微生物計數(shù)ppt課件

微生物的計數(shù)技術,1,一、測定微生物數(shù)量的方法,直接計數(shù)法（總菌計數(shù)法）顯微鏡直接計數(shù)法間接計數(shù)法稀釋平板計數(shù)法（活菌計數(shù)法）液體稀釋培養(yǎng)法比濁法濃縮法,2,顯微鏡直接計數(shù)法,是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。細菌計數(shù)板（一般）-薄血球計數(shù)板（菌體較大）酵母菌霉菌孢子-厚（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）,3,直接計數(shù)法（總菌數(shù)測定法）,顯微鏡直接計數(shù)法操作（視頻）1、優(yōu)點：所需設備簡單，可迅速得到結果，能同時觀察微生物形態(tài)特征；2、缺點：難以計數(shù)微小的細菌；難與區(qū)分死、活3、適用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細胞菌體的計數(shù),4,血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個方格網(wǎng)。每個方格網(wǎng)共分9大格，其中間的一大格(又稱為計數(shù)室)常被用作微生物的計數(shù)。,血球計數(shù)板,5,計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)室是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即每個大方格都由400個小方格組成。,6,血球計數(shù)板,A.正面圖B.縱切面圖1.血球計數(shù)板2.蓋玻片3.計數(shù)室,7,8,16小格25中格計數(shù)室,25小格16中格計數(shù)室,圖5-2計數(shù)室的兩種刻度形式,9,每個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，每個小方格的面積為1400mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)室(大方格)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為l4000mm3。使用血球計數(shù)板直接計數(shù)時，先要測定每個小方格(或中方格)中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細胞的數(shù)量。,10,已知：1毫升=1cm3=1000mm3cm3體積應含有小方格數(shù)為1000mm3（l4000mm3）X106,11,計數(shù),左上、左下、右上、右下左上、左下、右上、右下、中格（100小格）（80小格）,16中格25小格計數(shù)室,25中格16小格計數(shù)室,12,13,l.菌懸液制備以無菌生理鹽水制成濃度適當?shù)木鷳乙?。每小格內約有35個菌體為宜。2.鏡檢計數(shù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數(shù)。3.加樣品將清潔干燥的血細胞計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數(shù)室不可有氣泡產生。,操作步驟,14,4.顯微鏡計數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細胞計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調節(jié)稀釋度后再計數(shù)。位于中格雙線上的菌體一般只數(shù)上方和左邊線上的。如遇芽胞大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣品的含菌量。5.清洗血細胞計數(shù)板使用完畢后，將血細胞計數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。,15,1.有壓線的菌體，計上不計下，計左不計右。出芽計一半。2.因菌液在血球計數(shù)板處于不同空間，要在不同焦距下才能看全，所以，觀察時必須不斷調細螺旋（調焦距長短），方可找全3.每個樣品重復23次，若兩次差別太大應重測,五、注意事項,16,死、活細菌的區(qū)分,17,間接計數(shù)法,稀釋平板計數(shù)法一般將被檢樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)一定時間后（一般為48小時），記錄每個平皿中形成的菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，進行菌落總數(shù)的測定，每ml(g)樣品中的活菌數(shù)=（每皿菌落數(shù)平均值/取樣體積）稀釋倍數(shù),18,特點,1、由于死亡的細菌不能繁殖成菌落，所以該法只計數(shù)活菌數(shù)；2、該法統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，原因是當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落；3、為使結果接近真實值，可將同一稀釋度菌液加到三個或三個以上的平板上，計算菌落平均數(shù)。4、細菌、放線菌、酵母菌以每個培養(yǎng)皿內有30-300個菌落為宜；霉菌以每個培養(yǎng)皿10-100個為宜。,19,平板菌落計數(shù)法雖然操作較繁，結果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響，但是，由于該計數(shù)方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測,20,用稀釋平板計數(shù)時，待測菌稀釋度的選擇應根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測菌的數(shù)量多時，稀釋度應高，反之則低。,21,通常測定細菌菌劑含菌數(shù)時，10-7、10-8、10-9土壤細菌數(shù)量，采用10-4、10-5、10-6放線菌數(shù)量，采用l0-3、10-4、10-5真菌數(shù)量，采用10-2、10-3、10-4,22,混合平板培養(yǎng)法涂抹平板培養(yǎng)法。,2平板接種培養(yǎng),23,將無菌平板編上10-7、10-8、10-9號碼，每一號碼設置三個重復，用無菌吸管按無菌操作要求吸取10-9稀釋液各1ml放入編號10-9的3個平板中，同法吸取10-8稀釋液各lml放入編號10-8的3個平板中，再吸取10-7稀釋液各lml放入編號10-7的3個平板中（由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換）。然后在9個平板中分別倒入已融化并冷卻至4550的細菌培養(yǎng)基，輕輕轉動平板(P112)，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養(yǎng)。至長出菌落后即可計數(shù)。,（1）混合平板培養(yǎng)法,24,（2）涂抹平板計數(shù)法,涂抹平板計數(shù)法與混合法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上（每個編號設三個重復）。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻，每個稀釋度用一個滅菌刮鏟，更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上2030min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內，然后將平板倒轉，保溫培養(yǎng)，至長出菌落后即可計數(shù)。,25,基本操作一般包括：樣品的稀釋傾注平皿培養(yǎng)48小時計數(shù)報告。,26,結果計算,計算結果時，常按下列標準從接種后的3個稀釋度中選擇一個合適的稀釋度，求出每克菌劑中的含菌數(shù)。(1）同一稀釋度各個重復的菌數(shù)相差不太懸殊。（2）細菌、放線菌、酵母菌以每皿30300個菌落為宜，霉菌以每皿10100個菌落為宜。選擇好計數(shù)的稀釋度后，即可統(tǒng)計在平板上長出的菌落數(shù)，統(tǒng)計結果按下式計算。,27,每ml(g)樣品中的活菌數(shù)=（每皿菌落數(shù)平均值/取樣體積）稀釋倍數(shù),混合平板計數(shù)法：每ml(g)樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)涂抹平板計效法：每ml(g)樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數(shù)10稀釋倍數(shù),28,將實驗結果填入下表中,29,菌落計數(shù)規(guī)則：,（一）選擇平均菌落數(shù)在30300間的平板1、只有一個稀釋度符合，以該稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；2、有兩個稀釋度符合，取決于二者比值（高稀釋度的菌落數(shù)除以低稀釋度的菌落數(shù)的值）