基因工程工具酶簡化版ppt課件

1、第二章第二章 基因工程的工具酶基因工程的工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制限制 (restriction)修飾修飾 (modification) 限制性核酸內(nèi)切酶的生物學(xué)功能：自我維護(hù)功能限制性核酸內(nèi)切酶的生物學(xué)功能：自我維護(hù)功能(只只切外來的切外來的DNA，本身，本身DNA被甲基化后切不動(dòng)被甲基化后切不動(dòng))核酸酶：水解斷裂多核苷酸鏈的兩個(gè)相鄰核苷酸的核酸酶：水解斷裂多核苷酸鏈的兩個(gè)相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵核糖核酸酶核糖核酸酶RNase：脫氧核糖核酸酶脫氧核糖核酸酶DNase：核酸外切酶核酸外切酶exonu

2、clease：核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶endonuclease： 限制性核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶： 二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性主要特性I I 型型II II 型型III III 型型限制修飾限制修飾蛋白構(gòu)造蛋白構(gòu)造異源三聚體異源三聚體同源二聚體同源二聚體異源二聚體異源二聚體切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)距識(shí)別序列距識(shí)別序列1kb1kb處隨機(jī)性切割處隨機(jī)性切割識(shí)別序列內(nèi)或識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切附近特異性切割割距識(shí)別序列下距識(shí)別序列下游游24-26bp24-26bp用途用途無運(yùn)用價(jià)值無運(yùn)用價(jià)值運(yùn)用廣泛運(yùn)用廣泛無運(yùn)用價(jià)值無運(yùn)用價(jià)值平末端平末端粘性末端粘性末端1單位酶活性單位酶活

3、性(1unit 1U)：在最適反響條件：在最適反響條件下下1小時(shí)完全切割小時(shí)完全切割1ugDNA樣品的酶量。樣品的酶量。同序同裂酶同序同裂酶(識(shí)別及酶切位點(diǎn)一樣識(shí)別及酶切位點(diǎn)一樣):同序異裂酶同序異裂酶(識(shí)別位點(diǎn)一樣但酶切位點(diǎn)不同識(shí)別位點(diǎn)一樣但酶切位點(diǎn)不同):同尾酶同尾酶(酶切位點(diǎn)不同但產(chǎn)生一樣的粘性末酶切位點(diǎn)不同但產(chǎn)生一樣的粘性末端端):酶切位點(diǎn)的計(jì)算：酶切位點(diǎn)的計(jì)算：四核苷酸識(shí)別序列：四核苷酸識(shí)別序列：44 = 25644 = 256六核苷酸識(shí)別序列：六核苷酸識(shí)別序列：46 = 409646 = 40962 2個(gè)假設(shè)：個(gè)假設(shè)：a a 隨機(jī)陳列；隨機(jī)陳列；b GCb GC含量含量50%50%

4、如：用如：用Bgl(A/GATC/T)Bgl(A/GATC/T)酶切酶切DNA49KbDNA49Kb: : 實(shí)際上的切點(diǎn)數(shù)：實(shí)際上的切點(diǎn)數(shù)： 49000/4096=12 49000/4096=12個(gè)個(gè) 實(shí)踐情況？實(shí)踐情況？三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名1973年年H.Smith和和D.Nathans提議提議每一種酶都由產(chǎn)生并純化生出該酶的細(xì)菌的種屬名中的三個(gè)每一種酶都由產(chǎn)生并純化生出該酶的細(xì)菌的種屬名中的三個(gè)英文字母合起來代表：英文字母合起來代表：第一個(gè)字母采用細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母大寫；第一個(gè)字母采用細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母大寫；第二和第三個(gè)字母小寫，采用細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母；第二和第三個(gè)字母小寫，采

5、用細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母；如大腸桿菌如大腸桿菌Escherichia coli用用Eco表示，代表從表示，代表從大腸桿菌中分別出的限制性內(nèi)切酶。大腸桿菌中分別出的限制性內(nèi)切酶。第四個(gè)字母表示菌株的類型大小寫均有，如第四個(gè)字母表示菌株的類型大小寫均有，如EcoR中的中的R代表大腸桿菌代表大腸桿菌R株。株。假設(shè)一個(gè)菌株有幾種限制酶，那么在代表菌株的字母后用羅假設(shè)一個(gè)菌株有幾種限制酶，那么在代表菌株的字母后用羅馬數(shù)字表示。馬數(shù)字表示。思索題：思索題：流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌Haemophilus influenzaed菌株菌株有三種限制酶，分別怎樣表示？有三種限制酶，分別怎樣表示？Hind I、Hin

6、dII、HindIIIBaciUus amyloliquefaciens H Streptomyces albus I一、天然一、天然DNADNA的制備的制備 1 1、天然、天然DNADNA的來源的來源染色體染色體DNADNA病毒和噬菌體病毒和噬菌體DNADNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA線粒體和葉綠體線粒體和葉綠體DNADNA第二節(jié)第二節(jié) DNA分子片段化分子片段化2、天然、天然DNA的提取的提取 預(yù)備生物資料。預(yù)備生物資料。裂解細(xì)胞。裂解細(xì)胞。分別和抽提分別和抽提DNA。二、二、DNA的純化的純化 瓊脂糖凝膠電泳洗脫法瓊脂糖凝膠電泳洗脫法 適用于小劑量適用于小劑量DNA的純化和酶切的純化和酶切DN

7、A片片段的回收。段的回收。三、三、 DNA DNA的濃縮的濃縮 乙醇沉淀法在含一價(jià)陽離子的DNA溶液中參與2體積的無水乙醇，使DNA沉淀-20，時(shí)間在30min以上經(jīng)過離心搜集沉淀的DNA溶于適量的TE緩沖液或無菌水中四、限制性核酸內(nèi)切酶反響四、限制性核酸內(nèi)切酶反響1 1、限制性核酸內(nèi)切酶反響緩沖液、限制性核酸內(nèi)切酶反響緩沖液 2、單酶切法、單酶切法 假設(shè)假設(shè)DNADNA樣品是環(huán)狀樣品是環(huán)狀DNADNA分子，完全酶切后，分子，完全酶切后，產(chǎn)生與識(shí)別序列數(shù)產(chǎn)生與識(shí)別序列數(shù)n n一樣的一樣的DNADNA片段數(shù)，片段數(shù)，并且并且DNADNA片段的兩末端一樣片段的兩末端一樣 假設(shè)假設(shè)DNADNA樣品本

8、來就是線形樣品本來就是線形 DNA DNA片段，完全片段，完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生酶切的結(jié)果，產(chǎn)生n n 1 1個(gè)個(gè) DNA DNA片段數(shù)，其中片段數(shù)，其中有兩個(gè)片段的一端仍保管原來的末端有兩個(gè)片段的一端仍保管原來的末端 3、雙酶切法 應(yīng)先用需求較低鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)展切割，然后調(diào)理緩沖應(yīng)先用需求較低鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)展切割，然后調(diào)理緩沖液的鹽濃度，再參與需求較高鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)展切割。液的鹽濃度，再參與需求較高鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)展切割。 假設(shè)兩種限制性核酸內(nèi)切酶的最適反響溫度不同，那么應(yīng)先假設(shè)兩種限制性核酸內(nèi)切酶的最適反響溫度不同，那么應(yīng)先用最適反響溫度較低的酶進(jìn)展切割，升溫后再參與第二種酶用

9、最適反響溫度較低的酶進(jìn)展切割，升溫后再參與第二種酶進(jìn)展切割。進(jìn)展切割。 假設(shè)兩種限制性核酸內(nèi)切酶的反響系統(tǒng)相差很大，會(huì)明顯影假設(shè)兩種限制性核酸內(nèi)切酶的反響系統(tǒng)相差很大，會(huì)明顯影響雙酶切結(jié)果，那么可以在第一種酶切割后，經(jīng)過凝膠電泳響雙酶切結(jié)果，那么可以在第一種酶切割后，經(jīng)過凝膠電泳回收需求的回收需求的DNADNA片段，再選用適宜的反響系統(tǒng)，進(jìn)展第二種片段，再選用適宜的反響系統(tǒng)，進(jìn)展第二種限制性核酸內(nèi)切酶的切割。限制性核酸內(nèi)切酶的切割。4、部分酶切 當(dāng)某種限制性核酸內(nèi)切酶在待切割的當(dāng)某種限制性核酸內(nèi)切酶在待切割的DNADNA分分子上有多個(gè)識(shí)別序列，并且其中一個(gè)識(shí)別序子上有多個(gè)識(shí)別序列，并且其中一個(gè)

10、識(shí)別序列正好在切割后需求回收待用的列正好在切割后需求回收待用的DNADNA片段上，片段上，假設(shè)完全酶切，勢必將此待用的假設(shè)完全酶切，勢必將此待用的DNADNA片段從中片段從中切斷。在此情況下，對切斷。在此情況下，對DNADNA樣品進(jìn)展部分酶切，樣品進(jìn)展部分酶切，經(jīng)過凝膠電泳，根據(jù)待用經(jīng)過凝膠電泳，根據(jù)待用DNADNA片段的大小，可片段的大小，可回收待用的回收待用的DNADNA片段片段 5、DNA分子的限制性圖譜五五 、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的要素、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的要素1 1DNADNA的純度的純度2 2DNADNA的甲基化程度的甲基化程度3 3酶切消化反響的溫度酶切消化反響的溫度4 4

11、DNADNA的分子構(gòu)造的分子構(gòu)造 5 5星星活性星星活性 第三節(jié)第三節(jié) DNA DNA聚合酶聚合酶 一、一、DNA聚合酶概述聚合酶概述 DNA聚合酶聚合酶polymerase： 以以DNA或或RNA為模板催化合成互補(bǔ)新為模板催化合成互補(bǔ)新鏈的酶。大多需求一個(gè)引物來起始互補(bǔ)新鏈鏈的酶。大多需求一個(gè)引物來起始互補(bǔ)新鏈的合成。的合成。 延續(xù)延續(xù)(discontinuity)：在：在DNA的一條鏈上某一位置兩的一條鏈上某一位置兩個(gè)相鄰的核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂。個(gè)相鄰的核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂。缺刻缺刻(nick)：某一位置上喪失了一個(gè)或幾個(gè)核苷酸。：某一位置上喪失了一個(gè)或幾個(gè)核苷酸。1以

12、以DNA聚合酶聚合酶I為代表的為代表的“合成型合成型2以以klenow聚合酶為代表，只需聚合酶活聚合酶為代表，只需聚合酶活性和部分外切酶的活性性和部分外切酶的活性3逆轉(zhuǎn)錄酶類，以逆轉(zhuǎn)錄酶類，以RNA作為聚合模板作為聚合模板根據(jù)模板和作用方式的不同分為三類：二、大腸桿菌二、大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I全酶全酶1 1、性質(zhì)、性質(zhì): :5 533 DNA DNA聚合酶活性聚合酶活性3 355外切核酸酶活性外切核酸酶活性5 533外切核酸酶活性外切核酸酶活性三、大腸桿菌三、大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段Klenow片段片段 1、性質(zhì)、性質(zhì) 它具有它具有53聚合活性和聚合活性和35外切外切酶活

13、性酶活性,失去了失去了53的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性.四、四、T4噬菌體噬菌體DNA聚合酶聚合酶1、性質(zhì)、性質(zhì)具有具有53聚合酶活性及聚合酶活性及35外切核酸酶活性。其外切核酸酶活性。其35外切外切酶活性對單鏈酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈的作用比對雙鏈DNA的作用更強(qiáng)。它的的作用更強(qiáng)。它的外切核酸酶活性比外切核酸酶活性比kenow片段要強(qiáng)片段要強(qiáng)200倍。倍。2、用途、用途1補(bǔ)平或標(biāo)志限制性內(nèi)切酶消化補(bǔ)平或標(biāo)志限制性內(nèi)切酶消化DNA后產(chǎn)生的后產(chǎn)生的3凹端。凹端。2對帶有對帶有3突出端的突出端的DNA分子進(jìn)展末端標(biāo)志。分子進(jìn)展末端標(biāo)志。五、五、T7噬菌體噬菌體DNA聚合酶聚合酶1 1、

14、性質(zhì)、性質(zhì) 繼續(xù)合成才干最強(qiáng)繼續(xù)合成才干最強(qiáng) 35 35外切核酸酶活性為外切核酸酶活性為klenowklenow片段的片段的10001000倍倍 沒有沒有5353外切酶活性。外切酶活性。2 2、主要用途、主要用途1 1用于拷貝長段模板的引物延伸反響。用于拷貝長段模板的引物延伸反響。2 2經(jīng)過補(bǔ)平或交換置換反響進(jìn)展快速末端經(jīng)過補(bǔ)平或交換置換反響進(jìn)展快速末端標(biāo)志。標(biāo)志。六、六、Taq DNA聚合酶聚合酶 具有53外切核酸酶活性。最正確作用溫度為75-80。無3 5外切核酸酶活性，糾錯(cuò)功能較差。用途1可使特定序列擴(kuò)增106倍。2用于聚合酶鏈?zhǔn)椒错慞CR，對DNA片段進(jìn)展體外擴(kuò)增。七、逆轉(zhuǎn)錄酶七、逆轉(zhuǎn)

15、錄酶reverse transcriptase 依賴于依賴于RNA的的DNA聚合酶聚合酶商品化逆轉(zhuǎn)錄酶：商品化逆轉(zhuǎn)錄酶： 禽源反轉(zhuǎn)錄酶禽源反轉(zhuǎn)錄酶AMVAMV， 鼠源反轉(zhuǎn)錄酶鼠源反轉(zhuǎn)錄酶MoMLVMoMLV反轉(zhuǎn)錄酶的根本特性：以反轉(zhuǎn)錄酶的根本特性：以RNA為模板聚合為模板聚合cDNA鏈鏈 雙向外切雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的雜合鏈中的RNA鏈鏈PCRPCRPolymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction 稱為聚合酶鏈反響或稱為聚合酶鏈反響或PCRPCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外速的體外DNADNA聚合程序。具有特

16、異性強(qiáng)、靈敏度高、簡聚合程序。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速、對標(biāo)本的純度要求低等特點(diǎn)。便快速、對標(biāo)本的純度要求低等特點(diǎn)。變性變性94C延伸延伸72C退火退火Tm-5C根本反響步驟根本反響步驟 PCR PCR技術(shù)的特點(diǎn)技術(shù)的特點(diǎn)高特異性高特異性高靈敏度高靈敏度簡便快速簡便快速低純度標(biāo)本也可運(yùn)用低純度標(biāo)本也可運(yùn)用第五節(jié)第五節(jié) DNA銜接酶銜接酶ligase DNA銜接酶：將兩個(gè)銜接酶：將兩個(gè)DNA片段經(jīng)過催化構(gòu)成片段經(jīng)過催化構(gòu)成3，5磷酸二酯鍵而銜接起來的酶。磷酸二酯鍵而銜接起來的酶。 T4 DNA銜接酶：可銜接銜接酶：可銜接DNA鏈平粘端均可，也鏈平粘端均可，也可連可連RNA鏈，運(yùn)用廣泛。鏈

17、，運(yùn)用廣泛。 E.coli DNA銜接酶：平端銜接效率遠(yuǎn)低于銜接酶：平端銜接效率遠(yuǎn)低于T4DNA銜銜接酶，不能銜接接酶，不能銜接RNA分子。分子。 T4 RNA銜接酶：可催化兩個(gè)單鏈銜接酶：可催化兩個(gè)單鏈DNA或或RNA分子的分子的銜接。銜接。一、銜接酶功能一、銜接酶功能1、延續(xù)修復(fù)功能、延續(xù)修復(fù)功能2、銜接功能、銜接功能三、粘性末端銜接技術(shù)三、粘性末端銜接技術(shù) 1、銜接體、銜接體(linker)技術(shù)技術(shù) 2、結(jié)合體、結(jié)合體(adaptor)技術(shù)技術(shù) 3、同聚體、同聚體(homopolymer)加尾技術(shù)加尾技術(shù)第六節(jié)第六節(jié) 結(jié)合體技術(shù)的運(yùn)用結(jié)合體技術(shù)的運(yùn)用AFLP AFLPAmplified

18、Fragment Length PolymorphismAFLP一詞是一詞是1991年年Gustavo提出的提出的;該方法結(jié)合了該方法結(jié)合了RFLP(restriction fragment length polymorphisms)技術(shù)和技術(shù)和RAPD技技術(shù)的特點(diǎn)術(shù)的特點(diǎn);運(yùn)用人工接頭運(yùn)用人工接頭Adaptor與限制性內(nèi)切酶與限制性內(nèi)切酶酶切的基因組酶切的基因組DNA片段銜接并以此為片段銜接并以此為DNA模板，合成系列模板，合成系列3末端隨機(jī)變化數(shù)末端隨機(jī)變化數(shù)個(gè)堿基且與人工接頭序列相互補(bǔ)的個(gè)堿基且與人工接頭序列相互補(bǔ)的PCR引引物，來進(jìn)展物，來進(jìn)展PCR特異條帶擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢特異條帶擴(kuò)增，

19、經(jīng)電泳檢測后可獲得測后可獲得DNA指紋圖譜。指紋圖譜。此項(xiàng)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)此項(xiàng)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)1穩(wěn)定，反復(fù)性好；穩(wěn)定，反復(fù)性好；2需用的需用的DNA量少，適用于分析的量少，適用于分析的DNA大小范大小范圍寬；圍寬；3能產(chǎn)生更多的多態(tài)性標(biāo)志，得到的條帶也更密能產(chǎn)生更多的多態(tài)性標(biāo)志，得到的條帶也更密集，普通比集，普通比RFLP和和RAPD多多10100倍，便于比倍，便于比較分析；較分析；4操作易于規(guī)范化和自動(dòng)化，適于大批量的樣品操作易于規(guī)范化和自動(dòng)化，適于大批量的樣品分析。分析。 第七節(jié)第七節(jié) 基因工程的其它酶類基因工程的其它酶類一、一、DNADNA及及RNARNA的修飾酶的修飾酶一未端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶一未端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶二堿性磷酸酶二堿性磷酸酶(alkaline phosphatase(alkaline p