單抗系列培訓(xùn)完整版PPT

單克隆抗體,分享人：李行,2017.08,單抗基本概念,單抗發(fā)展歷程,單抗制備原理,單抗實(shí)際應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)存在的問題,報(bào)告內(nèi)容,單抗簡介,1975年Kohler和Milstein建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合，創(chuàng)立了第一個B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，獲得了抗SRBC的單克隆抗體。單抗技術(shù)的問世，不僅帶來了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域獲得極廣泛的應(yīng)用，促進(jìn)了眾多學(xué)科的發(fā)展。因此說單抗技術(shù)是免疫學(xué)，乃至醫(yī)學(xué)史上的一個里程碑。,抗體生產(chǎn)技術(shù)的三個時代：多克隆抗體單克隆抗體基因工程抗體,1.抗原1.1傳統(tǒng)抗原基本概念：能啟動機(jī)體的免疫應(yīng)答，且能與其免疫應(yīng)答產(chǎn)物(抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞)特異性結(jié)合，并產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)。,1.2現(xiàn)代抗原概念：能被B細(xì)胞免疫球蛋白受體識別或與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）結(jié)合后能被T細(xì)胞受體識別的物質(zhì)統(tǒng)稱為抗原。,1.3抗原的兩種基本特性：（1）免疫原性：指抗原分子能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞）的性質(zhì)。,（2）反應(yīng)原性：指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞）發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。,1.4完全抗原與半抗原,（1）完全抗原：具有免疫原性和反應(yīng)原性的物質(zhì)。（2）半抗原又稱不完全抗原：無免疫原性，只有抗原性的物質(zhì)。（3）載體（carrier）：與半抗原結(jié)合使其成為免疫原的物質(zhì)。如BSA，OVA半抗原+載體完全抗原,1.5抗原表位（抗原決定簇）：指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。即抗原上可以引起機(jī)體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)。一個抗原可以有許多不同的抗原決定簇。,抗體（Antibody,Ab）基本概念：機(jī)體免疫細(xì)胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B細(xì)胞-漿細(xì)胞合成、分泌的一類能與抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的免疫球蛋白。,3.免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）：具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。,2.抗體,備注：Ab=Ig,IgAb,Ab是功能描述，Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的描述。,基本結(jié)構(gòu)：重鏈（heavychain，H）2條輕鏈（lightchain，L）2條可變區(qū)（variableregion,V區(qū)）恒定區(qū)（constantregion,C區(qū)）超變區(qū)（hyper-variableregion,HVR),又稱互補(bǔ)決定區(qū)（complementarydeterminingregion,CDR）骨架區(qū)（frameworkregion,FR）鉸鏈區(qū)（hingeregion）,3.1免疫球蛋白的結(jié)構(gòu),可變區(qū),Ig的兩條長鏈稱為重鏈（Heavychain，H鏈），重鏈可分為：，對應(yīng)的Ig的種類：IgM,IgG,IgA,IgD,IgE.,Ig的兩條短鏈稱為輕鏈，可分為，；每個Ig分子的兩條輕鏈完全相同。,4.多克隆抗體（polyclonalantibody,PcAb）：指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如：免疫血清（含多種特異性抗體）。,5.單克隆抗體（monoclonalantibody，McAb）：是由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對復(fù)合抗原分子上某一單個抗原決定簇的特異性抗體。,6.細(xì)胞克隆：由一個細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞群體。,克隆能夠保持親本的絕大部分性狀。,8.多克隆抗體和單克隆抗體的優(yōu)劣勢,融合,在具有篩選作用的培養(yǎng)基中培養(yǎng),篩選出分泌抗體的細(xì)胞，進(jìn)行克隆化,SP2/0,B細(xì)胞和SP2/0死亡,1.抗原制備不管是制備單抗還是多抗，抗原的設(shè)計(jì)與制備都是一個非常重要的問題，設(shè)計(jì)或者制備得不好的抗原有可能完全不能免疫出抗體來。,1.1一個良好的抗原必須具備的條件：（1）分子量：一般是分子量越大，免疫原性越強(qiáng)，對于多肽或蛋白質(zhì)類的抗原來說，一個抗原決定簇（又叫表位，epitope），通常由6-8個氨基酸殘基組成。而平均每5-10kD才有一個表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很難有一個表位的。,（2）化學(xué)結(jié)構(gòu)與組成：結(jié)構(gòu)盡量復(fù)雜。簡單重復(fù)的物質(zhì)是不具有免疫原性的，拿明膠來說，它的分子量非常大，而且外源性也很強(qiáng)，但是組成明膠的氨基酸多為直鏈氨基酸，在體內(nèi)容易被降解，因此它的免疫原性很弱。蛋白質(zhì)：a.氨基酸組成：含芳香族氨基酸（特別是酪氨酸），免疫源性強(qiáng)。b.結(jié)構(gòu)：環(huán)狀的免疫原性強(qiáng)；直鏈，免疫原性弱。多糖：具有免疫原性，較蛋白質(zhì)弱。核酸：多無免疫原性。,（3）外源性強(qiáng)。在個體形成的早期就對自身物質(zhì)形成了免疫耐受，因此如果和機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)完全一樣或者是相似就很難引起機(jī)體的免疫應(yīng)答。,（4）可降解性好。作為抗原，必須是可以降解的，塑料、不銹鋼等難降解的物質(zhì)免疫原也很弱。含L-氨基酸的蛋白質(zhì)易降解，具有免疫原性。但是由D-型氨基酸組成的物質(zhì)免疫原性很弱，同樣是因?yàn)闄C(jī)體不能降解D-氨基酸組成的蛋白或多肽。,2.免疫方案,2.1動物的選擇：常見的可以用來制備抗體的動物有：小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、綿羊、山羊、馬、驢、奶牛，還有用雞或者鴨的。需考慮的問題：第一個問題是能否具有較好的免疫效果.第二個問題是抗血清產(chǎn)量的問題.,2.2免疫佐劑：先于免疫原或同時與抗原混合注射機(jī)體可增強(qiáng)抗原的免疫原性的物質(zhì)。,（1）顆?？乖庖咝詮?qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果，如細(xì)胞類抗原、電泳跑蛋白膠。（2）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑。油性佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑；無機(jī)化合物微生物及其產(chǎn)物脂質(zhì)體細(xì)胞因子,2.4抗原與佐劑的乳化,2.5免疫途徑：（1）體內(nèi)免疫：皮下，腹腔，肌肉，靜脈等（2）體外免疫：較少。,2.3免疫劑量：根據(jù)免疫原、免疫途徑、免疫動物、免疫佐劑有關(guān)。一般的免疫劑量是微克級別。,2.6免疫時間間隔：一般間隔2-3個星期。,抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律,初次應(yīng)答：抗原初次進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生的應(yīng)答。,特點(diǎn)：潛伏期（誘導(dǎo)期）長（7-10天）；抗體的種類以IgM為主；抗體的親和力低；維持時間短；總抗體水平低。,再次應(yīng)答：抗原再次進(jìn)入機(jī)體所產(chǎn)生的應(yīng)答。,特點(diǎn)：潛伏期短（約2-3天）；抗體的種類以IgG為主；抗體的親和力比初期應(yīng)答明顯增強(qiáng)；維持時間長；總抗體水平高。,3.免疫鼠血清的采集和檢測,小鼠第三次免疫1周后，免疫組對小鼠進(jìn)行眼球靜脈采血，收集血清，血清交由檢測負(fù)責(zé)人，該負(fù)責(zé)人對血清進(jìn)行檢測。,（1）免疫酶技術(shù)：ELISA，IPMA（2）免疫熒光技術(shù)：IFA（3）間接血凝實(shí)驗(yàn)（4）放射免疫檢測,4.雜交瘤細(xì)胞株的建立,SP2/0的準(zhǔn)備,飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備,脾細(xì)胞（B細(xì)胞）的制備,脾細(xì)胞和SP2/0的融合,單克隆抗體的制備與鑒定,雜交瘤的篩選,細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇,實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵！,4.1試劑和耗材,4.1.1試劑：DMEM、胎牛血清（FBS）、HAT、HT、50%PEG，青、鏈霉素、生理鹽水;,4.1.2儀器：生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平離心機(jī)、倒置顯微鏡；,工具：止血鉗，剪刀、直頭眼科鑷子、彎頭眼科鑷子,4.2,進(jìn)行細(xì)胞融合的前一天，準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞：8-10周齡BALB/c雌性小鼠;用注射器向腹腔內(nèi)注射DMEM，輕輕揉壓小鼠腹膜，抽出腹腔內(nèi)液體，收集到一個離心管中，反復(fù)操作3次左右;離心1000rpm,5min,棄上清，重懸細(xì)胞，鋪板密度2x105。,實(shí)驗(yàn)流程,4.2.2準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞:取靜止?fàn)顟B(tài)的腹腔巨噬細(xì)胞,4.2.1骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的培養(yǎng)：對數(shù)生長期,4.2.3脾細(xì)胞（B細(xì)胞）的制備：融合前3天加強(qiáng)免疫小鼠,（1）注射器反復(fù)吹打法（2）研磨法,（1）生物方法：病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合（2）化學(xué)誘導(dǎo)：PEG誘導(dǎo)50%PEG(10004000)（3）物理誘導(dǎo)：電融合,4.2.4脾細(xì)胞和SP2/0的融合：融合方法主要有以下幾種方法,細(xì)胞融合,融合過程中的注意事項(xiàng)：（1）SP2/0細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞的數(shù)量比例適當(dāng)，1:5-1:10；（2）兩種細(xì)胞狀態(tài)要好，洗吹細(xì)胞一定要輕柔；（3）PEG融合之后，加培養(yǎng)基中和時要緩慢，以免破壞融合的細(xì)胞。,雜交瘤細(xì)胞的篩選（第一次篩選）,5、陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選（第二次篩選）：篩選時機(jī)的把握,（1）免疫酶技術(shù)：ELISA應(yīng)用最多。,（2）免疫熒光技術(shù)：IFA（3）間接血凝實(shí)驗(yàn)（4）放射免疫檢測（5）免疫印跡分析（6）免疫沉淀（7）免疫組化和功能中和試驗(yàn),重要思考：“你的抗體用于什么就用什么去篩”，篩選策略必須能夠反映所需抗體隨后的用途。,選擇篩選策略時，必須要考慮下面的因素：（1）能夠處理多達(dá)1000個樣品（約120ul/樣品）的能力；（2）48h內(nèi)能夠完成鑒定的能力；（3）是否具備必要的試劑/設(shè)備；（4）反應(yīng)的特異性；（5）實(shí)驗(yàn)體系的靈敏度；（6）最重要的是否能得到結(jié)果。,篩選時融合前的免疫血清作為陽性對照，這樣確保所有的技術(shù)、試劑、設(shè)備是最合適的。同樣，用培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基作為陰性對照。,6、雜交瘤細(xì)胞的克隆化：指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開。6.1克隆化的原則：盡早進(jìn)行，一般要進(jìn)行2-3次克隆。,6.3克隆化的方法主要包括以下：,克隆之前制備飼養(yǎng)細(xì)胞,6.2,（1）有限稀釋法:其原理是，將培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞用槍或吸管吹打使之懸浮，然后用計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后按每孔0.5-1個細(xì)胞的量將原孔細(xì)胞稀釋滴至新的培養(yǎng)板上（事先制備好飼養(yǎng)層細(xì)胞），培養(yǎng)一段時間以后就可以看到部分孔有單個克隆形成（理論上講最終每孔的細(xì)胞個數(shù)在整體上服從泊松分布）優(yōu)點(diǎn):a、最簡單的克隆化方法；b、不需要太多的儀器設(shè)備，操作也不復(fù)雜。缺點(diǎn)：a、由于計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確或者移液器的偏差，最終導(dǎo)致操作結(jié)果不理想；b、由于細(xì)胞經(jīng)過吹打的剪切力破壞，細(xì)胞也不一定能夠按期望生長。,（2）半固體培養(yǎng)法:原理和做分子克隆時的菌落篩選有點(diǎn)類似半固體培養(yǎng)原理和做分子克隆時的菌落篩選有點(diǎn)類似;其方法是將雜交瘤細(xì)胞與液體低融點(diǎn)的瓊脂糖或甲基化纖維素溶液混合，然后將其倒入含有事先制備的飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板上，冷后后培養(yǎng)基呈固態(tài)，在37培養(yǎng)一段時間后，單個雜交瘤細(xì)胞會形成類似菌落的小克隆，可以用槍頭將其挑出到培養(yǎng)板上在液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)，這樣也可以實(shí)現(xiàn)克隆化。優(yōu)點(diǎn)：a、操作比較直觀簡單，缺點(diǎn)：對半固體培養(yǎng)基的要求比較高，容易出現(xiàn)細(xì)胞不生長或者污染情況發(fā)生。,（3）顯微操作法把陽性孔里的細(xì)胞稀釋到足夠稀，靜置半小時后細(xì)胞會沉淀到孔底，然后在顯微鏡下用槍直接吸取一個單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的孔內(nèi)培養(yǎng)即可。優(yōu)點(diǎn)：最初級、最直觀、最省腦力和人力的辦法，步驟簡單。,（4）熒光激活細(xì)胞分離法：流式細(xì)胞術(shù),7.細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇,及時對各階段陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行凍存,凍存步驟：（1）吹下需凍存的細(xì)胞；（2）1000rpm離心5min，棄上清；（3）用凍存液將細(xì)胞重懸，之后凍存；（4）將細(xì)胞放入細(xì)胞凍存盒內(nèi)，然后將其直接放入-80冰箱過夜（不小于12h），之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中。,細(xì)胞復(fù)蘇步驟：（1）從液氮中取出細(xì)胞，迅速置于37水浴鍋中融化細(xì)胞；-快?。?）直接將細(xì)胞加入瓶（25cm2）中，并加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng),12小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。,8.單克隆抗體的生產(chǎn),8.1在產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞分離、克隆并凍存建庫后，擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞可以生產(chǎn)抗體。處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清可產(chǎn)生3-20ug/ml的抗體。-抗體產(chǎn)量低,8.2目前單克隆抗體生產(chǎn)包括腹水制備和細(xì)胞培養(yǎng)兩種方法。,8.2.1腹水制備流程：（1）提前7天，小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油；（2）小心吹打細(xì)胞瓶底部，使細(xì)胞從瓶底脫落，收集細(xì)胞；（3）室溫1200r/min離心6min，棄上清；（4）用不完全培養(yǎng)液DMEM或生理鹽水按照0.5ml/只鼠懸浮細(xì)胞；（5）將細(xì)胞懸液注射到小鼠腹腔；（6）7-10天后小鼠腹腔明顯鼓起后，采集腹水。,8.2.2細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)單抗：利用滾瓶、轉(zhuǎn)瓶和CELLine瓶制備單抗。（1）在單克隆抗體的產(chǎn)量方面，滾瓶和轉(zhuǎn)瓶較一般的細(xì)胞培養(yǎng)瓶只有少許優(yōu)勢。（2）CELLine：膜式雙室技術(shù)的一種的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。,9、單抗特性的檢測：,9.1抗體特異性：除用抗原進(jìn)行抗體檢測，還應(yīng)用與抗原成分相關(guān)的其他抗原進(jìn)行交叉實(shí)驗(yàn)，方法：ELISA等。9.2單克隆抗體亞類的鑒定商品化試劑盒9.3WesternBlot分析9.4抗體的中和活性9.5抗體的親和力9.6抗體對應(yīng)抗原的分子量9.7抗體的識別表位,10.抗體純化,（1）初步純化鹽析法有機(jī)沉淀法凝膠過濾法（2）精細(xì)純化親和層析法離子交換層析法疏水層析法反向?qū)游龇?生物安全柜,II級A2型生物安全柜最常用,生物安全水平與實(shí)驗(yàn)室類型,世界通用生物安全水平標(biāo)準(zhǔn)是由美國疾病控制中心(CDC)和美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)建立的。,級生物安全柜是一種負(fù)壓過濾排風(fēng)柜。防止操作者和環(huán)境暴露于實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的生物氣溶膠。（1）保護(hù)實(shí)驗(yàn)操作者在操作時，室內(nèi)空氣被抽入前面的格柵，產(chǎn)生一個空氣屏障，防止有生物危險(xiǎn)的懸浮微粒散入室內(nèi)。（2）保護(hù)實(shí)驗(yàn)樣品層流的、HEPA過濾的空氣向下，通過工作面，防止室內(nèi)空氣進(jìn)入，防止樣品存在交叉污染。（3）保護(hù)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境在空氣離開柜前，必須通過一個排氣HEPA濾膜，確保排出柜體的氣流是潔凈的，對環(huán)境無害。,細(xì)胞培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,含血清的DMEM,96孔細(xì)胞板,48孔細(xì)胞板,24孔細(xì)胞板,6孔細(xì)胞板,1.為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低？,（1）設(shè)計(jì)的抗原與被免疫的動物內(nèi)源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對于前一種情況應(yīng)該重新設(shè)計(jì)抗原，設(shè)計(jì)抗原時盡量選取目標(biāo)蛋白特異性的序列，可以設(shè)計(jì)為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免疫；對于后一種情況，首先確認(rèn)抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法；制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑、載體、抗原與載體的連接比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)；如果偶聯(lián)沒有問題，可以更換其它的載體蛋白，如KLH。,（2）免疫的周期不正確。免疫周期過長或過短，各免疫步驟之間的間隔過長或過短都有可能影響免疫效果。,（3）免疫佐劑不合適。弗氏佐劑也不能保證完全有效，TiterMax等佐劑在免疫時，對于某些抗原可能效果不佳，此時可以考慮更換佐劑嘗試。,（4）免疫劑量不合理。過大的免疫劑量可能導(dǎo)致免疫耐受，過少的免疫劑量可能無法激活免疫應(yīng)答。,（5）免疫途徑不合理。,（6）測效價的過程存在錯誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時，一抗（即血清）稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1:500或1:1000開始作梯度稀釋。對于多肽和小分子物質(zhì)，效價達(dá)到1:2000甚至更低仍可視為免疫成功。,（7）動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。,2.為什么融合后細(xì)胞不長或者融合后克隆很少？（1）免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物一般應(yīng)該與骨髓瘤來源的動物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞時應(yīng)該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品系純正的小鼠。（2）培養(yǎng)基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。（3）培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清。（4）未正確制備飼養(yǎng)細(xì)胞。（5）接種雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。,（6）細(xì)胞被污染。在顯微鏡下仔細(xì)觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應(yīng)該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。（7）細(xì)胞培養(yǎng)條件不正確。確保細(xì)胞培養(yǎng)在恒定的37較濕的環(huán)境，同時保證CO2濃度在4-5%左右。（8）其它與融合條件相關(guān)的不恰當(dāng)?shù)囊蛩亍?3.為什么融合后得不到陽性克?。浚?）動物未免疫成功就進(jìn)行了融合。（2）融合后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機(jī)率也較小。（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不可以直接包被到酶標(biāo)板上，再如使用了不適當(dāng)?shù)亩沟戎T多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷。（4）抗原成份與細(xì)胞培養(yǎng)條件中的物質(zhì)相同或類似，或者與篩選過程中有同抗原結(jié)構(gòu)相同或類似的物質(zhì)產(chǎn)生了競爭反應(yīng)。如果需要制備抗BSA的單抗，則養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結(jié)合，最后做ELISA篩選的時候無法得到陽性結(jié)果。解決的辦法只有使用其它的動物的血清或者使用無血清培養(yǎng)基。再如，如果需要制備酪蛋白的單抗，則做ELISA篩選時，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。（5）其它所有能影響ELISA等相關(guān)篩選手段的因素。,4.為什么細(xì)胞生長很慢？（1）使用了劣質(zhì)的培養(yǎng)耗材、培養(yǎng)基、血清、HAT或HT。建議新手使用知名廠商的試劑或耗材。對于血清，可能需要從多個廠家選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在試用血清的時候，一般可以使用相對較低濃度的血清進(jìn)行骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的倍增速度確實(shí)血清質(zhì)量。（2）使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細(xì)檢查配方是否正確。（3）制備飼養(yǎng)細(xì)胞的方法不正確。,5.克隆原來檢測是陽性的，為什么后來轉(zhuǎn)為陰性了？首先要注意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對穩(wěn)定的，確實(shí)容易發(fā)生染色體丟失的情況，尤其是當(dāng)細(xì)胞移到新環(huán)境中生長，如從小孔擴(kuò)大到大孔，或者復(fù)蘇操作時，更容易發(fā)生陽性變?yōu)殛幮浴５且灿幸恍┺k法盡量減少陽性變?yōu)殛幮?，一般可以從這幾個方面加以注意：（1）永遠(yuǎn)保證細(xì)胞處在最佳的生長環(huán)境中。尤其是培養(yǎng)基不能長期不換，一般來說，當(dāng)細(xì)胞增長到一定密度的時候，培養(yǎng)基就開始變顏色，這個時候就要準(zhǔn)備換培養(yǎng)基了。除了換培養(yǎng)基，同時應(yīng)該控制好細(xì)胞的密度，可以吹走過多的細(xì)胞，使新加入的培養(yǎng)基不至于很快被消耗。（2）對于重要的細(xì)胞株，每一步都把陽性的細(xì)胞保種。（3）不要過于頻繁操作細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細(xì)胞容易出現(xiàn)死亡或者生長形態(tài)發(fā)生明顯變化。,（4）對于傳代次數(shù)較多的細(xì)胞株需要經(jīng)常進(jìn)行亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。（5）當(dāng)細(xì)胞被支原體等微生物污染，也會發(fā)生由陽性轉(zhuǎn)為陰性的情況。,6.為什么亞克隆后長不出克隆來？（1）亞克隆時，原始孔里的細(xì)胞狀態(tài)不好，經(jīng)過有限稀釋或其它手段亞克隆的細(xì)胞活性很差，以至于長不出克隆。（2）亞克隆時，沒有按照正確的數(shù)量取出細(xì)胞，亞克隆的過程服從泊松分布，如果取出的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個細(xì)胞，或有效細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個細(xì)胞，則也可能出現(xiàn)長不出克隆的結(jié)果。（3）未添加飼養(yǎng)細(xì)胞。單個細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中極難培養(yǎng)，如果不添加飼養(yǎng)細(xì)胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長不出克隆。,（4）使用的HAT中HT失效或A的濃度過高，或者未添加HT。雖然HT對雜交瘤的生長并不是必須的，但是HT確實(shí)可以加快細(xì)胞生長，改善細(xì)胞生長狀態(tài)。（5）使用無血清培養(yǎng)基。這一點(diǎn)是很冷僻的一個因素。雖然很少有人使用無血清培養(yǎng)基制備單抗，但是在某些血清可能干預(yù)篩選步驟的實(shí)驗(yàn)的時候，可能會選用無血清培養(yǎng)基來培養(yǎng)雜交瘤，但是需要注意的是，在很多種無血清培養(yǎng)基中，單個細(xì)胞是很難長成克隆的。最好的解決辦法就是先用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)它們，等克隆長出后再把培養(yǎng)基徹底更換為無血清培養(yǎng)基。,7.為什么凍存的細(xì)胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活？這個問題要從兩個方面來回答，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問題。7.1對于凍存過程，需要注意：（1）凍存液的配方。這個問題很關(guān)鍵，一個良好的凍存液配方可以使細(xì)胞保存得非常好，而一個不好的凍存液配方可能會讓細(xì)胞傾刻死亡。凍存保護(hù)劑DMSO的含量非常重要，如果這個濃度過低，則起不到保護(hù)作用，凍存的細(xì)胞最終會死于冰晶形成時的張力，如果濃度過高，則細(xì)胞中毒而亡。,（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細(xì)胞的時候更是要輕柔，因?yàn)樵贒MSO存在的條件下，細(xì)胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛，則細(xì)胞膜很容易破，復(fù)蘇成活的機(jī)會就明顯會下降。（3）凍存的程序也非常重要。實(shí)踐表明，以每分鐘1的速度下降凍存細(xì)胞是最理想的。,（5）保證被凍存的細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)，并且沒有被污染。,（4）如果條件簡易，可以把細(xì)胞放在4半小時左右，然后再在-20放置1小時，最后轉(zhuǎn)入-80放置過夜，最終轉(zhuǎn)入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80也行。現(xiàn)在有細(xì)胞凍存盒，把需要存放的細(xì)胞放進(jìn)去，然后直接放-80就行，等時間夠長后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。,7.2對于復(fù)蘇過程，需要注意：（1）快速融化。為了防止升溫中細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，強(qiáng)烈建議加快融化過程。一般都要用足夠體積的37熱水復(fù)蘇，并不斷晃動凍存管。（2）復(fù)蘇過程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能污染管口，造成復(fù)蘇的細(xì)胞被污染。（3）如果復(fù)蘇細(xì)胞時，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO帶到了新的培養(yǎng)體系里，容易對細(xì)胞造成毒害，所以對于貼壁細(xì)胞貼壁后換液或者細(xì)胞離心后去掉凍存液，然后用新的完全培養(yǎng)基重懸，再接種到新的容器內(nèi)培養(yǎng)。,8.單克隆抗體制備細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最棘手的問題-細(xì)胞污染,細(xì)胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞變異的異物。細(xì)胞培養(yǎng)污染可分為以下三類:物理性、化學(xué)性及生物性。,8.1物理性污染的來源、危害及預(yù)防物理性污染通過影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分,從而影響細(xì)胞的代謝。（1）培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細(xì)胞產(chǎn)生影響。（2）細(xì)胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改變,如細(xì)胞同步化、細(xì)胞生長受抑制甚至細(xì)胞死亡。,（3）防范措施：通過實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)及建立規(guī)范的操作規(guī)程，可以減少環(huán)境中物理因素對細(xì)胞的影響。培養(yǎng)箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機(jī)械振動的設(shè)備，如離心機(jī)。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時間后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免過冷的溫度對細(xì)胞的影響。,8.2化學(xué)性污染的來源、危害及預(yù)防培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染。化學(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長。不同細(xì)胞對化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超過了合適的范圍，也會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細(xì)胞系其最佳培養(yǎng)條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制。玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是最常見的化學(xué)性污染。,8.2.1水水是唯一一種在凝固時膨脹的化合物。因此在選擇凍存細(xì)胞的容器時應(yīng)考慮到這個因素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因。為了避免金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對水的污染，在配制液體，清洗容器時必須使用不含雜質(zhì)的超純水。需要注意的是,超純水放置過久其純度會下降。在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時水經(jīng)常被污染，因?yàn)楦邏赫魵忮伡凹兯畽C(jī)的常規(guī)維護(hù)后可能有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為了保證水的純度,我們應(yīng)采取措施盡量避免化學(xué)物質(zhì)的殘留。,8.2.2血清動物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基,但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來源。由于血清采集于多個動物,而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同,因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細(xì)胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、組織來源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)時,為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性,最好選用同一批次的血清。,8.3.3培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過權(quán)威機(jī)構(gòu)的鑒定，實(shí)驗(yàn)者本人也應(yīng)對上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時,正確配置和儲存培養(yǎng)液及試劑也非常重要的,應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，避免液體體積計(jì)算錯誤,混用類似化合物等錯誤。,8.3.4培養(yǎng)器皿及容器細(xì)胞培養(yǎng)過程中會使用到各種不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小,構(gòu)形設(shè)計(jì)可能會影響到培養(yǎng)中氣體交換、濕度、培養(yǎng)液的pH值和細(xì)胞生長密度。培養(yǎng)器皿的工藝及滅菌過程中的差異可能對培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響。塑料制品在生產(chǎn)過程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。儲存不同物質(zhì)時應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器，因?yàn)榫凭?、?qiáng)酸、強(qiáng)堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。,8.3生物性污染的來源、危害及預(yù)防外界的微生物如昆蟲、節(jié)肢動物、原蟲、霉菌、病毒、細(xì)菌、無細(xì)胞壁的微生物(通常指支原體)和其它類型的細(xì)胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引起污染。只要在一個開放的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng),都難以避免發(fā)生污染。,8.3.1細(xì)菌污染細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。,8.3.2真菌污染真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。個體細(xì)小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。,8.3.3支原體污染支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2m，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.68.0)下生存，對青霉素有抗藥性，多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。,8.3.4病毒污染采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞和會發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細(xì)胞系。因此潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。,8.3.5非同種細(xì)胞污染由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，操作不當(dāng)，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長類”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在句卻認(rèn)為是HeLa細(xì)胞。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。,預(yù)防措施：（1）在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時易發(fā)生混亂。（2）在進(jìn)行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。（3）所有細(xì)胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。,9.單克隆抗體面臨的問題,9.1如何進(jìn)一步縮短單抗研發(fā)周期,降低生產(chǎn)成本,傳統(tǒng)方法制備單克隆抗體包括抗原制備、動物免疫、抗體檢測方法的建立、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選、亞克隆、凍存復(fù)蘇、雜交瘤細(xì)胞及單克隆抗體特性的鑒定及單克隆抗體的大量生產(chǎn)等一系列復(fù)雜步驟，一般要花費(fèi)6個月以上的時間，研發(fā)周期較長。同時每只小鼠自始自終只能免疫一種純化抗原，將這種免疫小鼠的脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合后，形成的雜交瘤細(xì)胞也只能分泌針對這一種純化抗原的單一單克隆抗體，工作效率低,生產(chǎn)成本高。因此，如何利用分子生物學(xué)技術(shù)，克服現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)的局限性,縮短單抗研發(fā)周期，降低生產(chǎn)成本，建立生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞株的高效方法，是當(dāng)前需解決的問題。,9.2如何進(jìn)一步提高體外用單抗的品質(zhì),研制高親和性單抗是免疫化學(xué)技術(shù)的重要發(fā)展方向之一，將會進(jìn)一步提高單克隆抗體在微量分析領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。同時，隨著單抗在診斷與治療中應(yīng)用的快速發(fā)展，對單抗種類及數(shù)量的需求越來越多,如何進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)也已成為抗體純化的主要問題。另外，單克隆抗體對抗原的識別,與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因使用的單克隆抗體不同,識別抗原的位點(diǎn)不同，導(dǎo)致檢測結(jié)果有一定差異。因此,體外用單抗標(biāo)準(zhǔn)化問題還需要進(jìn)一步研究。,9.3如何進(jìn)一步提高治療用單抗的品質(zhì),如何進(jìn)一步降低單抗藥物的免疫原性，提高單抗藥物在腫瘤組織的濃度是研制治療用單抗的發(fā)展方向。,一、鼠源性單克隆抗體,發(fā)展歷程,二、人源化抗體,1.概念：是指抗體的可變區(qū)部分（即Vh和Vl區(qū)）或抗體所有全部由人類抗體基因所編碼。,2.人源化抗體包括嵌合抗體、改型抗體、表面重塑抗體和全人源化抗體等。,2.1嵌合抗體（1）概念：是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞表達(dá)出嵌合抗體，這樣表達(dá)的抗體分子中輕重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，這樣整個抗體分子的近2/3部分都是人源的。,（2）特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性；保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。,2.2改型抗體（1）概念：改型抗體也稱CDR植入抗體(CDRgraftingantibody)，抗體可變區(qū)的CDR是抗體識別和結(jié)合抗原的區(qū)域，直接決定抗體的特異性。將鼠源單抗的CDR移植至人源抗體可變區(qū)，替代人源抗體CDR，使人源抗體獲得鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性，同時減少其異源性。,2.3表面重塑抗體,（1）概念：表面重塑抗體是指對異源抗體表面氨基酸殘基進(jìn)行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換。,2.4全人源化抗體,（1）概念：是指將人類抗體基因通過轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達(dá)人類抗體，達(dá)到抗體全人源化的目的。,三、小分子抗體,完整抗體分子具有體積大（相對分子質(zhì)量約為150103）、組織穿透能力差等不足，促進(jìn)了抗體分子的小型化。小分子抗體具有組織穿透能力強(qiáng)、免疫原性弱、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、制備簡單和表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，是基因工程中制備人源單抗的主要產(chǎn)物，目前小分子抗體主要