乙肝抗病毒藥物綜合分析

1、乙肝抗病毒藥物綜合分析我國是乙肝大戶，有1.2億乙肝病毒攜帶者，其中，乙肝患者有3000萬人以上，目前，乙肝病毒已成為嚴重威脅我國人們身體健康的主要傳染病之一；乙肝疫苗可預(yù)防在未感染人群中的傳播，但對已感染乙肝病毒的人群，還需用藥物進行治療，控制和殺滅乙肝病毒的手段有生物制劑、核苷類化學(xué)藥、中藥等藥物治療，在眾多治療藥物中，還未能真正清除體內(nèi)乙肝病毒的藥物，甚至，有些藥物在停藥或病毒產(chǎn)生耐藥性后，病毒出現(xiàn)爆發(fā)性擴增，造成肝臟嚴重損傷。要發(fā)現(xiàn)并開發(fā)出更有效的抗乙肝病毒藥物，只有充分了解乙肝病毒具有獨特的病毒特征和感染復(fù)制周期的特點，才能找到更有效預(yù)防和治療乙肝病毒的方法或手段。本文從以下幾方面進

2、行闡述和分析，以圖找到更合理、科學(xué)的藥物開發(fā)方向和治療手段；內(nèi)容包括：1、乙肝病毒結(jié)構(gòu)及復(fù)制周期的特殊性分析；2、控制和殺滅病毒關(guān)鍵環(huán)節(jié)的分析；3、現(xiàn)已上市和正在研發(fā)的抗乙肝病毒藥物優(yōu)點及存在不足的分析；4、形成更有效抗乙肝藥物的可能途徑。一、乙肝病毒結(jié)構(gòu)及復(fù)制周期的特殊性分析乙肝病毒從其感染周期及結(jié)構(gòu)上，都具有與其他病毒不同的特征；首先從結(jié)構(gòu)上，感染型乙肝病毒顆粒具有以下特征：1、 有兩層外鞘蛋白結(jié)構(gòu)保護核心乙肝DNA，其中外層是由脂質(zhì)雙層膜鑲嵌乙肝病毒表面抗原（HBsAg）構(gòu)成，內(nèi)層由乙肝病毒核心抗原(HBcAg)包裹，乙肝病毒DNA依附在核心抗原上。2、 乙肝病毒DNA雙鏈中正鏈?zhǔn)遣煌暾?/p>

3、、有缺失，需要在進入細胞核，在DNA聚合酶作用下延長形成完整的正鏈。3、 在細胞核中形成的完整、閉合的雙鏈DNA(ccDNA)具有對細胞中DNA酶、藥物等形成抗性的特征。乙肝病毒感染復(fù)制具有以下特征：1、 乙肝病毒具有嗜肝細胞特征，而引導(dǎo)病毒進入肝細胞的決定因素在于乙肝病毒外層膜結(jié)構(gòu)，HBsAg是導(dǎo)向病毒顆粒進入細胞的關(guān)鍵因素，而脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)容易與肝細胞膜融合，使乙肝病毒順利進入肝細胞內(nèi)。2、 包裹DNA內(nèi)層的HBcAg的作用既有保護病毒DNA被細胞質(zhì)中DNA酶的破壞，同時可導(dǎo)向病毒DNA進入高爾基氏體和細胞核中。3、 在細胞核中DNA聚合酶的作用下，以負鏈為模版，延長正鏈，兩條DNA鏈以共

4、價、閉環(huán)的形式存在（cccDNA）。4、 cccDNA在轉(zhuǎn)錄酶的作用下，形成mRNA和tRNA，mRNA在細胞漿中翻譯HBcAg和HBsAg，tRNA作為模版，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，形成乙肝病毒DNA負鏈，以負鏈為模版，在DNA聚合酶作用下，復(fù)制不完整的正鏈，在整個的逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的過程中，tRNA和DNA負鏈都必須附著在HBcAg蛋白上進行。5、 形成的外包裹HBcAg的病毒雙鏈DNA可進入兩條通道，一條通道再次進入細胞核，形成cccDNA，另一條通道進入高爾基氏體，形成由HBsAg鑲嵌的脂質(zhì)雙層膜的完整乙肝病毒顆粒，細胞以“吐泡”的方式排出乙肝病毒。6、 完整的乙肝病毒顆粒具有傳播感染能力，而

5、在肝組織中感染途徑主要以細胞間橋（細胞間通路）進行擴散為主，其次肝組織組織液間傳播，以至整個肝組織細胞中都存在乙肝病毒。7、 乙肝病毒感染肝細胞，并不象許多病毒感染后引起細胞破裂或壞死，乙肝病毒并不直接損傷肝細胞，只是間接影響肝細胞蛋白質(zhì)合成及肝細胞再生，直接對肝細胞發(fā)生破壞和損傷的是激發(fā)自身免疫系統(tǒng)，從而發(fā)起對帶有異種抗原的肝細胞攻擊。二、控制和殺滅乙肝病毒關(guān)鍵環(huán)節(jié)的分析防止乙肝病毒對肝細胞的侵入并在肝細胞中的擴增，是控制和殺滅乙肝病毒的關(guān)鍵。從乙肝病毒的結(jié)構(gòu)特征和復(fù)制、裝配的特點，通過控制和抑制以下環(huán)節(jié)，都能有效達到阻止乙肝病毒對肝細胞的侵入及病毒擴增：1、 乙肝病毒顆粒的外層膜（脂質(zhì)雙層

6、膜鑲嵌HBsAg）是引入病毒進入細胞的關(guān)鍵，如破壞此層膜結(jié)構(gòu)，將阻斷乙肝病毒進入肝細胞及阻斷乙肝病毒在肝細胞間的傳播。理論上，使用表面活性劑，可破壞膜結(jié)構(gòu)，以阻斷病毒侵入肝細胞；通過HBsAg免疫疫苗激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或注射HBsAg抗體，通過“空間位阻”效應(yīng)，可阻斷乙肝病毒進入細胞，也可通過激活免疫系統(tǒng)，將病毒體清除。2、 控制或抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄mRNA、tRNA，或加速病毒mRNA、tRNA破壞。如阻斷了mRNA的形成，就可阻斷HBcAg及HBsAg以及逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白產(chǎn)生，如阻斷了tRNA的形成，就阻斷了RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA。要達到此目的有三條途徑：a、抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄RNA的啟動子

7、，但cccDNA是以共價、閉環(huán)的結(jié)構(gòu)存在，外界因素很難對其結(jié)構(gòu)發(fā)生攻擊；b、抑制或阻斷轉(zhuǎn)錄酶的作用，DNA轉(zhuǎn)錄RNA是通過RNA轉(zhuǎn)錄酶的作用完成的,但RNA轉(zhuǎn)錄酶是肝細胞自身存在的酶，如抑制了RNA轉(zhuǎn)錄酶，則肝臟中其他功能蛋白的形成將被抑制，毒性比較大。c、加速病毒mRNA、tRNA的破壞，干擾素的抗病毒作用的機制可以給予啟示，IFN的抗病毒活性主要通過三條途徑完成：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶途徑(PKR，可抑制病毒蛋白的翻譯)、2'-5A系統(tǒng)(可分解病毒RNA)和MX蛋白(干擾病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄)。干擾素主要的作用，就是激活細胞自身清除異物的功能，達到清除病毒。3、 抑制乙肝病毒DNA聚

8、合酶以及RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的功能，乙肝病毒在肝細胞中的聚合酶以及自身形成的逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄形成負鏈DNA，并以負鏈為模版，在聚合酶的作用下，復(fù)制正鏈。通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶的作用，就可阻斷乙肝病毒DNA鏈的復(fù)制及病毒DNA的擴增；目前，大部分已上市的核苷類抗乙肝病毒藥物都屬于此類作用機制，作用的形式主要通過嘧啶或嘌啉的擬似物或通過代謝后形成的擬似物，通過擬似物以底物競爭性抑制或?qū)M似物在復(fù)制過程中整合在延長的DNA鏈上，阻斷了逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶對DNA鏈的延長以及DNA鏈的復(fù)制。4、 阻斷或破壞HBcAg在乙肝病毒擴增過程中發(fā)揮的功能；HBcAg不僅僅是乙肝病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)成分，HBcAg

9、在乙肝病毒整個復(fù)制和擴增過程發(fā)揮重要作用，主要體現(xiàn)在：a、保護乙肝病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中形成的RNA和DNA，免遭細胞中的RNA、DNA酶的破壞，因在細胞漿裸露存在的DNA、RNA易被酶破壞；b、在乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中，HBcAg充當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶的附著點，只有HBcAg結(jié)構(gòu)完整，才能保證酶高效、有序完成逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的過程，當(dāng)HBcAg結(jié)構(gòu)被破壞，乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程將被終止；c、在細胞漿形成的不完成DNA雙鏈，只有通過 HBcAg導(dǎo)入，才能進入細胞核，在細胞核聚合酶的作用下，形成共價、閉環(huán)、完整雙鏈的乙肝病毒DNA（cccDNA）；沒有HBcAg的導(dǎo)入，就不能完成在細胞內(nèi)cccDN

10、A的循環(huán)。三、藥物及生物制品在抗乙肝病毒作用中的優(yōu)缺點分析應(yīng)用于乙肝病毒預(yù)防和治療的藥物，可以分成三大類：1、生物制品，包括乙肝疫苗、乙肝病毒（HBsAg）免疫球蛋白以及干擾素；2、核苷類抗乙肝病毒化藥；3、中成藥，主要作用在于保肝、護肝、退黃疸等作用，在此不做重點分析。（一）、生物制品抗病毒作用優(yōu)缺點分析針對抗乙肝病毒的生物制劑，主要是乙肝疫苗、抗乙肝病毒免疫球蛋白和干擾素，其他如IL-1、IL-2以及胸腺肽應(yīng)用乙肝病毒的治療在臨床上不常用。A、乙肝疫苗自20世紀70年代以來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，F(xiàn)IB疫苗也不斷更新?lián)Q代，從第1代血源性乙肝疫苗(PDV)，到第2代基因工程FIB疫苗，目前已進

11、入第3代卸3sAg合成肽段FIB疫苗的研制。由于PDV的血漿原料減少。難以大量生產(chǎn)，同時經(jīng)3步滅活不足以將其中已知和未知的潛在致病因子全部殺滅，目前廣泛使用的是基因工程乙肝疫苗.基因工程乙肝疫苗是把修飾、剪接的HBsAg基因編碼片段轉(zhuǎn)給酵母、哺乳動物細胞等，而獲得高效表達的HBsAg，作為生產(chǎn)HB疫苗的原料。主要有重組酵母HB疫苗(YDV)、中華地鼠卵巢細胞(CHO)表達的重組FIB疫苗和重組痘苗病毒疫苗3種， 目前應(yīng)用最廣泛的是重組酵母HB疫苗(YDV)。基因工程乙肝疫苗的免疫原性、安全性、免疫持久性、保護率和阻斷母嬰傳播等方面在實踐中都已得到了充分證實?；蚬こ桃腋我呙缭趪鴥?nèi)外的廣泛使用中

12、取得了明顯成功，在現(xiàn)階段是防制HBV傳播的根本性措施也是控制HB的最有效策略。乙肝疫苗是主動免疫，通過注射無毒的乙肝疫苗（HBsAg片段），出發(fā)自身產(chǎn)生抗HBsAg的IgG抗體，產(chǎn)生的抗體可以與來自于血源或體液感染的乙肝病毒結(jié)合，激活補體系統(tǒng)和天然的免疫系統(tǒng)，對病毒殺滅，阻斷了乙肝病毒從血液及體液進入肝細胞途徑，對于預(yù)防感染乙肝病毒起重要作用。但乙肝疫苗僅限于未感染乙肝病毒的人群使用，一旦感染了乙肝病毒，注射乙肝疫苗對控制和殺滅病毒作用不大，反而會激活自身免疫系統(tǒng)對攜帶HBsAg的肝細胞發(fā)生攻擊，造成肝組織損傷。原因在于乙肝病毒一旦進入肝細胞后，復(fù)制、裝配形成的感染型病毒顆粒，釋放形式主要不是

13、通過破壞細胞后，病毒進入血液或組織液進行傳播，而是通過細胞間橋的方式直接傳播其他未感染的肝細胞，此時，通過免疫疫苗產(chǎn)生的抗體不能阻止此種途徑的傳播。附：治療性乙肝疫苗的分析目前，國內(nèi)外有多家研究機構(gòu)和跨國公司正在開發(fā)治療性乙肝疫苗。從免疫學(xué)的角度分析，對大部分病毒，自身免疫發(fā)揮抗病毒作用，主要是通過細胞免疫和淋巴因子發(fā)揮作用的，而體液免疫抗病毒方面的作用，除呼吸道、生殖道和腸道通過分泌型IgA（sIgA）抗體發(fā)揮抗病毒作用外，其他產(chǎn)生的抗體反而起到免疫抑制和免疫耐受的作用?；谝陨系目紤]，治療性免疫疫苗的開發(fā)，重點在于激發(fā)細胞免疫和淋巴因子的形成，激活的自身細胞免疫直接對攜帶乙肝病毒的肝細胞發(fā)

14、生攻擊，從而殺滅乙肝病毒。治療性乙肝疫苗使用的抗原有：乙肝病毒DNA、滅活乙肝病毒、重組HBsAg抗原，但乙肝病毒DNA，抗原的免疫原性弱，不易激活免疫系統(tǒng)；滅活的乙肝病毒作為抗原，存在還有殘留病毒活性（因乙肝病毒抵抗理化因素殺毒的能力強）的風(fēng)險。通過激活的特異性免疫反應(yīng)，對肝細胞中的乙肝病毒發(fā)生攻擊，參與免疫攻擊的細胞主要由Tc、k細胞、NK細胞以及細胞毒因子，使攜帶乙肝病毒的肝細胞都成為免疫攻擊細胞的靶細胞，在攻擊的過程中，不僅把乙肝病毒殺死，同時，把攜帶乙肝病毒的肝細胞也出現(xiàn)損傷或被殺死；在這種狀況下，在臨床應(yīng)用過程中，有可能出現(xiàn)大面積肝組織壞死風(fēng)險。治療性乙肝疫苗，盡管目前已成為國內(nèi)外

15、機構(gòu)和公司研究的熱點，但其存在以下不足：、其使用的乙肝病毒抗原，免疫原性弱，不易激發(fā)免疫系統(tǒng)引起特異性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗病毒作用的效果差。、在攜帶乙肝病毒的人群中，有相當(dāng)部分的人群血液中存在乙肝病毒的抗體，當(dāng)使用外源性抗原時，容易與自身產(chǎn)生的抗體發(fā)生反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，造成包括腎等組織的損傷；或增加外源性抗原，進一步強化了免疫耐受（免疫無應(yīng)答）。、大部分乙肝病毒攜帶者，隨著感染時間的延長，肝組織中許多肝細胞都存在乙肝病毒，當(dāng)激活特異性免疫反應(yīng)時，將引起大量的肝細胞壞死。正因為存在以上不確定因素及風(fēng)險，大多數(shù)研究和開發(fā)治療性乙肝疫苗的機構(gòu)和公司，已從研究熱點逐漸轉(zhuǎn)變更理性，眾多治療性乙肝疫苗在I

16、期臨床就放棄進一步開發(fā)。B、干擾素干擾素可以大體分成I型干擾素和II型干擾素，I型干擾素主要包括人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的、以及在反芻動物中發(fā)現(xiàn)的，以及小鼠中發(fā)現(xiàn)的等幾個亞族；所有的I型干擾素基因來自于一個共同祖先基因，位于同一條染色體上的相鄰位置(人9號染色體和小鼠4號染色體)。型干擾素只有一種干擾素，也被稱為免疫干擾素，IFN主要由活化的T細胞產(chǎn)生。最近發(fā)現(xiàn)的干擾素被認為是新的一族干擾素。IFN的抗病毒活性主要通過三條途徑完成：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶途徑(PKR，可抑制病毒蛋白的翻譯)、2'-5A系統(tǒng)(可分解病毒RNA)和MX蛋白(干擾病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄)。具體抗病毒表現(xiàn)為：干擾素可與肝細胞表面

17、特異性受體結(jié)合，促進2-5寡核苷酸的合成，繼而激活內(nèi)源性核糖核酸，降解病毒，裂解受感染細胞內(nèi)的信使核糖核酸(mRNA)，使病毒特異性蛋白合成減少，還可通過介導(dǎo)真核啟動因子-2a亞單位磷酸化，阻斷HBV、HCV的mRNA在人體肝細胞內(nèi)的傳遞和病毒細胞蛋白的合成。 通過特異性的抗原激活產(chǎn)生的干擾素，具有針對性抗帶有特種抗原的病原的殺傷，干擾素本身沒有直接的殺病原的作用，它主要通過激活自身細胞內(nèi)的清除系統(tǒng)，抑制DNA轉(zhuǎn)錄RNA，以及激活DNA、RNA水解酶，分解和破壞病原DNA和RNA，從而達到清除病原體的作用，尤其在自身抗病毒方面，干擾素起到重要作用。 但不同來源的干擾素具有種屬特異性，只有針對病

18、原體產(chǎn)生的特異性干擾素，才能發(fā)揮最好的作用，否則，外源性的干擾素在抗病毒的過程中，不僅對病原體DNA和RNA有干擾和破壞作用，對正常細胞的DNA轉(zhuǎn)錄，RNA翻譯蛋白的過程也會受到影響（主要體現(xiàn)在干擾素不良反應(yīng)方面）。要充分發(fā)揮干擾素抗病毒作用，需要滿足兩個條件：、產(chǎn)生的干擾素沒有種屬差異性，要滿足此條件，只有自身正常細胞產(chǎn)生的干擾素才具備；、產(chǎn)生的干擾素具有針對特定病原體的特異性。要達到以上條件，只有用特異性病原體或抗原刺激正常細胞或免疫細胞，產(chǎn)生的干擾素才能發(fā)揮最佳的抗特定病原體的作用。但，臨床上常用的干擾素，絕大部分是從不同種屬來源的干擾素，存在種屬差異性，而且不是針對特定病原體產(chǎn)生的干擾

19、素，其抗特定病原體的作用下降。（二）、核苷類抗乙肝病毒作用優(yōu)缺點分析目前，上市的抗乙肝病毒化學(xué)藥物大部分為核苷類藥物，通過代謝或直接作為酶底物形成嘧啶或嘌呤擬似物，整合在復(fù)制過程中的DNA鏈上，阻斷DNA鏈的延伸，作用的靶點主要為抑制RNA逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA復(fù)制酶，以控制和降低病毒DNA載量。目前，已上市的各核苷類抗乙肝病毒藥的理化特性、作用特點、代謝特征以及安全性。核苷類抗乙肝病毒的作用可歸納為以下三條途徑：、通過形成代謝產(chǎn)物，以底物的形式與正常的核苷與聚合酶發(fā)生競爭性抑制作用，使乙肝病毒DNA負鏈不能正常復(fù)制正鏈DNA，不能形成完整的乙肝病毒DNA雙鏈，所有的核苷類藥物都具有此作用；、抑制R

20、NA逆轉(zhuǎn)錄酶作用，使乙肝病毒負鏈DNA不能形成，恩替卡韋具備此作用；、在DNA聚合酶的作用下，將核苷擬似物整合在復(fù)制過程中的DNA鏈中，使復(fù)制過程終止。抑制RNA逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的核苷類藥物，聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶對產(chǎn)物（DNA鏈）具有催化放大的效應(yīng)，當(dāng)核苷類藥物抑制以上兩類酶的催化放大效應(yīng)，將很快反映病毒DNA載量的急劇下降，乙肝病毒的擴增和傳染將得到控制。但核苷類藥物存在以下不足：、抑制了聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，但對cccDNA轉(zhuǎn)錄RNA的過程沒有作用，當(dāng)復(fù)制過程受到抑制時，cccDNA的轉(zhuǎn)錄將反饋性擴大轉(zhuǎn)錄，細胞將出現(xiàn)更多的mRNA以及tRNA，對病毒蛋白的翻譯不受影響，反而有擴增，大量

21、的HBsAg、HBcAg抗原形成，大量HBsAg、HBcAg分泌，將導(dǎo)致免疫進一步耐受。、核苷類藥物是酶（聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶）的競爭性底物，起競爭性抑制作用，與底物濃度顯正相關(guān)的關(guān)系，濃度越高，其抑制作用越強，當(dāng)無法控制DNA的轉(zhuǎn)錄時，產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄酶以及逆轉(zhuǎn)錄模版會因此增強，將引起酶對抑制底物的“逃逸”現(xiàn)象，RNA的逆轉(zhuǎn)錄和DNA的復(fù)制繼續(xù)進行。、抑制性底物持續(xù)的作用，將誘導(dǎo)病毒RNA和DNA的變異，將回避抑制性底物對酶的抑制作用，這種變異導(dǎo)致的耐藥性的強弱，與作用靶點多少與直接關(guān)系，作用于多個靶點的藥物，變異產(chǎn)生的耐藥性的幾率要小，如恩替卡韋對多個靶點（即抑制聚合酶，也抑制逆轉(zhuǎn)錄酶）起抑制作用，其抗病毒的作用比其他核苷類藥物強，同時產(chǎn)生耐藥的幾率也降低。四、形成更有效治療和預(yù)防乙肝病毒的途徑通過對控制乙肝病毒復(fù)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以及對用于抗乙肝病毒藥物作用的優(yōu)缺點分析，要正真達到更有效控制或殺滅乙肝病毒，需要從控制乙肝病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的