new實(shí)驗(yàn)七GST酶親和層析及學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1new實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)七七GST酶親和層析及酶親和層析及第一頁(yè)，共44頁(yè)。1. 蛋白質(zhì)分離(fnl)純化2. 蛋白質(zhì)的鑒定(jindng)分析第1頁(yè)/共43頁(yè)第二頁(yè)，共44頁(yè)。蛋白質(zhì)分離(fnl)純化的方法第2頁(yè)/共43頁(yè)第三頁(yè)，共44頁(yè)。等電點(diǎn)沉淀法聚乙二醇沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法熱變性沉淀法1電泳法2層析法3沉淀法4透析、超濾5、離心(lxn)6、結(jié)晶第3頁(yè)/共43頁(yè)第四頁(yè)，共44頁(yè)。n主要是利用(lyng)鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。一、粗分級(jí)分離第

2、4頁(yè)/共43頁(yè)第五頁(yè)，共44頁(yè)。水的活度降低，原來(lái)溶液中大部分水的活度降低，原來(lái)溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子(fnz)(fnz)之間的作用，破壞蛋白質(zhì)之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子分子(fnz)(fnz)表面的水化層。表面的水化層。l鹽析沉淀的蛋白質(zhì)仍保持天然構(gòu)象，鹽析沉淀的蛋白質(zhì)仍保持天然構(gòu)象，即仍有活性。即仍有活性。第5頁(yè)/共43頁(yè)第六頁(yè)，共44頁(yè)。第6頁(yè)/共43頁(yè)第七頁(yè)，共44頁(yè)。 透析是將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜（玻璃紙、火綿紙等）制的透析袋里放在蒸餾水(緩沖液)中進(jìn)行，可不

3、斷更換蒸餾水，直至(zhzh)雜質(zhì)被除去。透析袋蛋白質(zhì)溶液蒸餾水第7頁(yè)/共43頁(yè)第八頁(yè)，共44頁(yè)。第8頁(yè)/共43頁(yè)第九頁(yè)，共44頁(yè)。第9頁(yè)/共43頁(yè)第十頁(yè)，共44頁(yè)。電泳電泳(IEF)。n另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。第10頁(yè)/共43頁(yè)第十一頁(yè)，共44頁(yè)。綜合(zngh)實(shí)驗(yàn)第11頁(yè)/共43頁(yè)第十二頁(yè)，共44頁(yè)。抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結(jié)合蛋白等。第12頁(yè)/共43頁(yè)第十三頁(yè)，共44頁(yè)。第13頁(yè)/共43頁(yè)第十四頁(yè)，共44頁(yè)。

4、Affinity chromatography 親和層析Solid Matrixligand第14頁(yè)/共43頁(yè)第十五頁(yè)，共44頁(yè)。親和層析法分離(fnl)生物大分子示意圖配基 待分離的 生物分子a. 載體 手臂 配基 親和吸附劑b.第15頁(yè)/共43頁(yè)第十六頁(yè)，共44頁(yè)。d.與待分離物質(zhì)專一可逆結(jié)合的物質(zhì)c.樣品雜質(zhì) 第16頁(yè)/共43頁(yè)第十七頁(yè)，共44頁(yè)。親和層析的示意圖第17頁(yè)/共43頁(yè)第十八頁(yè)，共44頁(yè)。Glu-Agarose beads 原理谷胱甘肽(Glutathione，Glu)與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶( Glu S-Transferase )之間具有特異性的作用力。將混合菌體蛋白與谷胱甘肽瓊

5、脂糖凝膠珠（Glu-Agarose beads）孵育，凝膠手臂上的Glu可以與GST蛋白特異性結(jié)合，通過(guò)洗脫除去不能與珠結(jié)合的雜蛋白而獲得瓊脂糖珠結(jié)合的GST純蛋白。進(jìn)一步使用還原型谷胱甘肽(GSH)洗脫時(shí)，將競(jìng)爭(zhēng)GST上的結(jié)合位點(diǎn)而將GST蛋白洗脫下來(lái)，從而(cng r)獲得純化的GST酶的純品。 第18頁(yè)/共43頁(yè)第十九頁(yè)，共44頁(yè)。 將菌液每3-4ml/管收集在Ep管中，離心后棄上清。第19頁(yè)/共43頁(yè)第二十頁(yè)，共44頁(yè)。含有50l 50% Glu-Aragrose beads的EP管中，混勻管內(nèi)液體，振搖反應(yīng)5min后，2000g離心1min，然后小心去除珠子(zh zi)上方的上清溶

6、液。在Ep管中加入預(yù)冷的PBS洗液1ml懸浮珠子(zh zi)，2000g離心1min，小心去除上清溶液，重復(fù)用PBS洗珠子(zh zi)8次以上, 最后一次用5000g 離心2min。最后將珠子(zh zi)上方的溶液盡量吸干凈，注意操作中盡量避免珠子(zh zi)被溶液帶走。在收集的珠子(zh zi)中加入20l GSH溶液懸浮珠子(zh zi)（注意不要顛倒Ep管，以免珠子(zh zi)粘在管壁上），室溫反應(yīng)5min后，10000g離心1min后收集上清溶液（即純化的GST蛋白）至一新Ep管中。（回收含有珠子(zh zi)的Ep管）第20頁(yè)/共43頁(yè)第二十一頁(yè)，共44頁(yè)。第21頁(yè)/共43

7、頁(yè)第二十二頁(yè)，共44頁(yè)。第22頁(yè)/共43頁(yè)第二十三頁(yè)，共44頁(yè)。核黃素B1 還原型 游離(yul)基 聚合反應(yīng)光照O2第23頁(yè)/共43頁(yè)第二十四頁(yè)，共44頁(yè)。丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝膠催化劑聚合反應(yīng)(j h fn yng)第24頁(yè)/共43頁(yè)第二十五頁(yè)，共44頁(yè)。單體丙烯酰胺Acr交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis化學(xué)聚合光聚合引發(fā)劑（NH4)2S2O8 （NH4)2S2O8 核 黃 素 加速劑TEMEDDMAPNTEMED注：（NH4)2S2O8 過(guò)硫酸胺在凝膠形成中提供始自由基，通過(guò)自由基的傳遞，使丙烯酰胺 成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng) TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺 DMAPN二甲基胺基丙

8、晴 聚合為含酰胺基側(cè)鏈的脂肪(zhfng)族長(zhǎng)鏈，在相鄰長(zhǎng)鏈之間通過(guò)甲撐橋連接而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)第25頁(yè)/共43頁(yè)第二十六頁(yè)，共44頁(yè)。單體(dn t)和雙體在凝膠中的總濃度a+bV 100%T雙體占總濃度(nngd)的百分含量，即交聯(lián)度bab 100%Ca，Acr的質(zhì)量（g）b，Bis的質(zhì)量（g）V，溶液的體積（ml） CT：520孔徑大小第26頁(yè)/共43頁(yè)第二十七頁(yè)，共44頁(yè)。蛋白質(zhì)相對(duì)(xingdu)分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量范圍(kD)適用的凝膠濃度（T%）1020301040152040100101510050051050025 凝膠濃度(nngd)的選擇第27頁(yè)

9、/共43頁(yè)第二十八頁(yè)，共44頁(yè)。聚丙烯酰胺凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀溶液(rngy)濃溶液(rngy) 交聯(lián)劑 凝膠 結(jié)點(diǎn)(ji din)第28頁(yè)/共43頁(yè)第二十九頁(yè)，共44頁(yè)?？煞蛛x：1.電荷性質(zhì)與密度相近的但分子量有差別 2.分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷性質(zhì)與密度有差別 的分子 3.電荷性質(zhì)、分子量大小相近，但構(gòu)型不同不連續(xù)(linx)凝膠電泳洗脫 堿性不連續(xù)(linx)分離酸性樣品 酸性不連續(xù)(linx)分離堿性樣品 第29頁(yè)/共43頁(yè)第三十頁(yè)，共44頁(yè)。第30頁(yè)/共43頁(yè)第三十一頁(yè)，共44頁(yè)。第31頁(yè)/共43頁(yè)第三十二頁(yè)，共44頁(yè)。第32頁(yè)/共43頁(yè)第三十三頁(yè)，共44頁(yè)。SDS-PAGE第33

10、頁(yè)/共43頁(yè)第三十四頁(yè)，共44頁(yè)。DTT硫鍵，使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。有些蛋白質(zhì)不能用SDS-PAGE測(cè)定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。第34頁(yè)/共43頁(yè)第三十五頁(yè)，共44頁(yè)。SDS-PAGE鑒定酶蛋白(dnbi)純度第35頁(yè)/共43頁(yè)第三十六頁(yè)，共44頁(yè)。 1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, 準(zhǔn)備2個(gè)干凈的燒杯.2. 把玻璃板在灌膠支架上固定好. 固定玻璃板時(shí)，兩邊用力(yng l)一定要均勻，防止夾壞玻璃板.3.按比例配好分離膠,用滴管快速加入, 之后加少許蒸餾水封膠,靜置3040分鐘.配制凝膠要迅速,

11、 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝膠無(wú)法注膠.注膠過(guò)程最好一次性完成,避免凝膠不均勻.封水的目的是為了使分離膠上沿平直，并隔絕空氣，促使凝膠聚合過(guò)程；凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面.4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干, 按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入分離膠面上,迅速插入樣梳,靜置40分鐘. 樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平.第36頁(yè)/共43頁(yè)第三十七頁(yè)，共44頁(yè)。 10% AP 100 l 10%TEMED 100 l 配膠，先配分離膠，再陪濃縮(nn su)膠。（在孵箱里或水浴鍋中聚合）10%分離(fnl)膠配方：（10ml,一塊膠）第37頁(yè)/共43頁(yè)第三十八頁(yè)，共44頁(yè)。ddH2O 3.345 ml30%凝膠貯液 0.8 ml濃縮(nn su)膠buffer 0.625 ml10%SDS 50 l10% AP 50 l10%TEMED 50 l第38頁(yè)/共43頁(yè)第三十九頁(yè)，共44頁(yè)。 操作步驟第39頁(yè)/共43頁(yè)第四十頁(yè)，共44頁(yè)。什么?n在不連續(xù)體系SDS-PAGE中,分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP,試述其作用?第40頁(yè)/共43頁(yè)第四十一頁(yè)，共44頁(yè)。第41頁(yè)/共43頁(yè)第四十二頁(yè)，共44頁(yè)。第42頁(yè)/共43頁(yè)第四十三頁(yè)，共44頁(yè)。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)會(huì)計(jì)學(xué)。常用