流式細(xì)胞術(shù)描述

1、流式細(xì)胞術(shù) Flow cytometry， FCM 1. 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer):是現(xiàn)代物理電是現(xiàn)代物理電 子技術(shù)、激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體的先進(jìn)子技術(shù)、激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體的先進(jìn) 科學(xué)技術(shù)設(shè)備?？茖W(xué)技術(shù)設(shè)備。 2. 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry):利用流式細(xì)胞利用流式細(xì)胞 儀對(duì)處于快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生儀對(duì)處于快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生 物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量 分析或分選的技術(shù)。分析或分選的技術(shù)。 基本概念 第一節(jié) 流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與原理 第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)

2、的數(shù)據(jù)分析 第三節(jié) 流式細(xì)胞儀分析的技術(shù)要求 第四節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用 一、流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與功能 二、流式細(xì)胞術(shù)的重要術(shù)語(yǔ) 三、流式細(xì)胞術(shù)基本原理 四、流式細(xì)胞術(shù)的樣本設(shè)置 第一節(jié) 流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與原理 四、流式細(xì)胞術(shù)的樣本設(shè)置 1. 常用對(duì)照 陰性對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照 空白對(duì)照 補(bǔ)償對(duì)照 2.一套完整的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本設(shè)置 陰性對(duì)照 作用是調(diào)節(jié)各熒光探測(cè)器合適的放大倍數(shù)， 將儀器歸零，即確定待測(cè)標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值 免疫球蛋白同型對(duì)照免疫球蛋白同型對(duì)照（同型抗體為沒(méi)有特異性、與 熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白。反映待測(cè)標(biāo)本對(duì) 抗體非特異性結(jié)合的 水平） 陰性細(xì)胞對(duì)照陰性細(xì)胞對(duì)照（用已知不

3、表達(dá)某種抗原的細(xì)胞進(jìn)行平 行實(shí)驗(yàn)，通常用于確定抗體的特異性） 陽(yáng)性對(duì)照 即用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽(yáng)性細(xì)胞）細(xì)胞進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，通常用 于檢測(cè)抗體是否有問(wèn)題或確定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。 空白對(duì)照 即不進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)胞。有些細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)會(huì)同樣被激發(fā)而產(chǎn)生自發(fā)熒光?？瞻讓?duì)照的主要作用用于確定待 測(cè)標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值或檢測(cè)染色方法是否成功。 補(bǔ)償對(duì)照 由于光譜的重疊，對(duì)于多色分析樣本必須設(shè)置補(bǔ)償對(duì)照。補(bǔ) 償對(duì)照主要用于多色分析時(shí)熒光光譜重疊的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。 補(bǔ)償對(duì)照是將用于多色標(biāo)記的各種熒光抗體分別與樣本反應(yīng)， 一一進(jìn)行單色標(biāo)記，以測(cè)定熒光信號(hào)的重疊并作適當(dāng)調(diào)節(jié)。 2.一套完整的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本設(shè)置

4、流式細(xì)胞術(shù)的基本原理是利用流式細(xì)胞術(shù)的基本原理是利用細(xì)胞標(biāo)記前后的熒光細(xì)胞標(biāo)記前后的熒光 強(qiáng)度改變強(qiáng)度改變來(lái)確定細(xì)胞性狀，故一套完整流式樣本即要有用來(lái)確定細(xì)胞性狀，故一套完整流式樣本即要有用 于確定其基礎(chǔ)熒光域值的對(duì)照（如空白對(duì)照或陰性對(duì)照），于確定其基礎(chǔ)熒光域值的對(duì)照（如空白對(duì)照或陰性對(duì)照）， 又要有已標(biāo)記的待測(cè)樣本。一套完整的流式樣本設(shè)置可根又要有已標(biāo)記的待測(cè)樣本。一套完整的流式樣本設(shè)置可根 據(jù)其不同的標(biāo)記方法進(jìn)行如下設(shè)置。據(jù)其不同的標(biāo)記方法進(jìn)行如下設(shè)置。 直接標(biāo)記樣本直接標(biāo)記樣本 對(duì)于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照（同型抗對(duì)于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照（同型抗 體對(duì)照）和待測(cè)樣本

5、。對(duì)于直接標(biāo)記多色樣本，在單色基體對(duì)照）和待測(cè)樣本。對(duì)于直接標(biāo)記多色樣本，在單色基 礎(chǔ)上另加補(bǔ)償對(duì)照。礎(chǔ)上另加補(bǔ)償對(duì)照。 間接標(biāo)記樣本間接標(biāo)記樣本 對(duì)于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照（一抗同對(duì)于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照（一抗同 型抗體對(duì)照）和待測(cè)樣本。型抗體對(duì)照）和待測(cè)樣本。 對(duì)于多色樣本，在單色基礎(chǔ)上另加補(bǔ)償對(duì)照，一般對(duì)于多色樣本，在單色基礎(chǔ)上另加補(bǔ)償對(duì)照，一般 不建議使用。不建議使用。 三、流式細(xì)胞術(shù)基本原理 1.1.流式細(xì)胞術(shù)分析的基本原理流式細(xì)胞術(shù)分析的基本原理 2.2.流式細(xì)胞術(shù)分選的基本原理流式細(xì)胞術(shù)分選的基本原理 3.3.流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償設(shè)置流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償設(shè)置 1

6、.流式細(xì)胞術(shù)分析的基本原理 前向散射與側(cè)向散射是前向散射與側(cè)向散射是 細(xì)胞的固有屬性，暫稱細(xì)胞的固有屬性，暫稱 為物理屬性。為物理屬性。 熒光信號(hào)是人們通過(guò)不熒光信號(hào)是人們通過(guò)不 同手段將熒光物質(zhì)結(jié)合同手段將熒光物質(zhì)結(jié)合 在細(xì)胞上，是人為屬性，在細(xì)胞上，是人為屬性， 暫稱為化學(xué)屬性。暫稱為化學(xué)屬性。 R1：淋巴細(xì)胞 R2：?jiǎn)魏思?xì)胞 R3：粒細(xì)胞 R4：紅細(xì)胞裂解碎片和少量血小 板 將目的細(xì)胞群圈定（即設(shè)門），然后將門內(nèi)細(xì)胞以FSC或SSC為橫坐 標(biāo)，熒光信號(hào)為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)分布圖表示出來(lái)，此圖中細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)在與其 FSC或SSC相應(yīng)的位置，并只可能表現(xiàn)兩種情況：熒光信號(hào)弱或無(wú)、熒光 信號(hào)強(qiáng)或有。

7、調(diào)節(jié)電壓可改變目的細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，那么如何判斷 特異性熒光信號(hào)的有無(wú)？ 需要設(shè)置陰性對(duì)照以確定細(xì)胞自身基礎(chǔ)熒光域值，并通過(guò) 它來(lái)判斷待測(cè)樣本中是否有特異性熒光信號(hào)。 首先通過(guò)調(diào)節(jié)電壓將陰 性對(duì)照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值 調(diào)至陰性致信區(qū)內(nèi)，然后對(duì) 陰性置信區(qū)進(jìn)行界定，大于 陰性置信區(qū)的熒光信號(hào)為特 異性熒光信號(hào)。 對(duì)于流式樣本來(lái)說(shuō)，設(shè) 置陰性對(duì)照是必須的，且陰 性置信區(qū)一旦設(shè)定，將作為 后續(xù)樣本的陰、陽(yáng)性判斷的 基礎(chǔ)，不能隨意變動(dòng)。 2.流式細(xì)胞術(shù)分選的基本原理 1. 分選速度：幾千個(gè)細(xì)胞/秒 2. 分選純度: 99.5%左右 分離后的樣品中該亞群細(xì)胞所占的百分比。 3. 分選收獲率: 90-95

8、% 分離后所得的細(xì)胞亞群數(shù)占原細(xì)胞樣品中該亞群 細(xì)胞數(shù)的百分比。 3.3.流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償設(shè)置流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償設(shè)置 以以FITC、PE雙色分析為例：雙色分析為例： （1）先調(diào)節(jié)陰性對(duì)照管（即同型對(duì)照）先調(diào)節(jié)陰性對(duì)照管（即同型對(duì)照IgGFITC、 IgGPE）：先將原補(bǔ)償清零，通過(guò)調(diào)節(jié)電壓，使陰性群）：先將原補(bǔ)償清零，通過(guò)調(diào)節(jié)電壓，使陰性群 落在落在FITC和和PE雙陰性區(qū)。陰性對(duì)照的作用是，調(diào)節(jié)各雙陰性區(qū)。陰性對(duì)照的作用是，調(diào)節(jié)各 熒光探測(cè)器合適的放大倍數(shù)，即歸零。熒光探測(cè)器合適的放大倍數(shù)，即歸零。 （2）FITC標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體/IgGPE：(IgGPE為同型對(duì)照為同型對(duì)照) 此時(shí)此時(shí)

9、電壓已通過(guò)陰性對(duì)照設(shè)定，絕不能變動(dòng)。當(dāng)電壓已通過(guò)陰性對(duì)照設(shè)定，絕不能變動(dòng)。當(dāng)PE探測(cè)器探測(cè)器 檢測(cè)到的檢測(cè)到的FITC信號(hào)恰好完全消除時(shí)，補(bǔ)償便是正確的，信號(hào)恰好完全消除時(shí)，補(bǔ)償便是正確的， 即即FITC單陽(yáng)性細(xì)胞的單陽(yáng)性細(xì)胞的PE信號(hào)與陰性對(duì)照的信號(hào)與陰性對(duì)照的PE信號(hào)一信號(hào)一 致。致。 注：首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況，其次是在檢測(cè)管中，注：首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況，其次是在檢測(cè)管中， 必須要有必須要有FITC單陽(yáng)性細(xì)胞和雙陰性細(xì)胞。單陽(yáng)性細(xì)胞和雙陰性細(xì)胞。 （3）IgGFITC/PE標(biāo)記抗體：同理，將進(jìn)入FITC探測(cè)器 的PE信號(hào)降至本底一致，前提是必須有PE單陽(yáng)性細(xì)胞 和雙陰性細(xì)胞。

10、（4）當(dāng)設(shè)置好以上補(bǔ)償條件后，即補(bǔ)償調(diào)節(jié)完畢。 （5）進(jìn)行多色分析時(shí)，必須做各熒光間的補(bǔ)償。方法同 上，先準(zhǔn)備各種標(biāo)記的熒光陰性對(duì)照，確定合適的電壓， 并逐一調(diào)節(jié)各熒光標(biāo)記抗體，與其他熒光對(duì)照，然后調(diào) 節(jié)特異性熒光對(duì)每個(gè)熒光的補(bǔ)償。 二、流式細(xì)胞術(shù)的重要術(shù)語(yǔ) 1.1.前向散射與側(cè)向散射前向散射與側(cè)向散射 2. 2. CoulterCoulter效應(yīng)與電子體積效應(yīng)與電子體積 3.3.熒光信號(hào)及其面積與寬度熒光信號(hào)及其面積與寬度 4.4.光譜重疊與熒光補(bǔ)償光譜重疊與熒光補(bǔ)償 5.5.細(xì)胞基礎(chǔ)熒光域值與陰性對(duì)照置信區(qū)間細(xì)胞基礎(chǔ)熒光域值與陰性對(duì)照置信區(qū)間 1.前向散射與側(cè)向散射 前向散射光 (forw

11、ard scatter)： FSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小相關(guān) 側(cè)向散射光（side scatter)： SSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān) 利用前向角和 測(cè)向角散射光可 以把外周血白細(xì) 胞分成三群，淋 巴細(xì)胞、單核 細(xì)胞和粒細(xì)胞。 散射光的測(cè)定 2.Coulter效應(yīng)與電子體積 Coulter Coulter效應(yīng)原理：效應(yīng)原理： 微小粒子并不導(dǎo)電，但通微小粒子并不導(dǎo)電，但通 過(guò)充滿電解液的小孔時(shí)可過(guò)充滿電解液的小孔時(shí)可 產(chǎn)生電阻變化，細(xì)胞體積產(chǎn)生電阻變化，細(xì)胞體積 越大，電阻的改變?cè)酱?。越大，電阻的改變?cè)酱蟆?可將電阻變化記錄為電位可將電阻變化記錄為電位 變化，用于微小粒子體積變化，用于微

12、小粒子體積 測(cè)量和計(jì)數(shù)上。采用這種測(cè)量和計(jì)數(shù)上。采用這種 方法計(jì)算該顆粒的體積就方法計(jì)算該顆粒的體積就 是電子體積。是電子體積。 3.熒光信號(hào)及其面積與寬度 熒光信號(hào)被光電倍增管收集，形成信號(hào)脈沖，每個(gè)信號(hào)脈沖都有其熒光信號(hào)被光電倍增管收集，形成信號(hào)脈沖，每個(gè)信號(hào)脈沖都有其 高度、面積與寬度。每種顏色的熒光占用一個(gè)特定的檢測(cè)器，每高度、面積與寬度。每種顏色的熒光占用一個(gè)特定的檢測(cè)器，每 種顏色的檢測(cè)器稱為一個(gè)熒光通道。種顏色的檢測(cè)器稱為一個(gè)熒光通道。 脈沖高度表示熒光信號(hào)的強(qiáng)度，表示為脈沖高度表示熒光信號(hào)的強(qiáng)度，表示為FLn-Height，n為儀器的熒為儀器的熒 光收集器序數(shù)。光收集器序數(shù)。

13、脈沖面積（脈沖面積（FLn-A）是采用積分計(jì)算的熒光通量。（熒光脈沖面積）是采用積分計(jì)算的熒光通量。（熒光脈沖面積 比高度更能準(zhǔn)確反映比高度更能準(zhǔn)確反映DNA含量，用于含量，用于DNA倍體分析）倍體分析） 脈沖寬度（脈沖寬度（FLn-W）反映熒光的分布，）反映熒光的分布，常用來(lái)區(qū)分雙連體細(xì)胞常用來(lái)區(qū)分雙連體細(xì)胞。 4.光譜重疊與熒光補(bǔ)償 利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的 信號(hào)加以扣除的技術(shù)稱“熒光補(bǔ)償” 5.細(xì)胞基礎(chǔ)熒光域值與陰性對(duì)照置信區(qū)間 對(duì)于流式樣本，由于細(xì)胞的自發(fā)熒光、熒光抗體會(huì)與待測(cè)標(biāo)本中對(duì)于流式樣本，由于細(xì)胞的自發(fā)熒光、熒光抗體會(huì)與待測(cè)標(biāo)本中 的細(xì)胞發(fā)生少量非特異

14、性結(jié)合，在流式細(xì)胞儀上可檢出一定的信的細(xì)胞發(fā)生少量非特異性結(jié)合，在流式細(xì)胞儀上可檢出一定的信 號(hào)，這部分信號(hào)稱為基礎(chǔ)熒光域值。號(hào)，這部分信號(hào)稱為基礎(chǔ)熒光域值。 在流式標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程中，通常需要通過(guò)調(diào)節(jié)電壓將陰性細(xì)胞的基在流式標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程中，通常需要通過(guò)調(diào)節(jié)電壓將陰性細(xì)胞的基 礎(chǔ)熒光域值置于礎(chǔ)熒光域值置于95%或或99%的置信區(qū)間內(nèi)，作為陰性對(duì)照可信的置信區(qū)間內(nèi)，作為陰性對(duì)照可信 區(qū)間設(shè)定。區(qū)間設(shè)定。 一、流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與功能 1. 流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu) 2. 流式細(xì)胞儀的基本功能與應(yīng)用 2. 流式細(xì)胞儀的基本功能與應(yīng)用 定性或定量分析功能定性或定量分析功能 細(xì)胞膜：細(xì)胞膜：細(xì)胞表面抗原，表面糖

15、類，表面受體，膜電位，細(xì)胞表面抗原，表面糖類，表面受體，膜電位， 膜結(jié)合鈣離子，細(xì)胞表面電荷等，這對(duì)確定細(xì)胞的性質(zhì)膜結(jié)合鈣離子，細(xì)胞表面電荷等，這對(duì)確定細(xì)胞的性質(zhì) 及其功能重要。及其功能重要。 細(xì)胞質(zhì)：細(xì)胞質(zhì)：各種細(xì)胞成分，包括蛋白質(zhì)、各種細(xì)胞成分，包括蛋白質(zhì)、RNARNA、各種細(xì)胞、各種細(xì)胞 器中的特殊成分、各種抗原、基因編碼蛋白、細(xì)胞因子器中的特殊成分、各種抗原、基因編碼蛋白、細(xì)胞因子 等。等。 細(xì)胞核：細(xì)胞核：DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)等、蛋白質(zhì)等 分選功能分選功能 可將具有特定性狀或功能的細(xì)胞從混合細(xì)胞群中分可將具有特定性狀或功能的細(xì)胞從混合細(xì)胞群中分 離出來(lái)，再進(jìn)行分析或培養(yǎng)

16、。優(yōu)點(diǎn)：分選純度高離出來(lái)，再進(jìn)行分析或培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：分選純度高 （可達(dá)（可達(dá)99%99%），分選回收率高，可分選活細(xì)胞。），分選回收率高，可分選活細(xì)胞。 1. 流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu) 流動(dòng)室與液流系統(tǒng)流動(dòng)室與液流系統(tǒng) 光源與光學(xué)系統(tǒng)光源與光學(xué)系統(tǒng) 激發(fā)光源激發(fā)光源 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 信號(hào)收集與光電轉(zhuǎn)信號(hào)收集與光電轉(zhuǎn) 換系統(tǒng)換系統(tǒng) 計(jì)算機(jī)與分析系統(tǒng)計(jì)算機(jī)與分析系統(tǒng) 流動(dòng)室與液流系統(tǒng) PMT PMT PMT PMT 二分鏡 帶通濾光片 激光 1 2 3 4 Flow cell 由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學(xué)元件 組成，它們分別將不同波長(zhǎng)的光信號(hào)送入到 不同的探測(cè)器。濾光片主要分為四類： 長(zhǎng)通濾光片（

17、LP）、短通濾光片（SP）、 帶通濾光片（BP）和二分鏡 光學(xué)系統(tǒng) 激發(fā)光源 激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長(zhǎng)、單 一方向、同步的穩(wěn)定光照 激光波長(zhǎng): 臺(tái)式機(jī)為固定波長(zhǎng)488nm, 633nm ，大型 機(jī)波長(zhǎng)譜線寬包括325，457.9，488, 514.5，520.8， 530.9，568.3， 633，647 nm 信號(hào)收集與光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng) 主要由光電轉(zhuǎn)換器件、放大器和信號(hào)處理電路主要由光電轉(zhuǎn)換器件、放大器和信號(hào)處理電路 組成組成 光電轉(zhuǎn)換器件主要功能是將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電流信光電轉(zhuǎn)換器件主要功能是將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電流信 號(hào)。由光電二極管和光電倍增管（號(hào)。由光電二極管和光電倍增管

18、（PMTPMT）來(lái)執(zhí)行。）來(lái)執(zhí)行。 放大器分兩類：線性放大和對(duì)數(shù)放大。放大器分兩類：線性放大和對(duì)數(shù)放大。 信號(hào)處理系統(tǒng)的主要功能是將電信號(hào)轉(zhuǎn)變成脈沖信號(hào)處理系統(tǒng)的主要功能是將電信號(hào)轉(zhuǎn)變成脈沖 信號(hào)、數(shù)字信號(hào)最終傳送給計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行處理。信號(hào)、數(shù)字信號(hào)最終傳送給計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行處理。 計(jì)算機(jī)與分析系統(tǒng) 計(jì)算機(jī)系統(tǒng)用于控制整個(gè)儀器的運(yùn)行，數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析。 各公司所產(chǎn)的流式細(xì)胞儀都有自己特有的分析系統(tǒng)。 第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析 一、參數(shù) 前向散射光FSC: 反映顆粒的大小 側(cè)向散射光SSC: 細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度 熒光FL: 細(xì)胞被染上熒光部分?jǐn)?shù)量的多少 二、數(shù)據(jù)的顯示與分析 三、設(shè)門 二、

19、數(shù)據(jù)的顯示與分析 1.單參數(shù)直方圖 2.二維散點(diǎn)圖 3.二維等高線圖 4.假三維圖 5.三維圖 以分布直方圖( distribution histogram )來(lái)顯示，橫軸 為該參數(shù)測(cè)量強(qiáng)度相對(duì)值，單位是道數(shù)。強(qiáng)度分布可以是線性 的，也可以是對(duì)數(shù)的?？v軸一般是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)。 1.單參數(shù)直方圖 看圖技巧： 1.先看橫、縱坐標(biāo)，了解檢測(cè)目的； 2.看圖形分布，直方圖峰形越往右移，代表其熒光強(qiáng)度越強(qiáng)； 3.M1的確定是根據(jù)陰性對(duì)照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值設(shè)定的，峰形右移，熒光信 號(hào)大于基礎(chǔ)熒光域值（M1），表示陽(yáng)性（M2）； 4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，檢測(cè)目的物一般用各Marker區(qū)內(nèi)的細(xì)胞所占百分比或用

20、平均 熒光強(qiáng)度表示； 5.幾個(gè)直方圖的比較，關(guān)鍵看Marker（M1、M2）的位置以及細(xì)胞數(shù)。 能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系，橫、縱 坐標(biāo)分別代表兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示具有相應(yīng)坐 標(biāo)值的細(xì)胞。 2.二維散點(diǎn)圖 看圖技巧：1.先 看x，y軸，了解代 表參數(shù)的意義；2. 再看其四個(gè)象限， 并了解各象限意義； 3.比較幾個(gè)散點(diǎn)圖 時(shí)，關(guān)鍵看四象限 劃分區(qū)間的位置以 及各象限散點(diǎn)的密 度；4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)， 檢測(cè)目的物一般用 各象限區(qū)內(nèi)的細(xì)胞 數(shù)占門內(nèi)細(xì)胞百分 比或用平均熒光強(qiáng) 度表示。 用等高線來(lái)表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相 同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。 3.二維等高線

21、圖 縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參 數(shù),Z軸為細(xì)胞數(shù)。 4 .假三維圖 5.三維圖 任意選三個(gè)參數(shù)為x，y，z軸，構(gòu)成一個(gè)三維圖，每 一群細(xì)胞根據(jù)各自參數(shù)處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的空間，三維圖 對(duì)比較復(fù)雜的亞群的顯示更為直觀明了。 三、設(shè)門 流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析的目的是通過(guò)與適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析的目的是通過(guò)與適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照 進(jìn)行比較，來(lái)確定所分析樣本中表達(dá)標(biāo)記物的細(xì)胞百分進(jìn)行比較，來(lái)確定所分析樣本中表達(dá)標(biāo)記物的細(xì)胞百分 率。完成這一過(guò)程的第一步就是需要確定我們所要研究率。完成這一過(guò)程的第一步就是需要確定我們所要研究 的目的細(xì)胞群，其術(shù)語(yǔ)為設(shè)門（的目的細(xì)胞群，其術(shù)語(yǔ)為設(shè)門（gating

22、gating）。）。 設(shè)門是指在細(xì)胞分布圖中指定某一個(gè)范圍或某一細(xì)胞設(shè)門是指在細(xì)胞分布圖中指定某一個(gè)范圍或某一細(xì)胞 性狀的細(xì)胞群，并對(duì)其進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。性狀的細(xì)胞群，并對(duì)其進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。 根據(jù)散射光設(shè)門根據(jù)散射光設(shè)門 根據(jù)某一細(xì)胞性狀設(shè)門根據(jù)某一細(xì)胞性狀設(shè)門 組合設(shè)門組合設(shè)門 一、樣品制備：?jiǎn)渭?xì)胞懸液 二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色 三、質(zhì)量控制 第三節(jié) 流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求 一、樣品制備 流式細(xì)胞儀的樣品要求： 單細(xì)胞懸液，避免任何細(xì)胞沉積 被檢細(xì)胞或顆粒大小0.240um 樣品中至少20000個(gè)細(xì)胞，濃度105-106個(gè)/毫升 （一）外周血淋巴細(xì)胞樣品的制

23、備 利用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有 白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的二維散點(diǎn)圖 單層培養(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，然后離心漂洗。 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備 成單細(xì)胞懸液。 （二) 培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備 機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。 酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。 化學(xué)試劑處理法：EDTA、EGTA等。 表面活性劑處理法： Triton-100、皂素等。 (三)新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備 機(jī)械法往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是 較低的細(xì)胞產(chǎn)量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過(guò)濾團(tuán)塊等， 也可利用電子學(xué)技術(shù)處理的方法排除團(tuán)塊和

24、碎片 的干擾。 酶學(xué)法、化學(xué)法對(duì)實(shí)體組織的分散效果較理想， 但會(huì)造成所測(cè)化學(xué)成份的不良影響。FCM所測(cè)細(xì) 胞是單個(gè)分散狀態(tài)；對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞碎片盡可 能少；細(xì)胞的活性不受損害，以保證下一步的熒 光染色處理不受影響。 防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。 2、乙醇與甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但 細(xì)胞表面熒光染色分析不受影響。 (四）單細(xì)胞懸液的保存 染料的選擇和標(biāo)記染色保證了熒光信號(hào)的產(chǎn)生 （一）免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光染料 熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng)（nm) 發(fā)射波長(zhǎng)（nm) 顏色 FIT

25、C 488 525 深藍(lán)色 PE(RDI) 488 575 橙色 ECD 488 620 橙紅色 PeCy-5 488 670 紅色 PeCy-7 488 755 深紅色 PI 488 620 橙紅色 APC 633 670 紅色 二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在 488nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)另一熒光 染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)。 Laser CY5 PE CY5 CY5 488nm 能量傳遞染料： 熒光染料與細(xì)胞成分的結(jié)合方式： 結(jié)構(gòu)親和方式 嵌入結(jié)合方式 共價(jià)結(jié)合方式 熒光抗體特異性結(jié)合方式 1、直接免疫熒光染色 2、間接免疫熒

26、光染色 （二）免疫熒光標(biāo)記 3、雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記 FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色 FITC+T red 488 525 綠色 568 615 紅色 FITC+PeCy5 488 525、 675 綠色、 紅色 FITC+ ECD 488 525、 625 綠色、橙紅色 F+P +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙、紅色 F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 綠、 橙紅色、紅色 F+P+APC 488 525 、 575 綠色、橙色 633 670 紅色 熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng)（nm) 發(fā)射波長(zhǎng)（nm) 顏色 （一）單細(xì)胞懸液制

27、備的質(zhì)量控制 （二）細(xì)胞懸液免疫熒光染色的質(zhì)量控制 1、溫度對(duì)熒光染色的影響 2、pH對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度的影響 3、熒光染料濃度的控制 4、固定劑對(duì)熒光染色的影響 （三）儀器操作技術(shù)的質(zhì)量控制 三、質(zhì)量控制 1、同型對(duì)照：選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為 同型對(duì)照（陰性對(duì)照） 2、全程質(zhì)控：在流式檢測(cè)中，樣品標(biāo)記、溶血、 洗滌、儀器質(zhì)量控制和上機(jī)檢測(cè)的過(guò)程都會(huì)直接影 響檢測(cè)結(jié)果。采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品來(lái)進(jìn)行全程質(zhì)控， 使得同類實(shí)驗(yàn)室建立質(zhì)控比對(duì)，數(shù)據(jù)可以互用。 （四）免疫檢測(cè)的質(zhì)量控制 第四節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用 細(xì)胞表面分子的檢測(cè)與分析細(xì)胞表面分子的檢測(cè)與分析 細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)抗原檢測(cè)與分析細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)抗原檢測(cè)與分析 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)與分析細(xì)胞凋亡的檢測(cè)與分析 DNA含量檢測(cè)與細(xì)胞周期的分析含量檢測(cè)與細(xì)胞周期的分析 細(xì)胞增殖的檢測(cè)與分析細(xì)胞增殖的檢測(cè)與分析 細(xì)胞分選細(xì)胞分選 細(xì)胞毒的檢測(cè)與分析細(xì)胞毒的檢測(cè)與分析 可溶性蛋白質(zhì)分子的檢測(cè)與分析可溶性蛋白質(zhì)分子的檢測(cè)與分析 報(bào)告基因的檢測(cè)與分析報(bào)告基因的檢測(cè)與分析 補(bǔ)償對(duì)照 由于光譜的重疊，對(duì)于多色分析樣本必須設(shè)置補(bǔ)償對(duì)照。補(bǔ) 償對(duì)照主要用于多色分析時(shí)熒光光譜重疊的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。 補(bǔ)償對(duì)