，每管10ml。單倍培養(yǎng)基試管規(guī)格為16mm160mm，雙倍試管規(guī)格為20mm200mm。121滅菌15min。必須保證滅菌后試管中不產(chǎn)生氣泡。5.3.3 培養(yǎng)基質(zhì)量控制參考ISO/TS 11133-1和ISO/TS 11133-2:2003，表B1。5.4 確證培養(yǎng)基：亮綠乳糖膽汁肉湯5.4.1 成分酪蛋白消化酶10g乳糖10g脫水牛膽汁20g亮綠3.3g水1000ml5.4.2 準備溶解所有成分或培養(yǎng)基干粉于水中，如需要可加熱。如需要，可在25調(diào)整pH值至7.20.2。分裝培養(yǎng)基至規(guī)格為16mm160mm試管中，每管10ml。121滅菌15min。必須保證滅菌后試管中不產(chǎn)生氣泡。5.4.3 培養(yǎng)基質(zhì)量控制參考ISO/TS 11133-1和ISO/TS 11133-2:2003，表B1。6 儀器設(shè)備及玻璃器皿一般的微生物實驗室設(shè)備（參照ISO 7218），特別的，增加以下幾項。6.1 干熱滅菌和濕熱滅菌設(shè)備6.2 培養(yǎng)箱，可恒溫351或3716.3 接種環(huán)，白金或鉻化鎳，直徑大概3mm。6.4 試管，規(guī)格16mm160mm和20mm200mm。6.5 發(fā)酵試管，規(guī)格16mm160mm6.6 移液器，1ml 和10ml6.7 pH計7 取樣ISO 6888中并不涉及取樣。如果沒有相關(guān)的國際標準，建議需經(jīng)過多方同意。微生物實驗室接收到的樣品必須是真實代表樣品的，并在運輸和儲藏期間沒有損壞或改變微生物的性狀。8 樣品前處理參照ISO 6887和ISO 8261 進行樣品前處理。如果沒有相關(guān)的國際標準，建議需經(jīng)過多方同意。9 程序（見附錄A）9.1 檢測大腸菌群（見圖1）9.1.1 試驗部分和樣品原液參照ISO 6887和ISO 8261和特殊產(chǎn)品的相關(guān)標準。9.1.2 接種和培養(yǎng)9.1.2.1 根據(jù)檢測限要求，設(shè)液體樣品原液或其它類型樣品的懸液接種量為x ml，當1mlx10ml，接種至10ml雙倍選擇性增菌培養(yǎng)基中（5.3.1a），接種量1ml，接種至10ml單倍選擇性增菌培養(yǎng)基中（5.3.1b）。9.1.2.2 雙倍培養(yǎng)基30或37下培養(yǎng)24h2h。9.1.2.3 單倍培養(yǎng)基30或37下培養(yǎng)24h2h。如果沒有出現(xiàn)混濁或產(chǎn)生氣泡，繼續(xù)培養(yǎng)24h2h。9.1.3 確證實驗（見圖A.3）9.1.3.1 接種9.1.2.2培養(yǎng)物一環(huán)至確證培養(yǎng)管中。30或37下培養(yǎng)24h2h，如果沒有出現(xiàn)混濁或產(chǎn)生氣泡，培養(yǎng)至48h2h。9.1.3.2 接種9.1.2.3呈現(xiàn)混濁或產(chǎn)生氣泡的培養(yǎng)物一環(huán)至確證培養(yǎng)管中。30或37下培養(yǎng)24h2h，如果沒有出現(xiàn)混濁或產(chǎn)生氣泡，培養(yǎng)至48h2h。9.1.4 記錄（見圖A.2）9.1.3.1或9.1.3.2培養(yǎng)24h2h或48h2h產(chǎn)生氣泡，可視為陽性反應。9.2 計數(shù)大腸菌群（MPN）（見圖A.2）9.2.1試驗部分和樣品原液參照ISO 6887和ISO 8261和特殊產(chǎn)品的相關(guān)標準。做適當?shù)南♂屘荻?，確保最后一個梯度為陰性反應。9.2.2 接種和培養(yǎng)9.2.2.1 每一個梯度接種三管。然而，如果需要提供更加精確的數(shù)據(jù)，可增加接種管數(shù)（例如，5管）。在這種情況下，可查詢ISO 7218相關(guān)MPN表。9.2.2.2 準備三管雙倍選擇性增菌培養(yǎng)基。用無菌移液管吸取10ml液體樣品原液或其它類型樣品懸液接種至培養(yǎng)基中。9.2.2.3 準備三管單倍選擇性增菌培養(yǎng)基。使用另一個無菌移液管，用無菌移液管吸取1ml液體樣品原液或其它類型樣品稀釋液接種至培養(yǎng)基中。9.2.2.4 進一步的稀釋梯度，按照9.2.2.3操作。每一個梯度用一個無菌移液器。小心混勻接種液于培養(yǎng)基。9.2.2.5 雙倍培養(yǎng)基30或37下培養(yǎng)24h2h。9.2.2.6 單倍培養(yǎng)基30或37下培養(yǎng)24h2h。如果沒有出現(xiàn)混濁或產(chǎn)生氣泡，繼續(xù)培養(yǎng)24h2h。9.2.3 確證實驗（見圖A.3）9.2.3.1接種9.2.2.5培養(yǎng)物一環(huán)至確證培養(yǎng)管中。30或37下培養(yǎng)24h2h，如果沒有出現(xiàn)混濁或產(chǎn)生氣泡，培養(yǎng)至48h2h。9.2.3.2 接種9.2.2.6呈現(xiàn)混濁或產(chǎn)生氣泡的培養(yǎng)物一環(huán)至確證培養(yǎng)管中。30或37下培養(yǎng)24h2h，如果沒有出現(xiàn)混濁或產(chǎn)生氣泡，培養(yǎng)至48h2h。9.2.3.3 記錄（見圖A.2）9.2.3.1或9.2.3.2培養(yǎng)24h2h或48h2h產(chǎn)生氣泡，可視為陽性反應。10 計算和給出結(jié)果根據(jù)9.1.4的結(jié)果，給出x g或x m