人類染色體疾病的診斷三課件

1、人類染色體疾病的診斷三1 第五節(jié)第五節(jié) 熒光原位雜交（熒光原位雜交（FISH） 人類染色體疾病的診斷三2 染色體顯帶技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)染色體顯帶技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn) 人類染色體疾病的診斷三3 一、一、FISH原理原理 依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)、變性雙鏈堿基互補(bǔ)、變性 和復(fù)性原理，用已知堿基序列和復(fù)性原理，用已知堿基序列 的單鏈核酸片段作為探針檢測(cè)的單鏈核酸片段作為探針檢測(cè) 樣本中是否存在與其互補(bǔ)的同樣本中是否存在與其互補(bǔ)的同 源核酸序列，這一過程叫做雜源核酸序列，這一過程叫做雜 交。交。 原位雜交 (in situ hybridization)是用已是用已 標(biāo)記的核酸探針與組織切片或標(biāo)記的核酸探針與組織切片或

2、 細(xì)胞中的待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序細(xì)胞中的待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序 列雜交列雜交,從而對(duì)組織細(xì)胞中的從而對(duì)組織細(xì)胞中的 核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定 量分析。量分析。 人類染色體疾病的診斷三4 原位雜交原位雜交 人類染色體疾病的診斷三5 熒光原位雜交（熒光原位雜交（FISH） 人類染色體疾病的診斷三6 原理：通過觀察熒光信號(hào)在染色體上的位置來反映相應(yīng)基因的情況。 人類染色體疾病的診斷三7 人類染色體疾病的診斷三8 二、二、FISH的優(yōu)點(diǎn)：的優(yōu)點(diǎn)： 人類染色體疾病的診斷三9 三、三、FISH探針探針 l優(yōu)點(diǎn)：在信號(hào)較 弱或較小時(shí)可經(jīng)抗 原抗體反應(yīng)擴(kuò)大 l缺點(diǎn) 步驟較多, 操作麻煩。

3、（一）、直接標(biāo)記和間接標(biāo)記（一）、直接標(biāo)記和間接標(biāo)記 人類染色體疾病的診斷三10 直接用熒光素標(biāo)記DNA的方法稱為直接標(biāo)記直接標(biāo)記。 l優(yōu)點(diǎn)：由于直接標(biāo)記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信 號(hào), 省去了煩瑣的免疫熒光反應(yīng)。由于近年來熒光素的亮度 和抗淬滅性的不斷改進(jìn)和提高, 直接標(biāo)記的熒光探針應(yīng)用越 來越多。 人類染色體疾病的診斷三11 探針標(biāo)記 人類染色體疾病的診斷三12 （二）、（二）、FISH探針的種類探針的種類 人類染色體疾病的診斷三13 人類染色體疾病的診斷三14 人類染色體疾病的診斷三15 四、FISH的臨床應(yīng)用 人類染色體疾病的診斷三16 人類染色體疾病的診斷三17 染色體著絲粒熒光

4、 人類染色體疾病的診斷三18 染色體端粒熒光 人類染色體疾病的診斷三19 人類染色體疾病的診斷三20 人類染色體疾病的診斷三21 人類染色體疾病的診斷三22 人類染色體疾病的診斷三23 人類染色體疾病的診斷三24 人類染色體疾病的診斷三25 人類染色體疾病的診斷三26 人類染色體疾病的診斷三27 FISH檢測(cè)不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，是臨床遺傳學(xué)檢測(cè)的有效補(bǔ)充檢測(cè)不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，是臨床遺傳學(xué)檢測(cè)的有效補(bǔ)充 手段：手段： 傳統(tǒng)的染色體檢查方法周期長(zhǎng)，人工消耗大，而且染色體分 析需要有較好質(zhì)量的中期分裂相。白血病患者腫瘤細(xì)胞中期分 裂相不易獲得，而且有些重要預(yù)后意義的累及基因位點(diǎn)的微缺 失或僅存在于

5、間期細(xì)胞中的異常，傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)是不 能檢測(cè)出來的。 熒光原位雜交技術(shù)不需要中期分裂相，因此可分析大量間期 細(xì)胞，且具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、敏感性和特異性高的 優(yōu)點(diǎn)。但需要指定基因特異性的探針，失去了核型分析的宏觀 性。 人類染色體疾病的診斷三28 Translocation t(9;22)(q34;q11) 人類染色體疾病的診斷三29 Translocation t(9;22)(q34;q11) 人類染色體疾病的診斷三30 在正常的細(xì)胞中，兩個(gè)紅點(diǎn)和兩個(gè)綠點(diǎn)分別表 示正常的ABL和BCR基因的正常位置。在不正 常的細(xì)胞中，BCR-ABL融合基因呈現(xiàn)為紅綠兩 種顏色的融合，這種融合基

6、因常常在觀察中顯 示為黃色熒光（箭頭所指）。 人類染色體疾病的診斷三31 五、幾種新技術(shù)介紹五、幾種新技術(shù)介紹 人類染色體疾病的診斷三32 1.多色熒光原位雜交（多色熒光原位雜交（M-FISH） 采用全染色體探針（WCP）與染色體雜交，分析染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常的 分子生物學(xué)方法。 探針是經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)(Degenerate oligonucleotideprimed polymerase chain reaction, DOP-PCR)擴(kuò)增、 流式分選、 并用 5 種熒光素組合熒光標(biāo)記法標(biāo)記的 同源染色體。這種經(jīng)過標(biāo)記的探針集合(Pool) 與制備好的間期細(xì)胞染色體雜交, 可使雜交后的每 條

7、染色體表現(xiàn)出獨(dú)有的顏色, 從而能夠分辨出人的 22 對(duì)常染色體和X、Y 兩條性染色體(圖215), 雜交 后的圖像通過濾光裝置被計(jì)算機(jī)獲得并分析得出結(jié) 果。如果一條染色體的顏色不相同, 則提示 該條染色體有重組現(xiàn)象, 根據(jù)每條染色體各自獨(dú)有 的顏色, 可以知道哪幾條染色體之間進(jìn)行了重組 人類染色體疾病的診斷三33 M-FISH 對(duì)染色體間復(fù)雜易位的分析有突出優(yōu)勢(shì), 但是對(duì)染色體微小易位(1MB)的分析則受到限制, 而對(duì)染色體內(nèi)部異常的分析則無能為力, 這包括 染色體的擴(kuò)增、微小缺失和倒位 人類染色體疾病的診斷三34 染色體光譜核型比對(duì)分析技術(shù)（SKY-spectral- karyotyping

8、)-創(chuàng)新的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常檢查工具 原理：光譜核型分析SKY經(jīng)由CCD相機(jī)擷取圖像， 利用光譜干涉儀及傅立葉轉(zhuǎn)換技術(shù)，分辨獲得圖像每一 像素點(diǎn)的光譜，以此標(biāo)定出不同光譜的不同顏色。 優(yōu)勢(shì)： 對(duì)比傳統(tǒng)的M-FISH,光譜核型分析技術(shù)的采 用優(yōu)勢(shì)無法比擬。 一 傳統(tǒng)的技術(shù)使用顯微鏡熒光濾鏡來分辨熒光信號(hào)， 缺點(diǎn)存在嚴(yán)重的熒光信號(hào)干擾（cross-talk),信號(hào)重疊， 信號(hào)位移等，無法有效分辨染色體，也無法準(zhǔn)確診斷染 色體的細(xì)微變異，異位。而SKY完全克服以上缺點(diǎn)，對(duì) 圖像每一像素的光譜標(biāo)以不同顏色，顯而易見。 二 從成本上看，不需要電動(dòng)顯微鏡，熒光濾鏡僅使 用一顆SKY濾鏡，SKYPaint

9、探針做一次雜交，一次圖像 擷取，讓使用人員減輕時(shí)間，精力，同時(shí)獲取穩(wěn)定結(jié)果。 人類染色體疾病的診斷三35 人類染色體疾病的診斷三36 4. 4. 比較基因組雜交比較基因組雜交 Comparative Genomic Hybridization (CGH) (CGH) 原理：原理：在熒光原位雜交基礎(chǔ)上，結(jié)合消減雜在熒光原位雜交基礎(chǔ)上，結(jié)合消減雜 交技術(shù)而發(fā)展起來的技術(shù)，主要用于交技術(shù)而發(fā)展起來的技術(shù)，主要用于 腫瘤的檢測(cè)及其基因組分析腫瘤的檢測(cè)及其基因組分析 是由是由Kallioniemi等在等在1992年首先提出的，是年首先提出的，是 檢測(cè)整個(gè)腫瘤基因組檢測(cè)整個(gè)腫瘤基因組DNA增加或減少的強(qiáng)有

10、力增加或減少的強(qiáng)有力 的工具的工具 人類染色體疾病的診斷三37 比較基因組雜交（CGH） 人類染色體疾病的診斷三38 比較基因組雜交原理示意比較基因組雜交原理示意 腫瘤腫瘤DNADNA和對(duì)照和對(duì)照DNADNA在染色在染色 體上的相對(duì)結(jié)合量取決于兩體上的相對(duì)結(jié)合量取決于兩 種種DNADNA標(biāo)本中相應(yīng)雜交序列標(biāo)本中相應(yīng)雜交序列 的多少的多少 因此可根據(jù)不同熒光強(qiáng)度因此可根據(jù)不同熒光強(qiáng)度 的比率而定量分析腫瘤基因的比率而定量分析腫瘤基因 組中組中DNADNA的增加或丟失的增加或丟失 等比混合等比混合 人類染色體疾病的診斷三39 比較基因組雜交過程比較基因組雜交過程 人類染色體疾病的診斷三40 DAP

11、IDAPI 4 4,6-,6-二聯(lián)脒二聯(lián)脒-2-2- 吲哚苯吲哚苯 FITC 異硫氰酸酯異硫氰酸酯 TRITC 硫氰酸四甲基羅丹明硫氰酸四甲基羅丹明 人染色體不同熒光素染色結(jié)果人染色體不同熒光素染色結(jié)果 人類染色體疾病的診斷三41 數(shù)字化圖像數(shù)字化圖像 人類染色體疾病的診斷三42 FITC/TRITC FITC/TRITC 熒光強(qiáng)度比率分析圖熒光強(qiáng)度比率分析圖 Ratio image FITC/TRITCRatio image FITC/TRITC 人類染色體疾病的診斷三43 人類染色體疾病的診斷三44 比較基因組雜交應(yīng)用范疇比較基因組雜交應(yīng)用范疇 人類染色體疾病的診斷三45 優(yōu)勢(shì)：優(yōu)勢(shì)： 可快捷檢測(cè)中期、間期基因組可快捷檢測(cè)中期、間期基因組 不需預(yù)先知道不需預(yù)先知道DNA發(fā)生改變的部位發(fā)生改變的部位 一次實(shí)驗(yàn)即可檢出待測(cè)樣本整個(gè)基因一次實(shí)驗(yàn)即可檢出待