蛋白質(zhì)分離純化與鑒定—綜合性實(shí)驗(yàn)

1、蛋白質(zhì)分離純化與鑒定綜合性實(shí)驗(yàn)三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室1、從血清獲得高純度的白蛋白、從血清獲得高純度的白蛋白2、掌握蛋白質(zhì)鹽析、掌握蛋白質(zhì)鹽析、 G-25葡聚糖凝膠層析脫鹽葡聚糖凝膠層析脫鹽、DEAE-纖維素離子交換層析、纖維素離子交換層析、 SDS-PAGE電電泳的原理與實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)泳的原理與實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)3、掌握考馬斯亮藍(lán)、掌握考馬斯亮藍(lán)G250染色法定量檢測蛋白質(zhì)染色法定量檢測蛋白質(zhì)的原理和操作方法的原理和操作方法4、了解紫外檢測儀、自動(dòng)部分收集器、記錄儀、了解紫外檢測儀、自動(dòng)部分收集器、記錄儀、恒壓高位槽的原理與使用方法、恒壓高位槽的原理與使用方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

2、實(shí)驗(yàn)流程蛋白質(zhì)鹽析蛋白質(zhì)鹽析葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠-25-25（脫鹽）（脫鹽）DEAE-Cellulose離子交換（純化）離子交換（純化）蛋白質(zhì)濃度檢測蛋白質(zhì)濃度檢測SDS-PAGE電泳法電泳法 （鑒定蛋白質(zhì)純度）（鑒定蛋白質(zhì)純度）柱層析實(shí)驗(yàn)裝置UV monitorRecorderFraction CollectorColumnBufferReservoir柱層析實(shí)驗(yàn)儀器一：HD-3紫外檢測儀波長波長光量光量靈敏度靈敏度電源電源調(diào)零調(diào)零根據(jù)光吸收原理設(shè)計(jì)，光源為紫外光，可監(jiān)測具有根據(jù)光吸收原理設(shè)計(jì)，光源為紫外光，可監(jiān)測具有紫外吸收物質(zhì)紫外吸收物質(zhì)(蛋白質(zhì)、核酸、多肽、酶蛋白質(zhì)、核酸、多肽、酶)的

3、檢測儀器，的檢測儀器，與層析柱、部份收集器及記錄儀配套，組成一個(gè)完整的與層析柱、部份收集器及記錄儀配套，組成一個(gè)完整的液相色譜分離分析裝置。液相色譜分離分析裝置。p構(gòu)造和功能構(gòu)造和功能1. 1. 檢查檢查：連接是否正確，將：連接是否正確，將“波長波長”旋鈕旋到所需波長刻度；旋鈕旋到所需波長刻度；2. 2. 預(yù)熱預(yù)熱：按下：按下 “ “電源電源”開關(guān)，電源指示燈亮；開關(guān)，電源指示燈亮；3. 3. 調(diào)調(diào)100%100%：把：把“靈敏度靈敏度”旋鈕選擇到旋鈕選擇到“100100”檔，調(diào)節(jié)檔，調(diào)節(jié)“光量光量”旋鈕，數(shù)字顯示為旋鈕，數(shù)字顯示為100100，即透光率為，即透光率為100100；4. 4.

4、調(diào)零調(diào)零：把：把“靈敏度靈敏度” ” 旋到所需檔（使用者自行掌握），緩慢調(diào)旋到所需檔（使用者自行掌握），緩慢調(diào)節(jié)節(jié)“調(diào)零調(diào)零”旋鈕，數(shù)字顯示為旋鈕，數(shù)字顯示為“0”0”。備注備注：以上步驟需反復(fù)調(diào)節(jié)幾次。在樣品檢測過程中，不可再調(diào)：以上步驟需反復(fù)調(diào)節(jié)幾次。在樣品檢測過程中，不可再調(diào)節(jié)節(jié)“調(diào)零調(diào)零”、“光量光量”旋鈕旋鈕。如繪出的圖譜即出峰過小，可改變?nèi)缋L出的圖譜即出峰過小，可改變“靈敏度靈敏度”選擇檔，每檔成兩倍放大關(guān)系。選擇檔，每檔成兩倍放大關(guān)系。p使用方法使用方法柱層析實(shí)驗(yàn)儀器二：BSZ-100自動(dòng)部份收集器p構(gòu)造和功能構(gòu)造和功能選擇選擇置數(shù)置數(shù)手手/自動(dòng)自動(dòng)切換切換復(fù)位復(fù)位按照設(shè)定的時(shí)間

5、自動(dòng)收集樣品按照設(shè)定的時(shí)間自動(dòng)收集樣品p使用方法使用方法1. 1. 準(zhǔn)備準(zhǔn)備：檢查檢查“漏液報(bào)警板漏液報(bào)警板”、試管插在收集架上試管插在收集架上；2 2. . 定位定位：按按“復(fù)位復(fù)位”鍵鍵，“報(bào)警報(bào)警”后，再按后，再按“復(fù)位復(fù)位”鍵，儀器自鍵，儀器自動(dòng)復(fù)位動(dòng)復(fù)位；把安全閥上橫桿一頭的硅膠管對準(zhǔn)第一根試管位置，固把安全閥上橫桿一頭的硅膠管對準(zhǔn)第一根試管位置，固定好螺釘定好螺釘；3 3. . 定時(shí)定時(shí)：按按 “手動(dòng)手動(dòng)/ /自動(dòng)自動(dòng)”鍵，儀器鍵，儀器為為 手動(dòng)手動(dòng) 狀態(tài)狀態(tài)，按按“選擇選擇”鍵鍵選定位置，選定位置，按按“置數(shù)置數(shù)”鍵設(shè)置時(shí)間，再按鍵設(shè)置時(shí)間，再按“選擇選擇”鍵鍵確定；確定；4 4

6、. . 自動(dòng)收集自動(dòng)收集：按按“切換切換”鍵，鍵，“收集收集”指示燈亮，儀器指示燈亮，儀器為為 收集收集 狀狀態(tài)態(tài)；按按“手動(dòng)手動(dòng)/ /自動(dòng)自動(dòng)”鍵，儀器鍵，儀器為為 自動(dòng)收集自動(dòng)收集 狀態(tài)狀態(tài)；5 5. . 停止收集停止收集：或：或按按“手手/ /自動(dòng)自動(dòng)”鍵，儀器鍵，儀器為為 手動(dòng)手動(dòng) 狀態(tài)狀態(tài)或或關(guān)電源。關(guān)電源。柱層析實(shí)驗(yàn)儀器三：LM17型記錄儀p構(gòu)造和功能構(gòu)造和功能抬抬/落筆手柄落筆手柄量程顯示量程顯示調(diào)紙速調(diào)紙速紙速啟停紙速啟停紙速顯示紙速顯示電源電源量程量程/零位切換鍵零位切換鍵當(dāng)樣品流過檢測儀時(shí)，記錄儀即可繪出洗脫圖譜當(dāng)樣品流過檢測儀時(shí)，記錄儀即可繪出洗脫圖譜p使用方法使用方法1

7、. 1. 打開打開：按：按“電源電源” ；2. 2. 調(diào)零調(diào)零：按：按“量程量程/ /零位零位” ” 鍵，零位指示燈亮，數(shù)碼管顯示鍵，零位指示燈亮，數(shù)碼管顯示“Po”“Po”，按，按 左移左移 或或 右移右移 鍵，使記錄筆移至鍵，使記錄筆移至所需所需零位零位；3. 3. 選擇量程選擇量程：按：按“量程量程/ /零位零位” ” 鍵，量程指示燈亮，數(shù)碼管顯示當(dāng)鍵，量程指示燈亮，數(shù)碼管顯示當(dāng)前量程范圍前量程范圍，按按 增加增加 或或 減少減少 鍵，鍵，使使量程為量程為10mV10mV；4. 4. 調(diào)調(diào)紙速紙速：按：按“啟啟/ /停?！辨I鍵，“紙速顯示紙速顯示” 閃爍，按閃爍，按“調(diào)速調(diào)速”鍵調(diào)鍵調(diào)節(jié)

8、紙速節(jié)紙速，確定后按確定后按“啟啟/ /停?！辨I鍵；5. 5. 記錄記錄：取下記錄筆的塑料筆套，壓下取下記錄筆的塑料筆套，壓下“抬抬/ /落筆手柄落筆手柄”；實(shí)驗(yàn)原理一：鹽析鹽析鹽析salting out高濃度的中性鹽可以中和蛋白質(zhì)表面電荷、奪取高濃度的中性鹽可以中和蛋白質(zhì)表面電荷、奪取蛋白質(zhì)周圍的水化膜，破壞蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定蛋白質(zhì)周圍的水化膜，破壞蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性，從而將蛋白質(zhì)從溶液中析出。性，從而將蛋白質(zhì)從溶液中析出。常用中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等常用中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等+水化膜水化膜實(shí)驗(yàn)操作一：鹽析0.5ml Serum0.5ml s(NH4)2SO4Mi

9、x5000rpm/10min SupernatantPrecipitate上清轉(zhuǎn)至另一上清轉(zhuǎn)至另一Ep管備用；管備用；沉淀沉淀0.5ml dH2O，離心，留上清液備用。，離心，留上清液備用。(白蛋白蛋白和球蛋白分別留白和球蛋白分別留200ul用于電泳上樣用于電泳上樣)實(shí)驗(yàn)原理二：凝膠層析Sephadex structure (Left: molecule; Right: model)凝膠過濾凝膠過濾gel filtrationTable. Physical Characteristics of Polydextran GelsDesignationSephadex G10Sephadex G2

10、5Sephadex G50Fractionation Range(MW)7001,000-5,0001,500-30,000DesignationSephadex G100Sephadex G150Sephadex G200Fractionation Range(MW)4,000-150,0005,000-400,0005,000-800,000 實(shí)驗(yàn)操作二： G-25葡聚糖凝膠層析脫鹽葡聚糖凝膠層析脫鹽1. 平衡平衡:0.02mol/LNH4Ac緩沖液平衡緩沖液平衡G-25柱，紫外檢測柱，紫外檢測儀、記錄儀基線穩(wěn)定儀、記錄儀基線穩(wěn)定;2. 上樣上樣:取下柱上端套塞，當(dāng)柱上液面與凝膠床面相切，

11、取下柱上端套塞，當(dāng)柱上液面與凝膠床面相切，立即將樣品小心而緩慢地加到柱床表面立即將樣品小心而緩慢地加到柱床表面;3.洗滌洗滌:樣品降至床面，用樣品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗滌柱壁洗滌柱壁1次次;4. 收集收集:將將0.02mol/LNH4Ac緩沖液充滿層析柱，與高位緩沖液充滿層析柱，與高位恒壓槽連通，同時(shí)開啟自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集；恒壓槽連通，同時(shí)開啟自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集；5. 再次平衡再次平衡:繼續(xù)用繼續(xù)用0.02mol/LNH4Ac流洗直到記錄儀基流洗直到記錄儀基線恢復(fù)到零。線恢復(fù)到零。 實(shí)驗(yàn)原理三：DEAE-Cellulose離子交換層析離子交換層析離子交換層析ion

12、exchange chromatography低鹽洗脫液低鹽洗脫液高鹽洗脫液高鹽洗脫液混合蛋白質(zhì)混合蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作三：純化1. 平衡平衡:0.02mol/LNH4Ac緩沖液平衡離子交換柱，紫外緩沖液平衡離子交換柱，紫外檢測儀、記錄儀基線穩(wěn)定檢測儀、記錄儀基線穩(wěn)定;2. 上樣上樣:取下柱上端套塞，當(dāng)柱上液面與凝膠床面相切，取下柱上端套塞，當(dāng)柱上液面與凝膠床面相切，立即將樣品小心而緩慢地加到柱床表面立即將樣品小心而緩慢地加到柱床表面;3.洗滌洗滌:樣品降至床面，用樣品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗滌柱壁洗滌柱壁1次次;4. 收集收集-球蛋白球蛋白:將將0.02mol/LNH4Ac緩沖液

13、充滿層析柱，緩沖液充滿層析柱，與高位恒壓槽連通，開啟自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集；與高位恒壓槽連通，開啟自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集；5. 洗滌其他球蛋白洗滌其他球蛋白:記錄儀基線恢復(fù)到零后記錄儀基線恢復(fù)到零后,用用0.06mol/L NH4Ac流洗，不用進(jìn)行收集流洗，不用進(jìn)行收集實(shí)驗(yàn)操作三：純化6.收集白蛋白收集白蛋白:待記錄儀基線恢復(fù)到零后，用待記錄儀基線恢復(fù)到零后，用0.3mol/L NH4Ac緩沖液流洗，自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集緩沖液流洗，自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集;7. 柱上再生柱上再生:待待記錄儀基線恢復(fù)到零后記錄儀基線恢復(fù)到零后,用用1.5mol/LNaCl- 0.3mol/LNH4Ac流洗，不用

14、進(jìn)行收集流洗，不用進(jìn)行收集;8. 再次平衡再次平衡:待記錄儀基線恢復(fù)到零后，用待記錄儀基線恢復(fù)到零后，用0.02mol/L NH4Ac流洗流洗1-2個(gè)柱體積個(gè)柱體積實(shí)驗(yàn)原理四：蛋白質(zhì)定量 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250 Coomassie brillient blue在一定濃在一定濃度乙醇和酸性溶液中呈現(xiàn)紅色。此條件下，考馬斯亮度乙醇和酸性溶液中呈現(xiàn)紅色。此條件下，考馬斯亮藍(lán)藍(lán)G250可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色，最可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色，最大吸收峰從大吸收峰從465nm移至移至595nm?？捡R斯亮藍(lán)?？捡R斯亮藍(lán)G250與蛋白與蛋白質(zhì)的復(fù)合物在質(zhì)的復(fù)合物在595nm波長處具

15、有很高的光吸收系數(shù)，波長處具有很高的光吸收系數(shù)，并與溶液中的蛋白質(zhì)濃度呈正比。利用這一性質(zhì)可以并與溶液中的蛋白質(zhì)濃度呈正比。利用這一性質(zhì)可以定量測定蛋白質(zhì)的濃度。定量測定蛋白質(zhì)的濃度。考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250染色法：染色法：優(yōu)點(diǎn)：與凱氏法及優(yōu)點(diǎn)：與凱氏法及Lowry法相比操作簡便，能同時(shí)法相比操作簡便，能同時(shí)測定多個(gè)樣品；敏感度高于測定多個(gè)樣品；敏感度高于Lowry法；復(fù)合物顏色法；復(fù)合物顏色穩(wěn)定；對干擾劑無穩(wěn)定；對干擾劑無Lowry法及紫外吸收法那樣敏感。法及紫外吸收法那樣敏感。缺點(diǎn)：有時(shí)會(huì)有非特異性吸附，同等量的不同種類缺點(diǎn)：有時(shí)會(huì)有非特異性吸附，同等量的不同種類蛋白質(zhì)測定值之間可能會(huì)

16、有較大的偏差；要求樣品完蛋白質(zhì)測定值之間可能會(huì)有較大的偏差；要求樣品完全溶解；樣品不能回收使用；高濃度的全溶解；樣品不能回收使用；高濃度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨和去垢劑等對測定、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨和去垢劑等對測定有干擾作用。有干擾作用。 實(shí)驗(yàn)操作四：蛋白質(zhì)定量充分混勻后以充分混勻后以1管調(diào)零，在管調(diào)零，在595nm處測定各管吸處測定各管吸光度。然后以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度光度。然后以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度An作縱作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出檢測管吸坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出檢測管吸光度對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度。光度對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度。

17、1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)白蛋白白蛋白（l）蒸餾水（蒸餾水（l ）考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250（ml）1234567測定測定33333330.030.0樣品樣品546 4848 12 24 36 12 24 36 06036003實(shí)驗(yàn)原理五：SDS-PAGE電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresisSDSSDS帶負(fù)電荷，破壞蛋白質(zhì)的氫帶負(fù)電荷，破壞蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵，使之形成單個(gè)亞基。鍵、疏水鍵，使之形成單個(gè)亞基。SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物為雪茄形的蛋白質(zhì)復(fù)合物為雪茄形的長橢圓棒長橢圓棒，消除或掩

18、蓋了不同種消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。SDSSDS - -蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中的中的遷移遷移率只是蛋白質(zhì)分子量的率只是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)有關(guān)函數(shù)有關(guān)。 上上電極緩沖液電極緩沖液下下電極緩沖液電極緩沖液樣品槽樣品槽上樣器上樣器陰極陰極陽極陽極電泳電泳方向方向聚丙烯酰胺凝膠板聚丙烯酰胺凝膠板實(shí)驗(yàn)原理五：SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)操作五：SDS-PAGE電泳1. 制膠：制膠： 試劑試劑 分離膠（分離膠（ml） 濃縮膠（濃縮膠（ml） 1.5M Tris-HCl （pH 8.9） 2.50 30%單體單體 3.50 1.00 10%SDS 0.10 0.10 蒸餾水蒸餾水 3.84 6.340.5M Tris-HCl （pH 6.8） 2.5010%過硫酸銨過硫酸銨AP 0.05 0.05四甲基乙二胺四甲基乙二胺TEMED 0.01 0.012. 樣品處理：樣品處理：Loading buffer40%甘油甘油溴酚蘭溴酚蘭SDS-巰基乙醇巰基乙醇0.5M Tris-HCl（pH 6.8）50ul樣品樣品50ul(2)Loading buffer M