提高先導化合物活性重現性試驗

1、提高先導化合物活性重現性試驗DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2016.23.032： In view of the instable reproducibility ofre-fermentation activities in screening of lead compounds， the effects of storage time on the reproducibility of activity in screening process were studied. Several batches of re-fermentation samples

2、were used to test against 3 insecticide targets and 4 herbicide targets. The results showed that in screening of strains in storage for 1 year ， about 60%of screening samples lost their initial activities ， but in screening of strains with half a years storage ， only about 40% of strains lost activi

3、ties. Adjusting re-fermentation intervals according to the results ， and changing the concentrated re-fermentation into a decentralized re-fermentation in synchronization，the re-fermentation in accordance with the preliminary screening concluded that about 81.56% strains could realize the preliminar

4、y screening activity ， which greatly improved the detection efficiency of alternative compounds.微生物源先導化合物源于微生物發(fā)酵代謝產物， 常規(guī)的篩選流程持續(xù)時間長達數月。 由于發(fā)酵產物的不穩(wěn)定性， 微生物源先 導化合物的初篩、復篩、化合物分離、純化和制備都需要新鮮的 發(fā)酵液， 對于每年近一百萬份的高通量篩選體系， 不可能對每個 菌株預先進行大量發(fā)酵， 制備足量的發(fā)酵液用于整個流程。 近幾 年的篩選結果顯示，每一輪重復發(fā)酵，有近50%的提取物無法重現活性。 重現活性的提取物中， 大部分含有殺粉蝶素或

5、格爾德霉 素類的高產量、高毒性、廣譜的已知化合物，低產量、低毒性的 化合物在重復發(fā)酵過程中更容易丟失。 本研究為提高活性化合物 的重現性，對 3 個殺蟲活性篩選靶標和 4 個除草活性篩選靶標進 行了試驗，以提高先導化合物的篩選效率。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1 先導化合物 篩選靶標：狗芽根、油菜、擬南芥、浮 萍、小菜蛾、棉鈴蟲、蚜蟲，共 7 個靶標。1.1.2 瓊脂粉 北京鼎昌盛生物技術有限責任公司生產，型 號 DH010-4。1.1.3 試劑 丙酮、乙醇、二甲基亞砜（DMSO、N N-二甲 基甲酰胺（DMF、吐溫-80試劑，以上試劑均為市售分析純化 學試劑。1.1.4 供篩選試驗

6、樣品 放線菌、真菌發(fā)酵提取物，由湖北 省生物農藥工程研究中心微生物工程研究室提供； 提取物組分及 純化樣品由湖北省生物農藥工程研究中心化學分析研究室提供；供試靶標由湖北省生物農藥工程研究中心養(yǎng)蟲室提供。1.1.5 主要儀器設備 B100-1F 蠕動泵、 BIOHIT eLINE 八能 道電子移液器、 Intega96 通道移液機、 96 孔組織培養(yǎng)板、 24 孔 組織培養(yǎng)板、人工氣候室。1.2 試驗方法1.2.1 菌株的選擇及分組 長期冷凍保藏的菌株為 2014 年212月完成初篩的菌株。選擇初篩有殺蟲或除草活性的菌株進 行分組， 僅對一個靶標有活性的菌株為第一組， 對兩個及兩個以 上靶標有活

7、性的菌株為第二組。 未經長期冷凍保藏的菌株選擇范 圍為 2015年6月至 2016年 2月完成初篩的菌株， 選擇初篩有殺 蟲或除草活性的菌株按活性進行分組， 僅對一個靶標有活性的菌 株為第三組，對兩個及兩個以上靶標有活性的菌株為第四組。1.2.2 菌株活化和重復發(fā)酵及提取 對“1.2.1 ”選擇的 4 組菌株進行活化和重復發(fā)酵。 發(fā)酵液立即進行凍干、 提取和干燥， 每一個提取物分別用甲醇溶解后分成 3 等份，其中一份用于生物 測定，一份用于高效液相色譜分析， 一份冷凍保存。 1.2.3 重復發(fā)酵提取物的篩選及與原始發(fā)酵提取物的篩選結果比較1）提取物的生物測定。把各提取物配制成母液，濃度以發(fā)酵液

8、體積為基準，每4 mL發(fā)酵液的提取物為一個單位， 加入0.1 mL乙醇溶解，然后加入0.9 mL無菌水制成母液。以人工飼料表 面涂布法進行小菜蛾和棉鈴蟲的生物測定 1 ，以浸葉法進行蚜 蟲的生物測定，以瓊脂表面涂布法進行油菜、狗芽根、擬南芥除草活性的生物測定 2 ，以浸漬法進行浮萍除草活性的生物測定。各組織培養(yǎng)板中加入人工飼料或瓊脂量為 0.2 mL/ 孔，表面 涂布提取物溶液量為 0.02 mL/ 孔，每個濃度設 2 個重復。培養(yǎng) 條件為：溫度25 C,相對濕度70%-80%光照時間14 h/d 。7 d 后檢查并記錄結果。2）活性評價指標。根據活性反應的不同，使用兩項指標標 記除草活性 3

9、 ：種子不萌芽的標記為 9，植株長勢（株高）不 及空白對照的標記為 5，與空白對照相近則標記為 0；第二種以 植株黃化為指標進行標記，按 0、5Y、9Y 分級。殺蟲活性分為三 級4 ，幼蟲全部死亡標記為 9，幼蟲部分死亡或生長緩慢標記 為 5，與空白對照相近標記為 0。3）活性結果比對 5 。比較原始提取物與重復發(fā)酵提取物的 活性吻合率。在本試驗中，只要復篩活性發(fā)生變化，無論靶標增 加或減少， 都統計為復篩活性與初篩活性不吻合。 而在實際篩選 流程中，只要對任一靶標有活性，均視為重復有活性，可以進入 下一步篩選步驟。1.2.4 根據初篩結果選擇有活性的菌株， 同步進行重復發(fā)酵 常規(guī)的復篩流程，

10、需要集中一批初篩有活性的樣品，通常 6090 個，然后同時進行搖瓶發(fā)酵、提取、干燥、分析。每次發(fā)酵 都要進行菌種活化、二級發(fā)酵、提取、干燥、生物測定等，整個 流程時間長， 而且各環(huán)節(jié)之間有時間間隔， 重復發(fā)酵時間間隔通 常在 25 周以上。本試驗根據每周初篩結果，對初篩有活性的樣品，同步進行重復發(fā)酵；所用菌種為近期進行第一次發(fā)酵，菌種 只經過短期低溫保存（4 C），初篩與重復發(fā)酵間隔時間為56 周。2 結果與分析2.1長期冷凍保藏（-20 C）菌株，經過重新活化、發(fā)酵、 提取后進行篩選的結果2.1.1 長期冷藏殺蟲活性樣品重復篩選結果 為準確地比較 復篩活性重現， 把殺草活性和殺蟲活性分別進行

11、分析。 試驗結果（表 1 ）顯示，除了對蚜蟲、小菜蛾和棉鈴蟲具有廣譜活性的樣 品外，其他活性樣品復篩活性重現率均較低，平均重現率為 39.02%。2.1.2 長期冷藏除草活性樣品重復篩選結果2014年 2 1 2月擬南芥尚未進行常規(guī)篩選，所以本批樣品 復篩中沒有擬南芥進行復篩。結果（表2）顯示， 除了對油菜、浮萍和狗芽根具有廣譜活性的樣品外， 其他樣品復篩活性重現率 均低，平均重現率為 33.92%。2.2短期低溫保藏（4 C）菌株重復發(fā)酵后進行篩選的結果2.2.1 短期冷藏殺蟲活性樣品重復篩選結果 表 3 顯示，對 蚜蟲、小菜蛾和棉鈴蟲具有廣譜活性的樣品重現率達到100%，其他活性樣品復篩活

12、性重現率均大于50%，平均重現率為59.85%。2.2.2 短期冷藏除草活性樣品重復篩選結果 表 4?示，對擬南芥、油菜、浮萍和狗芽根具有廣譜活性的樣品重現率為100%，其他活性樣品復篩活性重現率均高于 50%，平均重現率為 66.95%。2.3 復篩菌株進行同步發(fā)酵的結果從 2016 年 4 月開始，對初篩有活性的菌株進行重復發(fā)酵， 連續(xù) 7 周。每周進行重復發(fā)酵樣品 20株左右。重復發(fā)酵和第一 次發(fā)酵時間間隔為 6 周左右。選擇具有殺蟲或除草活性的 182個 菌株進行重復發(fā)酵。重復發(fā)酵成功 179 株， 3 株生長不正常，復 篩重現活性的樣品共 146 個，活性重現率為 81.56%。3 討論以生物測定活性為導向的微生物源先導化合物篩選， 需要經 過初次發(fā)酵、生物測定、重復發(fā)酵和活性確認，然后進行大量發(fā) 酵，對目標化合物進行預選、分離、純化和結構分析。獲得一個 新化合物的整個篩選流程持續(xù)時間需要 40 周以上。在整個流程 中，經過幾次重復發(fā)酵、提取和純化后，其間不斷有活性化合物 流失。從本研究結果可以看出， 重復發(fā)酵對活性樣品的流失影響 很大，隨著重復發(fā)酵間隔時間的減小，活性重現率提高；在實際 篩選中，菌種活化、二級發(fā)酵、提取、生物活性測定、高效液相 色譜分析等，每個步