課題2　土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù).ppt

土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù),課題背景:,1、尿素,尿素CO(NH2)2重要的農(nóng)業(yè)氮肥。只能被土壤中細菌分解為NH3才能被植物吸收利用.,2、細菌利用尿素的原因,CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3,3、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌(分離),統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌(計數(shù)）,研究思路,（一）篩選菌株,（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目,（三）設(shè)置對照,1、實例：,啟示：,原因：因為熱泉溫度70800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細菌被篩選出來。,耐高溫（930C）的DNA聚合酶是從熱泉中的耐熱細菌Taq中分離得到的。,（一）篩選菌株,自然界中的菌株篩選原理：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等，同時抑制或阻止其他微生物生長。,選擇性培養(yǎng)基：,2、實驗室中微生物的篩選原理：,允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,3、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素,此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌？為什么？,能。只有產(chǎn)生脲酶的細菌能利用尿素作為氮源而生存。,以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基,常見的選擇培養(yǎng)基：,分離酵母菌、霉菌等,分離金黃色葡萄球菌,分離固氮菌,分離自養(yǎng)型微生物,加入青霉素的培養(yǎng)基:,加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:,不加氮源的培養(yǎng)基:,不加有機碳源的培養(yǎng)基:,以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基:,分離分解尿素的細菌,以石油為唯一碳源的培養(yǎng)基:,分離分解石油的細菌,無氧條件下培養(yǎng):,分離厭氧和兼性厭氧微生物,1、顯微鏡直接計數(shù)法：,利用血球計數(shù)板或細菌計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,不能區(qū)分死菌、活菌,（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目,每mL原菌液含菌株數(shù),稀釋倍數(shù),（1）原理：,（2）特點：,（3）計算：,每中方格平均菌株數(shù),每中方格體積,計數(shù)室：,計數(shù)室的總體積：1mmx1mmx0.1mm=0.1mm3,計數(shù)室規(guī)格：1個大方格里有25個中方格，1個中方格里有16個小方格，共：25x16=400個小方格，每個中方格體積：0.1/25=4x10-3mm3,計數(shù)方法：類似五點取樣法（計上不計下，計左不計右）,求平均值，再乘以稀釋倍數(shù)。,2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法/稀釋涂布平板法）,當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板菌落數(shù)就能推測出樣品中大致的活菌數(shù)。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M,其中，C：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V：涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)M：稀釋倍數(shù)。,（3）計算：,（1）原理：,（2）特點：,只能對活菌計數(shù),例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。你認為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？,甲：沒有重復(fù)實驗（至少涂布3個平板）乙：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值,?,為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行計數(shù)。為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度下至少涂布三個或三個以上的平板，計算菌落平均數(shù)。統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。,（4）注意事項：,利用選擇培養(yǎng)基進行尿素分解菌的分離過程中，從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，A、B兩同學(xué)分別得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1、A同學(xué)篩選出150個菌落。2、B同學(xué)篩選出50個菌落。,?,可能原因：土樣不同A培養(yǎng)基污染或操作失誤,A同學(xué)操作無誤，請你幫助A同學(xué)改進實驗，證明培養(yǎng)基是否被污染。,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進行實驗,方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣樣液的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。,主要目的：排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。,（三）設(shè)置對照,（1）判斷培養(yǎng)基是否被污染：用未接種的相同培養(yǎng)基做空白對照，若沒有菌落生長就未被污染。,（2）判斷培養(yǎng)基是否有篩選作用：用普通的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基同等條件下接種培養(yǎng)，若其上的菌落數(shù)明顯大于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)則有篩選作用。,以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,是,分離尿素細菌,判斷該培養(yǎng)基有無選擇性,只生長尿素細菌,生長多種微生物,是,實驗設(shè)計,（一）土壤取樣肥沃、濕潤（富含有機質(zhì)）接近中性鏟去表層土，3-8cm土壤層取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。（二）制備培養(yǎng)基：分別制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行,（三）樣品的稀釋與涂布,實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,分離不同的微生物采用不同的稀釋度涂布,原因：不同微生物在土壤中含量不同,(1)作樣品系列稀釋液(2)用適當?shù)南♂屢和坎计桨?思考：除了每個稀釋度下至少涂布三個平板，還需要涂布什么平板？,1、培養(yǎng)：細菌：3037，12d;放線菌:2528,57d;霉菌:2528,34d.2、觀察：a.每24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目b.以“穩(wěn)定菌落”為觀察對象c.比較牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)和選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)多少。,（四）微生物的培養(yǎng)與觀察,在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出相同而穩(wěn)定的菌落特征。,關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，菌落的特征是鑒定菌種的重要依據(jù)。,（六）鑒定,1、含酚紅的以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基（鑒定分解尿素的細菌）,原理：,脲酶催化尿素分解成氨培養(yǎng)基PH升高酚紅變紅脲酶陽性,（鑒別培養(yǎng)基）,大腸桿菌菌落呈黑色,2、伊紅美藍培養(yǎng)基（鑒定大腸桿菌）,1.結(jié)合對照，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)