第2章__核酸的分離純化

1、第二章 核酸的分離純化uDNADNA和和RNARNA是生物體中最重要的核酸分子，是是生物體中最重要的核酸分子，是分子生物學(xué)和分子診斷的研究對象分子生物學(xué)和分子診斷的研究對象uDNADNA和和RNARNA的分離純化是分子生物學(xué)研究及分的分離純化是分子生物學(xué)研究及分子診斷最基礎(chǔ)的工作子診斷最基礎(chǔ)的工作核酸分離純化的核酸分離純化的原則原則: :u保持核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性保持核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性u盡可能提高核酸制品的純度盡可能提高核酸制品的純度核酸分子提取的技術(shù)路線I. I.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備II.II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.I

2、V.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中第一節(jié)第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計及原則核酸分離純化的設(shè)計及原則第二節(jié)第二節(jié) 基因組基因組DNADNA的分離純化的分離純化第三節(jié)第三節(jié) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取與純化的提取與純化第四節(jié)第四節(jié) RNARNA的分離純化的分離純化第五節(jié)第五節(jié) 核酸的保存與鑒定核酸的保存與鑒定第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計及原則一、材料與方法的選擇一、材料與方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計二、技術(shù)路線的設(shè)計三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存（一） 材料與方法的選擇 不同的研究目的對核酸的完整性、純度、不

3、同的研究目的對核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度有不同的要求。產(chǎn)量及濃度有不同的要求。u需考慮制備核酸所需的時間與成本需考慮制備核酸所需的時間與成本u應(yīng)選擇安全的試劑與制備方案應(yīng)選擇安全的試劑與制備方案一、材料與方法的選擇一、材料與方法的選擇 1.1.保持核酸堿基序列的完整性保持核酸堿基序列的完整性 2.2.盡量清除其它分子的污染，保證核酸純度盡量清除其它分子的污染，保證核酸純度 3.3.保持核酸的完整性保持核酸的完整性 盡量簡化分離純化步驟，縮短提取時間盡量簡化分離純化步驟，縮短提取時間 盡量避免各種有害因素對核酸的破壞盡量避免各種有害因素對核酸的破壞 （二）（二） 選擇原則選擇原則一、材料與方

4、法的選擇一、材料與方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計二、技術(shù)路線的設(shè)計（一）核酸的釋放（一）核酸的釋放（二）核酸的分離與純化（二）核酸的分離與純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌（一）核酸的釋放 DNADNA和和RNARNA均位于細(xì)胞內(nèi)（病毒除外），因均位于細(xì)胞內(nèi)（病毒除外），因此核酸分離與純化的此核酸分離與純化的第一步第一步即是裂解細(xì)胞、釋即是裂解細(xì)胞、釋放核酸。放核酸。 應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括: : 1. 1.非核酸的大分子污染物非核酸的大分子污染物 蛋白質(zhì)、多糖及脂類物質(zhì)等蛋白質(zhì)、多糖及脂類物質(zhì)等 2.2.非需要的核酸分子非需要的核酸分子 分離某一

5、核酸分子時，其它核酸皆為雜質(zhì)分離某一核酸分子時，其它核酸皆為雜質(zhì) 3.3.加入的有機溶劑和某些金屬離子加入的有機溶劑和某些金屬離子（二）核酸的分離與純化（二）核酸的分離與純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌u沉淀沉淀是是濃縮濃縮核酸最常用的方法核酸最常用的方法u常用的常用的鹽類鹽類: :醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂鈉、氯化鉀及氯化鎂u常用的常用的有機溶劑有機溶劑: :乙醇、異丙醇和聚乙二醇乙醇、異丙醇和聚乙二醇u核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%70%75%75%的乙醇的乙醇洗滌洗滌去除去除三、核酸的鑒定與保

6、存三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（一）核酸的鑒定（二）核酸的保存（二）核酸的保存（一）核酸的鑒定（一）核酸的鑒定1.1.濃度鑒定濃度鑒定2.2.純度鑒定純度鑒定3.3.完整性鑒定完整性鑒定 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，可以吸收紫外線，其最大吸收波長為可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm260nm。 1.1.濃度鑒定濃度鑒定 各種堿基的紫外吸收光譜各種堿基的紫外吸收光譜 熒光光度法：熒光光度法： 核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在本身無熒光的核酸在 U

7、V UV 激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。熒光強度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。熒光強度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。EBEB與與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 主要通過主要通過A A260260與與A A280280的比值來判定有無蛋白質(zhì)的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染。比值升高或降低均提示制備的核酸純度的污染。比值升高或降低均提示制備的核酸純度不佳。不佳。 2. 2. 純度鑒定純度鑒定1.DNA1.DNA或或RNARNA的定量的定量ODOD260260=1.0=1.0相當(dāng)于相當(dāng)于 50 50g/mlg/ml雙鏈雙鏈DNADNA 40 40g/mlg/ml

8、單鏈單鏈DNADNA（或（或RNARNA） 20 20g/mlg/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判斷核酸樣品的純度判斷核酸樣品的純度 DNA DNA純品純品: : ODOD260260/OD/OD280 280 = 1.8= 1.8 RNA RNA純品純品: : ODOD260260/OD/OD280 280 = 2.0= 2.0熒光光度法：熒光光度法： EBEB等熒光染料示蹤的核酸電泳可判定核等熒光染料示蹤的核酸電泳可判定核酸制品的純度。酸制品的純度。瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳：u以以EBEB為示蹤劑的核酸凝膠電泳可判定核酸為示蹤劑的核酸凝膠電泳可判定核酸制品的完整性制品的完整性u基因組基

9、因組DNADNA如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀 3.3.完整性鑒定完整性鑒定DNADNA的降解的降解 完整的或降解很少的完整的或降解很少的總總RNARNA電泳圖譜中，三條電泳圖譜中，三條帶熒光強度應(yīng)呈特定的比值。帶熒光強度應(yīng)呈特定的比值。u沉降系數(shù)大，電泳遷移率低，熒光強度高沉降系數(shù)大，電泳遷移率低，熒光強度高u沉降系數(shù)小，電泳遷移率高，熒光強度低沉降系數(shù)小，電泳遷移率高，熒光強度低 u28S28S（或（或23S23S）RNARNA的熒光強度一般約為的熒光強度一般約為18S18S（或（或16S16S）RNARNA的的2 2倍，否則提示有倍，否則提示有RNARNA的降解

10、的降解u若在點樣孔附近有著色條帶，提示可能存在若在點樣孔附近有著色條帶，提示可能存在DNADNA的污染的污染（二）核酸的保存（二）核酸的保存1.DNA1.DNA的儲存的儲存2.RNA2.RNA的儲存的儲存 溶于溶于TETE緩沖液中的緩沖液中的DNADNA在在-70-70冰箱可保存數(shù)年。冰箱可保存數(shù)年。 TETE的的pHpH為為8.08.0時，時，DNADNA的脫氨反應(yīng)減少，的脫氨反應(yīng)減少，pHpH低低7.07.0時時DNADNA易變性。易變性。 1. DNA 1. DNA的保存的保存 2.RNA的保存 RNARNA溶于溶于H H2 2O O或或0.3mol/L0.3mol/L的的NaAcNaA

11、c溶液中，溶液中，-70 -70 保存保存 RNARNA溶液中加入溶液中加入RNasinRNasin或或VRCVRC，可延長保存時間，可延長保存時間 用于配置試劑及溶解用于配置試劑及溶解RNARNA的的H H2 2O O均應(yīng)經(jīng)均應(yīng)經(jīng)DEPCDEPC處理處理第二節(jié) 真核基因組DNA的分離純化生物體組織細(xì)胞生物體組織細(xì)胞玻棒纏繞法玻棒纏繞法酚抽提法酚抽提法基因組基因組 DNA粗品粗品PFGE分離分離特定的特定的DNA片段片段AGE分離分離PAGE分離分離乙醇沉淀洗滌乙醇沉淀洗滌基因組基因組DNA純品純品精分離精分離粗分離粗分離前處理前處理離子交換層析純化離子交換層析純化有機溶劑抽提有機溶劑抽提細(xì)胞

12、裂解蛋白質(zhì)變性沉細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)變性沉淀降解淀降解DNA釋放釋放甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法 哺乳動物基因組哺乳動物基因組DNADNA分離純化的一般技術(shù)路線分離純化的一般技術(shù)路線基因組基因組DNA的提取的提取 - 酚抽提法酚抽提法樣品的準(zhǔn)備細(xì)胞的裂解蛋白質(zhì)變性DNA的抽提DNA的沉淀血基因組血基因組DNA試劑盒試劑盒酵母基因組酵母基因組DNA試劑盒試劑盒細(xì)菌基因組細(xì)菌基因組DNA試劑盒試劑盒細(xì)胞基因組細(xì)胞基因組DNA試劑盒試劑盒一、酚抽提法一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法三、玻棒纏繞法三、玻棒纏繞法四、其它方法四、其它方法五、五、DNADNA片段的純化片段的純化六、六、DNADNA片段的

13、回收片段的回收 一、酚抽提法u19761976年由年由StaffordStafford及其同事創(chuàng)立，現(xiàn)在使用的及其同事創(chuàng)立，現(xiàn)在使用的是改進的方法是改進的方法u以含以含EDTAEDTA、SDSSDS及及RNaseRNase的的裂解緩沖液裂解細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞u經(jīng)經(jīng)蛋白酶蛋白酶K K處理后，用處理后，用pH8.0pH8.0的的TrisTris飽和酚飽和酚抽提，抽提，獲得獲得DNADNA粗制品粗制品二、甲酰胺解聚法 19871987年年KupiecKupiec等報道了甲酰胺解聚法，等報道了甲酰胺解聚法，其其中細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)水解步驟同酚抽提法，但中細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)水解步驟同酚抽提法，但不進行酚

14、的抽提。不進行酚的抽提。 三、玻棒纏繞法玻棒玻棒纏繞法是在纏繞法是在Bowtell(1987)Bowtell(1987)方法的基礎(chǔ)上經(jīng)改進而來方法的基礎(chǔ)上經(jīng)改進而來四、其它方法 有些分子診斷技術(shù)并不需要高分子量的有些分子診斷技術(shù)并不需要高分子量的DNADNA樣品，因此步驟簡化、操作簡便的樣品，因此步驟簡化、操作簡便的DNADNA快速快速提取法廣泛使用。提取法廣泛使用。 1.1.異丙醇沉淀法異丙醇沉淀法 2.2.玻璃珠吸附法玻璃珠吸附法五、 DNA片段的純化 常用的純化方法：常用的純化方法： 有機溶劑抽提法有機溶劑抽提法 柱層析法（柱層析法（column chromatographycolumn

15、 chromatography）六、 DNA片段的回收原則與要求原則與要求: : 1. 1.提高片段的回收率提高片段的回收率 2.2.清除回收的清除回收的DNADNA樣品中的雜質(zhì)樣品中的雜質(zhì)（二）（二） 從聚丙烯酰胺凝膠中回收從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNADNA片段片段（一）（一） 從瓊脂糖凝膠中回收從瓊脂糖凝膠中回收DNADNA片段片段1.1.二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基- -纖維素膜插片電泳法纖維素膜插片電泳法2.2.電泳洗脫法電泳洗脫法3.3.冷凍擠壓法冷凍擠壓法4.4.低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法 （一） 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段（二）從聚丙烯酰胺凝膠中回收D

16、NA片段 標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。費時但操作簡標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。費時但操作簡單，是小片段單，是小片段DNADNA回收的較好方法?；厥盏妮^好方法。第三節(jié) 質(zhì)粒DNA的提取與純化 u質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子其大小范圍從lkb至200kb以上不等已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒這些質(zhì)粒都是獨立于細(xì)菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。u質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細(xì)菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術(shù)。 質(zhì)粒特性質(zhì)粒特性1. 分子相對小 2. 含有高效的自主復(fù)制成分 3. 不

17、相容性4. 轉(zhuǎn)移性5. 選擇的標(biāo)記6. 限制性內(nèi)切酶單一切。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取和純化的提取和純化 1 1細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng) 先分離單個菌落，接種先分離單個菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細(xì)培養(yǎng)基中擴增，隨著細(xì)菌的生長，質(zhì)粒菌的生長，質(zhì)粒DNADNA也也在自主復(fù)制。在自主復(fù)制。質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量制備的小量制備 2-5ml質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的大量制備的大量制備 500ml2細(xì)菌的收集u細(xì)胞生長過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈 堿裂解法堿裂解

18、法 煮沸法煮沸法 SDSSDS裂解法裂解法 Triton-Triton-溶菌酶法溶菌酶法 3細(xì)菌的裂解方法方法4質(zhì)粒DNA的提取- 適用于大質(zhì)粒適用于大質(zhì)粒DNA- 不適宜含糖高的菌株如不適宜含糖高的菌株如HB101二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法三、三、SDS裂解法裂解法四、其他方法四、其他方法一、堿裂解法一、堿裂解法五、質(zhì)粒五、質(zhì)粒DNADNA的純化的純化一、堿裂解法 在強堿（在強堿（pH12.0pH12.012.612.6）條件下，用）條件下，用SDSSDS破破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNADNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DN

19、ADNA。u細(xì)胞裂解后，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的碎片、變性細(xì)胞裂解后，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的碎片、變性的蛋白質(zhì)和的蛋白質(zhì)和染色體染色體DNADNA形成大的復(fù)合物形成大的復(fù)合物u當(dāng)當(dāng)pHpH調(diào)至中性，質(zhì)粒調(diào)至中性，質(zhì)粒DNADNA重新恢復(fù)天然的超螺重新恢復(fù)天然的超螺旋結(jié)構(gòu)旋結(jié)構(gòu)u在高鹽條件下沉淀，經(jīng)離心分離，在高鹽條件下沉淀，經(jīng)離心分離，質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA保保留在上清液中留在上清液中二、煮沸裂解法 將細(xì)菌懸浮于含將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100TritonX-100和溶菌酶和溶菌酶的緩的緩沖液中，沖液中，TritonX-100TritonX-100和溶菌酶能破壞細(xì)胞壁，和溶菌酶能破壞細(xì)胞壁，再用沸水浴裂

20、解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與再用沸水浴裂解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNADNA變性。變性。u質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA因結(jié)構(gòu)緊密不會解鏈，當(dāng)溫度下降因結(jié)構(gòu)緊密不會解鏈，當(dāng)溫度下降后，可重新恢復(fù)其天然超螺旋結(jié)構(gòu)后，可重新恢復(fù)其天然超螺旋結(jié)構(gòu)u通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA, DNA, 然后回收上清液中的質(zhì)粒然后回收上清液中的質(zhì)粒DNADNA三、SDS裂解法u將細(xì)菌懸浮于等滲的將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液蔗糖溶液中，用中，用溶菌酶和溶菌酶和EDTAEDTA處理以破壞細(xì)胞壁處理以破壞細(xì)胞壁u用用SDSSDS裂解去壁細(xì)胞，溫和釋放質(zhì)粒到等滲液中裂解去壁細(xì)胞，溫和釋

21、放質(zhì)粒到等滲液中u用酚用酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNADNA 由于條件溫和，由于條件溫和， SDSSDS裂解法裂解法特別適用于特別適用于大大質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA（15kb15kb）的提取。但由于部分質(zhì)粒）的提取。但由于部分質(zhì)粒DNADNA會與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率會與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。不高。四、其他方法（二）牙簽少量制備法（二）牙簽少量制備法( (一一) ) 小量一步提取法小量一步提取法( (一一) ) 小量一步提取法小量一步提取法u直接將酚直接將酚/ /氯仿與細(xì)菌培養(yǎng)物混合，然后離心去氯仿與細(xì)菌培養(yǎng)物混合，然后離心去除大部

22、分蛋白質(zhì)和染色體除大部分蛋白質(zhì)和染色體DNADNA，最后從上清液中，最后從上清液中回收質(zhì)?；厥召|(zhì)粒DNADNAu簡單快捷、成本低，提取的質(zhì)?？捎糜谙拗菩詢?nèi)簡單快捷、成本低，提取的質(zhì)粒可用于限制性內(nèi)切酶圖譜分析切酶圖譜分析（二）牙簽少量制備法（二）牙簽少量制備法u用牙簽直接挑取生長在瓊脂用牙簽直接挑取生長在瓊脂平板上的細(xì)菌菌落平板上的細(xì)菌菌落制備質(zhì)粒制備質(zhì)粒DNADNAu由于制備的質(zhì)粒由于制備的質(zhì)粒DNADNA有較多污染，不能用于分子有較多污染，不能用于分子克隆中的酶學(xué)反應(yīng)，但可用于質(zhì)粒的鑒定克隆中的酶學(xué)反應(yīng)，但可用于質(zhì)粒的鑒定五、質(zhì)粒DNA的純化.CsCl-EB.CsCl-EB法法. .聚乙二

23、醇沉淀法聚乙二醇沉淀法. .柱層析法柱層析法 在過量在過量EBEB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開。經(jīng)離心平衡后得以分開。u蛋白質(zhì)由于密度小而浮于液面蛋白質(zhì)由于密度小而浮于液面uRNARNA密度大而沉于管底密度大而沉于管底u各種各種DNADNA密度介于蛋白質(zhì)與密度介于蛋白質(zhì)與RNARNA之間，處于中部之間，處于中部 EB-CsCl密度梯度離心法 不同分子構(gòu)型的不同分子構(gòu)型的DNADNA與與EBEB的結(jié)合能力不同，密的結(jié)合能力不同，密度下降也不同，因而可將它們有效分離開。度下降也不同，因而可將它們有效分離開。 u染色體染色體DNADNA、開環(huán)質(zhì)

24、粒、開環(huán)質(zhì)粒DNADNA等可嵌入更多的等可嵌入更多的EBEB，因，因而密度下降較多而密度下降較多 u閉環(huán)質(zhì)粒閉環(huán)質(zhì)粒DNADNA為超螺旋三級結(jié)構(gòu)，為超螺旋三級結(jié)構(gòu)，EBEB不易插入而不易插入而結(jié)合量少，密度下降較少結(jié)合量少，密度下降較少 第四節(jié) 真核細(xì)胞RNA的分離純化細(xì)胞RNA的含量每個細(xì)胞的RNA量約為10-5 g 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA二、酸性異硫氰酸胍二、酸性異硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法三、商品化試劑單相裂解法三、商品化試劑單相裂解法四、四、mRNAmRNA的分離純

25、化的分離純化一、一、RNARNA制備的條件與環(huán)境制備的條件與環(huán)境一、RNA制備的條件與環(huán)境uRNARNA易被易被RNaseRNase水解，水解，RNaseRNase除細(xì)胞內(nèi)還廣泛存在除細(xì)胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中uRNaseRNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，穩(wěn)定，去除變性劑后，RNaseRNase的活性又可恢復(fù)的活性又可恢復(fù)u去除去除RNaseRNase的污染和抑制其活性是的污染和抑制其活性是RNARNA制備制備成功與否的關(guān)鍵成功與否的關(guān)鍵u在總在總RNARNA提取分

26、離的最初階段，盡可能地提取分離的最初階段，盡可能地滅活細(xì)胞內(nèi)滅活細(xì)胞內(nèi)RNaseRNase的活性的活性 u選擇性地使用選擇性地使用RNaseRNase的變性劑的變性劑（如酚、氯仿（如酚、氯仿及強烈的胍類變性劑）及強烈的胍類變性劑）u使用使用蛋白酶蛋白酶K K u使用陰離子去污劑如使用陰離子去污劑如SDSSDS、十二烷基肌氨酸十二烷基肌氨酸鈉鈉或脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸鈉u聯(lián)合使用聯(lián)合使用RNaseRNase的特異抑制劑（如的特異抑制劑（如RNasinRNasin與與DEPCDEPC等）能極大地防止內(nèi)源性等）能極大地防止內(nèi)源性RNaseRNase對對RNARNA的降解的降解u加入加入-巰基乙醇、二硫

27、蘇糖醇（巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTTDTT）等還原劑）等還原劑可以還原可以還原RNaseRNase中的二硫鍵，有利于中的二硫鍵，有利于RNaseRNase的變性、的變性、水解與滅活水解與滅活二、酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法u以含異硫氰酸胍、以含異硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌疏基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的氨酸鈉的變性溶液變性溶液裂解細(xì)胞裂解細(xì)胞u在在pH4.0pH4.0的條件下，酚的條件下，酚/ /氯仿抽提細(xì)胞氯仿抽提細(xì)胞裂解溶裂解溶液液u通過異丙醇沉淀與通過異丙醇沉淀與75%75%的乙醇洗滌而獲得總的乙醇洗滌而獲得總RNARNA 總總RNARNA產(chǎn)量取決于標(biāo)本的起始量，產(chǎn)量取決于標(biāo)本的起始量，每每mgmg組組織大約能制備織大約能制備4 47 7 g g總總RNARNA，每，每10106 6個細(xì)胞大約個細(xì)胞大約能制備能制備4 41010 g g總總RNARNA。 三、商品化試劑單相裂解法u是異硫氰酸胍是異硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法的改進方案氯仿一步法的改進方案u以以異硫氰酸胍異硫氰酸胍- -酚酚的單相裂解液裂解細(xì)胞，再的單相裂解液裂解細(xì)胞，再加入加入氯仿氯仿后形成兩相后形成兩相u變性的變性的DNADNA與蛋白質(zhì)介于兩相的交界面，