Ncoa3對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞多能性調(diào)控的分析

1、.摘要摘要胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES細(xì)胞)是早期胚胎分離出來(lái)的一類(lèi) 細(xì)胞，它具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性。ES細(xì)胞能分化 為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類(lèi)型，因此具有巨大的基礎(chǔ)研究及潛在的臨床應(yīng)用前景。 有研究表明，RasMAPK信號(hào)通路可引起從胚胎干細(xì)胞到滋養(yǎng)層干細(xì)胞的分 化，該調(diào)控是通過(guò)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)起作用的。因此，我們運(yùn)用磷酸化蛋白組學(xué) 的方法檢測(cè)誘導(dǎo)Ras過(guò)表達(dá)后蛋白質(zhì)的磷酸化動(dòng)態(tài)變化，試圖發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò) 程中起關(guān)鍵作用的分子。最終，我們發(fā)現(xiàn)，Ncoa3對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的自我更 新及其多潛能性有一定的作用。Ncoa3在ES細(xì)胞中表達(dá)量較高，隨著

2、ES細(xì)胞 的分化其表達(dá)量逐漸降低。通過(guò)shRNA干擾Ncoa3的表達(dá)可以使多能性相關(guān)基因Nanog、Oct4，Sox2的表達(dá)量降低，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明Ncoa3可調(diào) 節(jié)Nanog的啟動(dòng)子的活性。染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，Ncoa3可直接 作用于Nanog的啟動(dòng)子，影響Nanog啟動(dòng)子活性，影響其表達(dá)，從而影響胚胎 干細(xì)胞的多能性?？梢?jiàn)，Ncoa3對(duì)多能性有一定的作用。具體作用機(jī)制，有待于 進(jìn)一步研究。關(guān)鍵詞：胚胎干細(xì)胞Ncoa3 自我更新Nanog.;AbstractAbstractEmbryonic stem cells(ES cells)are pluripotent stem

3、 cells derived from earlystage embryosES cells ale able to self-renew indefinitely and to differentiate ES cells call differentiate into almost all types of cellsSo ES cell has great potential in basic research and bright application prospect in cell replacement therapy Previous studies have proved

4、that Ras-MAPK signaling pathway induces thedifferentiation from ES cells to trophectoderm stem cellIt is well known thatRasMAPK pathway functions through protein phosphorylation cascade So we tried to identify down-stream factors in Ras·MAPK signal transduction by phosphoproteomic studiesHere，w

5、e identified Ncoa3 as a novel factor crucial for the maintenance of pluripotency in ES cellsThe expression level of Ncoa3 was lli曲in ES cellsDuring differentiation，Ncoa3 expression Was reduced Knockdown of Ncoa3 expression resulted in downregulation of pluripomency marker Nanog、 Oct4 and Sox2，and in

6、duced ES eell differentiation Furthermore， luciferase assay and chromatin imunoprecipitation proved that Neoa3 acts on the Nanog promoter，and affect the expression level，SO as to regulate the pluripotency of ES cellsFurther investigation are required for better understanding of the mechanism ofNeoa3

7、 in pluripotency maintenanceKey words：Embryonic stem cell；Ncoa3；Self-renewal；NanogIl第一章引言第一章引言1研究背景胚胎干細(xì)胞(embryonic stem ceils，ES細(xì)胞)是由胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖 細(xì)胞經(jīng)體外抑制培養(yǎng)而篩選出的細(xì)胞，具有發(fā)育全能性，理論上可以誘導(dǎo)分化 為機(jī)體中200多種細(xì)胞。自1981年Evans和Kaufman首次成功分離小鼠ES細(xì) 胞，國(guó)內(nèi)外研究人員已在倉(cāng)鼠、大鼠、兔、豬、牛、綿羊、山羊、水貂、恒河 猴、美洲長(zhǎng)尾猴以及人類(lèi)都分離獲得了ES細(xì)胞。并且已經(jīng)證明小鼠ES細(xì)胞可 以分化為心肌

8、細(xì)胞、造血細(xì)胞、卵黃囊細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì) 胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、 少突膠質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、胰島細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞等。由于ES細(xì)胞的這種發(fā)育 的全能性，所以在臨床中有具有很大應(yīng)用前景。小鼠胚胎發(fā)育中，從單細(xì)胞受精卵到囊胚的形成，單細(xì)胞受精卵由發(fā)育全 能性(totipotency)轉(zhuǎn)化成為發(fā)育多潛能性(pluripotency)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass， ICM)，并分化出具有專(zhuān)向多潛能性(multipotency)的滋養(yǎng)層(trophectodermTE)。這是小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的第一個(gè)細(xì)胞分化事件。在適當(dāng)?shù)捏w外細(xì)胞

9、培養(yǎng)條件下，可由內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞分別建立兩種干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞和滋養(yǎng)層干 細(xì)胞(trophectoderm stem ceils，TS細(xì)胞)【13】。從囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到的胚胎 干細(xì)胞在體外具有無(wú)限或較長(zhǎng)期的自我更新能力，并能在特定的誘導(dǎo)條件下分化 為各種組織特異性細(xì)胞。對(duì)ES細(xì)胞多潛能性和自我更新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系進(jìn)行研 究是了解人類(lèi)早期發(fā)育和將ES細(xì)胞成功應(yīng)用于臨床治療的基礎(chǔ)。我們的研究重點(diǎn)是調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞多能性的機(jī)制，了解這一作用機(jī)制將對(duì) 我們控制細(xì)胞命運(yùn)，以及將ES細(xì)胞成功應(yīng)用于組織修復(fù)和腫瘤治療等臨床領(lǐng)域 會(huì)產(chǎn)生積極作用。本文主要著手于調(diào)節(jié)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層分化的RasMAPK信

10、號(hào)通路，致力于尋找ICM廠(chǎng)rE分化中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子或者信號(hào)調(diào)節(jié)分子。2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀囊胚發(fā)育過(guò)程中的ICMTE命運(yùn)選擇是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，主要有轉(zhuǎn)錄因子的 調(diào)控、表觀(guān)遺傳調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控?；虮磉_(dá)圖譜的變化是細(xì)胞命運(yùn)決定 的基礎(chǔ)，因此，轉(zhuǎn)錄因子至關(guān)重要：Oct4、Sox2和Nanog協(xié)同作用，形成一個(gè)調(diào)控第一章引言回路以促進(jìn)ICM形成；而Tead4和Cdx2則促進(jìn)TE發(fā)育4】。表觀(guān)遺傳修飾和 microRNA也參與調(diào)控在不同類(lèi)型細(xì)胞內(nèi)建立各自的表達(dá)圖譜。表觀(guān)遺傳修飾還 嚴(yán)格調(diào)控了卵裂球的發(fā)育潛能。信號(hào)傳導(dǎo)通路則將環(huán)境信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò) 調(diào)節(jié)基因表達(dá)最終影響細(xì)胞命運(yùn)。目前有關(guān)胚胎早期發(fā)

11、育的分子機(jī)理的研究多集中在幾個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子 上，其中Oct4、Sox2和Nanog對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性和自我更新的能 力起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用，可認(rèn)為它們是保持ES細(xì)胞多潛能性和自我更新的中 心物質(zhì)。近年來(lái)，對(duì)于這些轉(zhuǎn)錄因子的功能、調(diào)控機(jī)制以及與其他因子的相互 作用等方面的研究已取得了一些重大進(jìn)展。在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，Oct4和Nanog決定著細(xì)胞的分化命運(yùn)。Oct4是第一 個(gè)被確定為多能性主要調(diào)節(jié)者的基因，它是小鼠八聚體基序結(jié)合蛋白家族的一 個(gè)成員，主要表達(dá)于胚胎干細(xì)胞及生殖干細(xì)胞中，對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的多潛 能性和自我更新具有極其重要的作用。Oct4基因的活化，受到多種細(xì)胞因子的

12、調(diào) 節(jié)。Sall4可以結(jié)合在Oct4的高度保守調(diào)節(jié)區(qū)域以增強(qiáng)和激活Oct4基因的表達(dá)5， 6。：氧水平可能是干細(xì)胞微環(huán)境的重要組成部分，它調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和 多能性，而缺氧因子HIF一2正是通過(guò)結(jié)合Oct4啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能的7】；Tr2孤 兒受體SUMO化修飾后可以精細(xì)調(diào)節(jié)干細(xì)胞中Oct4基因的表達(dá)，將其維持在一定 的水平，促進(jìn)干細(xì)胞的增殖8】。除活化基因以外，最近發(fā)現(xiàn)PIAS家族PIASy、 PIASl和PIAS3蛋白可以阻止Oct4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子激活【9】jNanog是Oct4的一個(gè)激活因子，并由此參與胚胎干細(xì)胞Oct4的表達(dá)。白血 病抑制因子(1eukemia inhibitory

13、 factor,LIF)可以激活STAT3信號(hào)通路使STAT3 結(jié)合到Nanog的增強(qiáng)子上來(lái)激活Nanog的表達(dá)1012】。FoxD3能結(jié)合于Nanog 的啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)激活Nanog的表達(dá)13】。此外，也有一些因子能夠抑制Nanog 的表達(dá)。Tcf3可以結(jié)合到Nanog啟動(dòng)子的調(diào)控區(qū)抑制啟動(dòng)子活性使Nanog表達(dá) 下調(diào)；當(dāng)Tcf3缺失時(shí)能提高Nanog的表達(dá)水平延遲ES細(xì)胞的分化14】。Ser315 磷酸化的p53結(jié)合在Nanog啟動(dòng)子上并抑制啟動(dòng)子活性；視黃酸誘導(dǎo)胚胎干細(xì) 胞分化后，p53通過(guò)與mSin3a的特異結(jié)合來(lái)下調(diào)Nanog基因的表達(dá)【15】。Oct4、Sox2和Nanog有一些重要

14、的共同目的基因，這些核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 共同協(xié)作形成自調(diào)節(jié)和反饋循環(huán)組成的調(diào)控環(huán)路，以此推動(dòng)多能性和自我更新， 形成一個(gè)緊密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在保持ES細(xì)胞的基本特性和生物的早期發(fā)育中。Oct4和Nanog被認(rèn)為是兩個(gè)基本調(diào)節(jié)器，而Sox2則通過(guò)和Oct4組成異二聚2第一章引言體發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用。三者的表達(dá)水平和功能狀態(tài)，將直接對(duì)ES細(xì)胞的多潛能 性和自我更新乃至生物的早期發(fā)育產(chǎn)生影響。此外，Oct4可以激活另外一個(gè)多 潛能性轉(zhuǎn)錄因子Zfp20616】，但Zfp206也可以激活Oct4和Nanog基因的轉(zhuǎn)錄 17】。Zfpl43是另外一個(gè)可以協(xié)同Oct4激活Nanog表達(dá)的多潛能性調(diào)節(jié)基因 18】。然

15、而這些研究結(jié)果在編織基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)時(shí)還不夠全面，需要聯(lián)合更多的上游和下游基因或其他基因的研究來(lái)更清楚地了解整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在胚胎早期發(fā)育的過(guò)程中，必然還存在其它因子對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控或者信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起到關(guān)鍵作 用，這些因子的上游激活途徑和下游靶基因以及詳細(xì)的作用機(jī)制都有待于進(jìn)一 步研究。有研究表明，Ras信號(hào)通路在著床前胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用，RasRaf信號(hào) 只在2細(xì)胞胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用19。Ras下游的MAPK通路還影響胚胎發(fā)育的其它階段。MAPK通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(EI)通路、Jun氨基末端激酶(JNK)通路和p38通路。早期研究表明，抑制JNK或者p38通路 會(huì)造成囊胚發(fā)育缺陷，抑

16、制ERK通路不影響囊胚的形成。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)ERK通路對(duì)著床前胚胎發(fā)育是必需的20，21】。而且，ERK通路的抑制劑可以使ES 細(xì)胞維持在自我更新和多能性的狀態(tài)22，23，表明ErkMAPK通路對(duì)于ES細(xì)胞 的分化是必不可少的。最新研究表明，RasMAPK信號(hào)通路可以誘導(dǎo)ES細(xì)胞分 化成TS細(xì)胞，抑制8細(xì)胞胚胎中的ERK通路會(huì)減少Cdx2的表達(dá)，延遲囊胚發(fā)育，并會(huì)影響胚胎在體外培養(yǎng)時(shí)TE細(xì)胞生長(zhǎng)24】。這些結(jié)果表明，ERK2可能 在細(xì)胞極化、激活Cdx2表達(dá)和由此引起的TE細(xì)胞命運(yùn)決定中起重要作用。因 此，我們提出以下假說(shuō)：Erk2介導(dǎo)了下游的一個(gè)未知信號(hào)，該信號(hào)能夠維持ES 細(xì)胞狀態(tài)或者使

17、ES細(xì)胞轉(zhuǎn)變成TS細(xì)胞。3研究方法和目的RasMAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路可引起從胚胎干細(xì)胞到滋養(yǎng)層的分化。我們已建立 了一個(gè)由胚胎干細(xì)胞分化到滋養(yǎng)層細(xì)胞的體外分化體系24】。在該體外分化體系 中，誘導(dǎo)表達(dá)激活的H-Ras基因可導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞分化到滋養(yǎng)層細(xì)胞。從細(xì)胞 外的信號(hào)傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，是通過(guò)對(duì)一些蛋白的翻譯后的修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)的。我們 證明了HRas信號(hào)是通過(guò)磷酸化ERK2(MAPKI)介導(dǎo)的，但磷酸化的ERK2 如何進(jìn)一步傳遞信號(hào)來(lái)進(jìn)入細(xì)胞核以改變基因的轉(zhuǎn)錄還有待研究。我們假設(shè)蛋 白質(zhì)的磷酸化在從Ras到Erk2，再到Cdx2，Nanog和Oct4的調(diào)控過(guò)程中起主要3第一章引言作用。因此，我們將應(yīng)用

18、磷酸化蛋白組學(xué)(phosphoproteomics)的方法監(jiān)測(cè)誘導(dǎo)Ras 表達(dá)后蛋白質(zhì)的磷酸化動(dòng)態(tài)變化。此外，我們還將通過(guò)抗磷酸化酪氨酸的免疫 共沉淀技術(shù)及蛋白質(zhì)組學(xué)等比較分化各時(shí)間點(diǎn)明顯變化的信號(hào)蛋白，通過(guò)這兩 種方法來(lái)找出連接信號(hào)傳導(dǎo)和染色質(zhì)重塑及組蛋白修飾的關(guān)鍵分子。通過(guò)篩選與鑒定，我們選出了Ncoa3這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，并通過(guò)不同的方法證 明了其在多能性中的作用。1RNA干擾試驗(yàn) 對(duì)于這個(gè)因子的研究，我們首先進(jìn)行了RNA干擾(RNA interference，1wAi)實(shí)驗(yàn)，這是一種與靶基因同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默 現(xiàn)象。其作用機(jī)制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生干擾小R

19、NA，這些 siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，特異性酶降解靶RNA，從而抑制、下調(diào)基 因表達(dá)。已經(jīng)發(fā)展成為基因治療、基因結(jié)構(gòu)功能研究的快速而有效的方法。弋歹多 dsRNAl Dic盱RISCo固裟甜甜l。Association with三Q=一l“、一TargetmRNA圖11 RNA干擾原理 反義RNA片段激活了RISC活性，并與目標(biāo)信使RNA結(jié)合，dsRNA觸發(fā)了高效的基因沉默機(jī)制并極大降低了靶mRNA水平，達(dá)到干擾目的將Ncoa3干擾后，我們從mRNA及蛋白水平檢測(cè)Ncoa3表達(dá)降低后對(duì)多能 性因子的影響，并檢測(cè)了不同胚層的分化標(biāo)志物的表達(dá)。以研究Ncoa3在胚胎 干細(xì)胞中的功能。4第

20、一章引言2雙熒光素酶(DualLuciferase)報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng) 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控常被用來(lái)研究培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)中含有在同一細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)的兩種熒光素酶。通 常，報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中往往會(huì)受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，共轉(zhuǎn)染的“對(duì)照?qǐng)?bào)告 基因會(huì)作為內(nèi)對(duì)照，對(duì)實(shí)驗(yàn)提供以基準(zhǔn)線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因經(jīng)過(guò)內(nèi)參照的處理可 以減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，因此雙報(bào)告系統(tǒng)減少了外部干擾， 使得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更可信。實(shí)驗(yàn)中報(bào)告基因和對(duì)照基因的酶沒(méi)有種源同源性，螢火 蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶對(duì)應(yīng)不同的反應(yīng)底物，反應(yīng)中沒(méi)有任何的交叉干擾。我們構(gòu)建想通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)來(lái)研究胚胎干細(xì)

21、胞中Ncoa3對(duì)Nanog的影響。3染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)是研 究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固 定蛋白質(zhì)一DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片 段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA 片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的 信息。ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研 究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且，ChIP與其他方法的結(jié) 合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍

22、：ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIPonchip和ChIPSeq方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選 我們通過(guò)ChIPSeq實(shí)驗(yàn)，來(lái)研究與Ncoa3作用的因子，從而進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能。4Ncoa3基因概述Ncoa3，即nuclear receptor coactivator 3，在人類(lèi)中由Ncoa3基因編碼25， 26】。也叫彳佃，(amplified in breast 1)，艘C3(steroid receptor eoactivator-3)， TRAMl(thyroid hormone receptor activator molecule 1)。Ncoa3是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激

23、活蛋白，包括幾個(gè)核受體相互作用區(qū)域，有組蛋白 乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，可以乙酰化組蛋白，以使下游DNA更容易轉(zhuǎn)錄，所以， Ncoa3輔助核受體促進(jìn)基因表達(dá)25，26】。5第一章引言已有研究表明，Ncoa3能與DDXl7127、IKK2128】、雄激素受體2931、 CREB結(jié)合蛋白32、糖皮質(zhì)激素受體33，34、IKBKG28】、雌激素受體35， 36】，以及RXR37，38相互作用。Ncoa3在小鼠胚胎干細(xì)胞中研究較少，我們將從ES細(xì)胞的多能性著手，研究Ncoa3在多能性中的作用。6第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定第一節(jié)導(dǎo)言RasMAPK信號(hào)通

24、路可引起ES細(xì)胞向滋養(yǎng)層干細(xì)胞(trophectoderm stem C ell，TS細(xì)胞)的轉(zhuǎn)變，而該調(diào)控主要通過(guò)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)起作用的24】。目前， 我們已有可以過(guò)表達(dá)Ras的小鼠ES細(xì)胞系，即iRasES細(xì)胞。該細(xì)胞系有外源的HRas基因，在強(qiáng)力霉素(doxycycline，dox)誘導(dǎo)下Ras表達(dá)量明顯升高。 Erk2是RasMAPK信號(hào)通路的下游分子，需要被上游激酶磷酸化激活而發(fā)揮作 用。普遍認(rèn)為，這條通路主要是通過(guò)Ras下游的西船起作用，從而引起ES細(xì) 胞向TS細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。有研究表明，L73P和S151D的突變體Erk2具有自磷酸化活性，不需要上游分子的磷酸化激活39】。KH2細(xì)胞

25、系、質(zhì)粒pBS31RBGpA和 pCAGGSflpEpuro可組成過(guò)表達(dá)系統(tǒng)40】。將Erk2突變體克隆至pBS31RBGpA 質(zhì)粒的特定位點(diǎn)，將其和能夠表達(dá)Flp重組酶的質(zhì)粒pCAGGSripEpuro通過(guò)電 轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)入KH2細(xì)胞，用潮霉素(Hygromycin)篩選即可得到可以過(guò)量表達(dá) Erk2突變體的穩(wěn)定株系。得到突變體細(xì)胞系后，我們可以進(jìn)一步驗(yàn)證，在Erk2 激活而Ras未激活的狀態(tài)下，是否可以引起ES細(xì)胞向TS細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。從而驗(yàn) 證Erk2在RasMAPK通路中的功能。第二節(jié)材料和方法221材料與試劑Trans HiFi DNA聚合酶(TransGen,APl31)dNTP Mix

26、ture(【ara，D4030RA)Trans2K Plus DNA Marker(TransGenBM1 2 l 6xDNA Loading Buffer(Takara，A1 88)Argrose瓊脂糖(BIOWEST，08 1 527)T4 DNA連接酶(Takara,D2011) 潮霉素(Sigma，H3274) Gelatin(Sigma，G1 890)絲裂霉素C(浙江海正，醫(yī)用)7第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定DMSO(Sigma，D2650)PhosphoErkl2 antibody(cell signaling,91 01)pEASY-T3 Cloning veto

27、r(TransGen，CT301-01)TransScript II First·-Strand eDNA Synthesis SuperMix(TransGen,AH301··02)Rneasy Mini Kit(Qiagen,74 1 06)PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase(Stratagene，600670)Trypsin-EDTA(O05，Invitrogen，25300-054；025，Invitrogen，25300072) 1 xPBS(pH72)：89 NaCl，29 KCl，89 Na2HP04，0249

28、K2HP04，加水定 容至lL，高壓滅菌，室溫保存BeyoECL Plus ReagentAB(碧云天，P001 8) complete，Mini，EASYpack(Roche，04693 l 1 6001) Western一抗二抗去除液(碧云天，P0025)Ethylenediaminetetraactic acid(EDTA)(Sigma,03609-250G)DMEM(Invitrogen,1 28000 1 7) FBS(Hyclone，SH3007003E) L谷氨酰胺(Invitrogen，25030081)NEAA(Sigma，M-7145)p一巰基乙醇(Sigma,M一7522

29、)抗生素一抗真菌素(Invitrogen,15240062) LIF(Chemicon，ESG1107) 胚胎干細(xì)胞凍存液：90FBS，10DMSOEasypureTM Quick Gel Extraction Kit(TransGen，EMl0101) EasypureTM Plasmid MiniPrep Kit(TransGen，EGl 0101) HiSpeed Plasmid Maxi Kit(25)(Qiagen，1 2663)Trans5a chemically competent cell(Transgen，CD201-03)DpnI(NEB，RO 1 76S)dNTP Mix

30、ture(Takara，D4030RA)Ethidium Bromide Solution(EB)(Promega，H5041) Yeast extract(Oxoid，LP002 1) Nacl(Sigma，S5886)Agar(Scientific Reasearch)8第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定Ampicilin(上海生工，AB0339) 222儀器電子天平(Sartorius，AB 1 04S) 高壓滅菌鍋(HIRAYAMA，HVE一50) 恒溫水浴鍋(SUMSUNG,DK-450B)渦旋振蕩器(VoaexQL901) 純水機(jī)(Millipore) 離心機(jī)(Eppen

31、drof,581 OR) PCR儀(Eppendorf,Mastercycler gradient) 電泳儀(北京六一，DYY-6C) 凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad) 超凈工作臺(tái)(ESCO，SVE4A1) 冰箱(Siemens，BCD254) C02細(xì)胞培養(yǎng)箱(thermo，31 11)電泳儀BIOWESTAGAROSE(BIOWEST，081527)223實(shí)驗(yàn)方法2231小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的分離和培養(yǎng)MEF培養(yǎng)液ES培養(yǎng)液組分含置()組分含置() 高糖Dh艇M卯高糖DMEM85FBS10FBS15L谷氨酰胺1L-谷氨醌胺1抗生素1抗生紊1NEA1廖巰基乙醇1UF001(1)、取懷孕

32、135天的小鼠，無(wú)菌條件下取出胚胎，用37預(yù)熱的PBS沖 洗數(shù)次。(2)、去除胚胎的四肢、內(nèi)臟(紅色的組織)、頭和尾巴，用PBS洗3次。9第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定(3)、將胚胎放入35mm培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌剪刀將胚胎剪碎，剪得越碎越 容易消化成單細(xì)胞。(4)、將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，加入10ml預(yù)熱的005的胰酶EDTA，用移液管將組織吹散，37水浴消化5min。 (5)、取出上清，轉(zhuǎn)移到放有3mlFBS的新離心管中終止消化，離心1000rpm，8rain，預(yù)熱的MEF培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按細(xì)胞量接種到150mm培養(yǎng)皿上放37，6OC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約34小時(shí)后可觀(guān)

33、察到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，約2天后細(xì)胞 長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿后進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)或凍存。(6)、第(5)步剩下的組織塊再加入10ml 005的胰酶一EDTA37水浴消 化10min，重復(fù)步驟(5)2次。2232 MEF細(xì)胞做飼養(yǎng)層細(xì)胞的處理 (1)、待MEF細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)皿底后，向培養(yǎng)基中加入10ugml的絲裂霉素C，輕輕搖晃使其混合均勻后置培養(yǎng)箱中溫育3h。(2)、棄去培養(yǎng)基，用PBS(pH72)洗滌3-4次，去除殘留的培養(yǎng)基。 (3)、加入適量025TrysinEDTA，使其均勻接觸皿底的細(xì)胞，室溫消化約lmin后，加入四倍于TrysinEDTA體積的MEF培養(yǎng)基終止消化。 (4)、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml滅菌離心

34、管中，1,200 rpm離心3min。棄去上清。(5)、加入凍存液凍存?zhèn)溆?，或傳代直接使用?233 Erk2突變體的構(gòu)建OligosequencePrimerltgt gca gee aac atg gcg gPrimer2taa gat ctg tat cot ggc tgg aat C引物寡核苷酸片段由Invitrogen合成，使用前稀釋至1259M的工作濃度。 (1)、收集24：j：L板的v65ES細(xì)胞(在gelatin處理的細(xì)胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)30rain以除去feeder細(xì)胞)，提取RNA(RneasyMiIli Kit，Qiagen,74106)。(2)、反轉(zhuǎn)錄(TransSo

35、9;ipt II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，TransGellAH30102)10第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定a體系RNA1mOligo dT1mTransScript II cDNA Synthesis Enzyme1Itl2X buffer10山H207“l(fā)20山b程序5030min855min(3)、PCRa體系cDNA1mprimerl+2(125p,M) 2m Trans HiFi DNA聚合酶 1m dNTP Mixture(2mM) 4mlOXbufferI5山H2037m50L11b程序1、945min219430

36、s315530s4172lmin 5)Return to 2 repeat 34 times 617210min7、l 400(4)、配制O8的瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物切膠回收(EasypurQuick GelExtraction Kit，TransGen,EMl0101)。第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定(5)、TA clone：pEASY-T3載體1山+PCR產(chǎn)物1山，室溫放置30min后加 入50m感受態(tài)細(xì)胞(Trans5a chemically competent cell，Transgen，CD20103)。 (6)、轉(zhuǎn)化：冰上放置30rain，42熱激30s，冰上3mi

37、n，加入5001xlLB，37搖床lh，離心棄上清后，加入X-gaJ與IPTG，涂于Ampcilin的固體LB板上。 (7)、16小時(shí)后挑取白色單菌落6個(gè)。(8)、提質(zhì)粒(Easypll括m Plasmid MiniPrep Kit，TransGen，EGl0101)，并用EcoRI酶切鑒定。將正確插入Erk2的質(zhì)粒送測(cè)序。(9)、點(diǎn)突變S151D與L73P的建立：01 igoSequenceNote ccTAAGAGAGATAAAAATcCcL73P一1工Erk2 mutant兒mulI-I工上1¨工L73P forwardcTCATGTCTGAAGCGCAGTGGL73P一2Er

38、k2 mutant兒。uL L73P reverse工c c上6c p上上兒lc工S151Dl鬻驀淼裟Erk2 mutant S151D forward primerS151D一2凹億黑鬟淼裟Erk2 mutant S151D reverse primer引物寡核苷酸片段由Invitrogen合成，使用前稀釋至1259M的工作濃度。A：按照以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：a體系：Plasmid(插入Erk2的pEASY-T3)1“l(fā)L73P-122mdNTP Mixture(2mM)49l PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerasel山 10X buffer5“l(fā)H203

39、7山501xlb程序：1)95"C30s2)95"C30s3)55。C1min4)68"C5min12第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定5)到2，重復(fù)1 1次6)4。C 00B：配制O8的瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物切膠回收(EasypureTM Quick Gel Extraction Kit，TransGen,EMl 0101)。C：回收的產(chǎn)物中加入DpnI，37度消化1h。用2山用于轉(zhuǎn)化。 D：37。C培養(yǎng)箱中孵育16h后挑取單茵落于含有arnpcilin的液體LB中。 E：37搖床中孵育16小時(shí)后送菌液測(cè)序。 F：測(cè)序結(jié)果正確后，按照同樣方法做S15

40、1D的Erk2點(diǎn)突變，此時(shí)獲得含有L73P與S151D的突變體Erk2。 G：將突變體與質(zhì)粒pBS31分別用MluI酶切，膠回收后連接Erk2突變體與pBS31載體，轉(zhuǎn)化，挑菌并酶切鑒定。獲得pBS31-Erk2突變體，命名為pZT292234電轉(zhuǎn)KH2細(xì)胞獲得穩(wěn)定克隆細(xì)胞KH2與質(zhì)粒pBS3 1、pCAGGSripE-puro均來(lái)自Kortrad Hochedlinger。(1)KH2 ES細(xì)胞含有pgk neo元件和ATG1ess并且沒(méi)有啟動(dòng)子的潮霉素 的重組元件，在重組酶的作用下可以與pBS31質(zhì)粒發(fā)生重組反應(yīng)。將KH2細(xì)胞 解凍至鋪有feeder的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上。(2)將pZT

41、29與含有表達(dá)重組酶FlpE的質(zhì)粒pCAGGS-ripEpuro按照如下 步驟與條件共電轉(zhuǎn)：1將KH2細(xì)胞的培養(yǎng)液吸去后用PBS洗一遍，加入lml 025的胰蛋白 酶，于37度培養(yǎng)箱中靜置30s后，加入ES培養(yǎng)液終止消化，取101xl細(xì) 胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。取107細(xì)胞1200rpm離心3mim，棄上清。用8009l的 PBS將細(xì)胞重懸。2在細(xì)胞中加入251xg的pZT29與50I_tg的pCAGGS·flpE-puro。3將混合物加入4mm電轉(zhuǎn)杯中電轉(zhuǎn)：電壓500V，259F，兩次。4電轉(zhuǎn)后室溫靜置10min后，加入lmm無(wú)feeder的皿中(O02的gelatin 處理30mim)。

42、524h后換液，加入終濃度130Itgml潮霉素篩選。每天換液67天后在體視鏡下挑取單克隆細(xì)胞至含有feeder的24孔板上培養(yǎng)。 7細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，胰酶消化，去feeder(無(wú)feeder的24孔板上培養(yǎng)30rnim)，13第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定以1：10的比例傳代在2個(gè)24孔板孔中，其中一孔加入強(qiáng)力霉素，24h 后換液，48小時(shí)后40山胰酶消化，200111培養(yǎng)液中和，1200rpm離心3min。8配lOSDS膠。9每個(gè)樣品用209lPBS與5“l(fā) 5x的SDS裂解，9510mim后至于冰上。 上樣100l上g做Western Blot。鑒定phosphoErk2的表達(dá)情

43、況。10選取pErk2表達(dá)量高的12號(hào)克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1 112號(hào)克隆加強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)12h、24h與48h后收，鑒定Nanog的表達(dá)。第三節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果231 Western Blot分析將構(gòu)建好的iErk2 ES細(xì)胞在002明膠處理過(guò)的皿上培養(yǎng)，加入強(qiáng)力霉素 后，不同時(shí)間點(diǎn)(12，24h，48h)收取細(xì)胞，做westernblot。緱彳耘2 cell-Oox移l恐2施墨軌咋r娩N(xiāo)anoga氆阼圖21 Erk2突變體誘導(dǎo)表達(dá)情況由western blot的結(jié)果我們驗(yàn)證了細(xì)胞的功能。加入強(qiáng)力霉素后，pErk2的 表達(dá)明顯上升，說(shuō)明iErk2細(xì)胞系沒(méi)有問(wèn)題。雖然pErk2的表達(dá)明顯上升，但是 在48

44、小時(shí)之內(nèi)，Nanog的變化并不明顯。這說(shuō)明iErk2在RasMAPK通路對(duì)Nanog 的誘導(dǎo)中并不是起到最關(guān)鍵的作用。232實(shí)時(shí)定量PCR分析 將構(gòu)建好的iErk2細(xì)胞在明膠處理過(guò)的皿上培養(yǎng)，加入強(qiáng)力霉素后，不同時(shí)間點(diǎn)(12h、24h、48h)收取細(xì)胞，做實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平。14第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定El憶Nanog藿*鬟，爹一甏鬻建霉茗圖22 Erk2突變體過(guò)表達(dá)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)情況A強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后Erk2的表達(dá)情況；B過(guò)表達(dá)Erk2對(duì)Nanog的影響233雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步檢測(cè)Erk2對(duì)Nanog的作用以及在ES向TS轉(zhuǎn)變過(guò)程中的作用，我們進(jìn)行了熒

45、光素酶報(bào)告檢測(cè)。Ras激活后nogJ自動(dòng)子活性的變化n弛激活后nog窟動(dòng)子活性白齜$*；善l，毋1馨童。莖l霧季莓，；馨墓重-互鼉耋；棗#：；：0一+一+圖21 LRas與iErk2激活后對(duì)Nanog啟動(dòng)子活性的影響：無(wú)Dox+：加Dox由結(jié)果我們可以看出，在iRas ES細(xì)胞中，強(qiáng)力霉素可以誘導(dǎo)Nanog的表達(dá) 下降，但是在iErk2 ES細(xì)胞中，加入強(qiáng)力霉素并不能引起明顯變化。雖然 RasMAPK通路可以引起Nanog的下降，Cdx2與pErk2的上升，從而引起ES細(xì)胞向TS細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，但是作為Ras通路下游重要分子的Erk2過(guò)表達(dá)并不能引起明顯的變化。這說(shuō)明，RasMAPK通路中存在其它

46、的一些重要分子，引起這 種生物學(xué)的變化。15第二章Erk2可誘導(dǎo)型ES細(xì)胞系的建立和鑒定第四節(jié)討論在iRas ES細(xì)胞中，RasMAPK通路激活后，多能性的分子標(biāo)志物Nanog 表達(dá)下降，滋養(yǎng)層分子標(biāo)記Cdx2升高。將iRas ES細(xì)胞在含有強(qiáng)力霉素的滋養(yǎng) 層干細(xì)胞的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)逐漸接近Ts細(xì)胞，即ESTS細(xì)胞，胚胎 注射后，ESTS細(xì)胞定位于滋養(yǎng)層區(qū)。這表明，RasMAPK通路可以引起ES細(xì)胞向TS細(xì)胞轉(zhuǎn)變。在此過(guò)程中，pErk2的表達(dá)明顯上升，加入PD98059(小分 子抑制劑，抑制Erk2的磷酸化)后Nanog表達(dá)回升，Cdx2表達(dá)下降，推測(cè)pErk2在細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中，可能起

47、到關(guān)鍵作用。因此，我們構(gòu)建可自磷酸化的Erk2表達(dá)載體(L73P、S151D)，鑒定Erk2的過(guò)表達(dá)可否引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。通過(guò)mRNA、 蛋白水平的檢測(cè)，以及熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，Erk2的激活并不能引起 與Ras激活相同的變化，由此我們得出結(jié)論，Erk2在ES向TS轉(zhuǎn)變中不起主要 作用。因此，我們致力于尋找此過(guò)程中的關(guān)鍵因子。16第三章目的蛋白的篩選和鑒定第三章目的蛋白的篩選和鑒定第一節(jié)導(dǎo)言我們已有建好的iRasES細(xì)胞系，即誘導(dǎo)表達(dá)H-Ras基因可引起胚胎干細(xì)胞 向滋養(yǎng)層干細(xì)胞的分化。RasMAPK通路主要通過(guò)磷酸化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起下游的 變化。基于這個(gè)體外分化系統(tǒng)，我們應(yīng)用磷酸化蛋白組

48、學(xué)(phosphoproteomics)的 方法研究在誘導(dǎo)日瑯船表達(dá)后不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)磷酸化的動(dòng)態(tài)變化，從而找 出介導(dǎo)信號(hào)傳遞的分子。利用試劑盒(PhosphoProtein Purification Kit，Qiagen) 分別裂解誘導(dǎo)0、12、24小時(shí)的iRasES細(xì)胞提取得到磷酸化的蛋白，然后進(jìn)行 串聯(lián)質(zhì)譜分析，找出磷酸化狀態(tài)發(fā)生變化的蛋白。針對(duì)選出的候選蛋白進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證這些蛋白對(duì)Oct4、Nanog和Cdx2表達(dá)的影響，最終找出起關(guān)鍵 作用的分子再進(jìn)行深入研究。我們從質(zhì)譜結(jié)果中篩選到發(fā)生變化的蛋白約有700多種。通過(guò)查找文獻(xiàn)， 找出可能與胚胎發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)通路分

49、子，挑選出Cops5，Ube2z， Zfp42S,Nacad,Cbxl，Sin3a，Psmc4，Ncoa3和Sum02作為研究對(duì)象。其中，Cops5 是COP9信號(hào)復(fù)合體的一個(gè)亞基，在細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要的作用41】。Vbe2z, Psmc4和Sumo是蛋白質(zhì)翻譯后修飾相關(guān)的一些蛋白，與泛素化修飾以及蛋白酶 體降解途徑密切相關(guān)4244】。Zfp428，Nacad,Cbxl，Sin3a和Ncoa3是具有特定結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子或者輔助轉(zhuǎn)錄因子，可以結(jié)合基因的啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控基因的表達(dá)【45-49】。利用OligoEngine軟件設(shè)計(jì)合成可以干擾基因表達(dá)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)連到 pSUPERpuro載體上，利用脂

50、質(zhì)體將構(gòu)好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到ES細(xì)胞中驗(yàn)證這些基因 的功能。第二節(jié)材料與方法321材料與試劑Phosphoprotein Purification Kit(Qiagen，37 1 01) pSUPERpuro質(zhì)粒(Invitrogen) BglII(Takara,D1021)HindlII(Takara,D1 060)17第三章目的蛋白的篩選和鑒定 EcoRI(Takara,D1040)T4 DNA ligase(Takara,D201 1) TranslTl感受態(tài)(TransGen,CD501) Lipofectamine 2000(Invitrogen,1 1 668 1 09) Doxycyc

51、line hyclate(Sigma，D9891·1G)RNeasy Mini Kit(Qiagen,74106)TransScript II FirstStrand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen,AH301)Realtime PCR Master M詼(TOYOBO，QPK-201B)MEF培養(yǎng)液 ES細(xì)胞培養(yǎng)液SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO，QPK201)322儀器PCR儀(BioRad，MyoiQ)Real-time PCR儀(BioRad，IQ5)C02培養(yǎng)箱(Thermo，3 11 1)

52、323實(shí)驗(yàn)方法3231磷酸化蛋白的質(zhì)譜分析1樣品準(zhǔn)備11解凍：將細(xì)胞解凍于鋪有feeder的培養(yǎng)皿中，每天換液。2)消化：細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后(一般是三天)，用12的培養(yǎng)液量PBS洗 一遍，用110的培養(yǎng)液量的025胰蛋白酶在37度培養(yǎng)箱中消 化30秒，用培養(yǎng)液中和吹散，1200rpm離心3min。3)去feeder：將細(xì)胞重懸后鋪于gelatin處理(002的明膠，37度 30min)的同樣大小的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中放置30min，取出上 清液，離心。4)誘導(dǎo)：將23重懸的細(xì)胞鋪于兩個(gè)新的明膠處理過(guò)的皿中(皿面 積約為培養(yǎng)面積的三倍)，加入終濃度lI_tgml的強(qiáng)力霉素：另13 細(xì)胞離心去上清后凍于8

53、0度。5)收細(xì)胞：一個(gè)將加強(qiáng)力霉素的細(xì)胞12小時(shí)培養(yǎng)后收；另一個(gè)換18第三章目的蛋白的篩選和鑒定液，并于24小時(shí)后收。 2磷酸化蛋白提?。喊凑誕iagcn的磷酸化提取試劑盒操作。3送樣做質(zhì)譜分析：將5管洗脫下的蛋白測(cè)定濃度，并將濃度最高的 中間三次洗脫液置于干冰中送樣做質(zhì)譜分析。3232候選蛋白的鑒定1刪A的構(gòu)建NameOLIGOCbxl·lagatccccGAAGAAAGTGGAGGAGGTAttcaagagaTACCTCCTCCACTVrCTTCtttttaCbxl一lb agcttaaaaaGAAGAAAGTGGAGGAGGTAtctcttgaaTACCTCCTCCACTTTCTTCggg Cbx l-2b agcttaaaaaGAGAATCTGGATTGCCCTGtctcttgaaCA眥AATCCAGAITCTCggg Cbx 1-2a gatccccGAGAATCTGGATTGCCCTGttcaagagaCAGGGCAATCCAGATTCTCt