病原生物實驗課：實驗十四、沉淀反應（免疫實驗2）

1、 免疫實驗二免疫實驗二 沉淀反應沉淀反應實驗內容實驗內容1.雙項瓊脂擴散試驗雙項瓊脂擴散試驗每人做每人做2.對流免疫電泳對流免疫電泳每組做每組做3.單項瓊脂擴散單項瓊脂擴散示教示教4.火箭電泳火箭電泳示教示教5.免疫電泳免疫電泳示教示教 沉淀反應沉淀反應一、雙相瓊脂擴散試驗一、雙相瓊脂擴散試驗1.原理原理抗原抗體均勻擴散，在比例適當抗原抗體均勻擴散，在比例適當?shù)那闆r下形成沉淀物。的情況下形成沉淀物。 雙相瓊脂擴散試驗為定性試驗。雙相瓊脂擴散試驗為定性試驗。2.方法方法 （1）瓊脂板的制備）瓊脂板的制備1%鹽水瓊脂鹽水瓊脂3.5ml （2）打孔）打孔132 （3）加樣）加樣 1、抗甲胎蛋白診斷血

2、清（、抗甲胎蛋白診斷血清（Ab） 2、甲胎蛋白陽性血清（陽性對照）、甲胎蛋白陽性血清（陽性對照） 3、待檢患者血清、待檢患者血清（4）擴散）擴散置濕盒置濕盒37、24小時觀察結果。小時觀察結果。二、對流免疫電泳二、對流免疫電泳1.原理原理對流免疫電泳是利用電場的作用加強和加快對流免疫電泳是利用電場的作用加強和加快雙向擴散的一種方法。雙向擴散的一種方法。時間大為縮短（一般只需時間大為縮短（一般只需30分鐘到分鐘到1小時），且靈敏小時），且靈敏度比雙擴高約數(shù)十倍。度比雙擴高約數(shù)十倍。2.方法方法（1）制板（2）打孔1243 （3）加樣）加樣 1. 2.甲胎蛋白診斷血清甲胎蛋白診斷血清 3.甲胎蛋白

3、陽性血清甲胎蛋白陽性血清 4.待檢血清待檢血清. （4）電泳）電泳+三、單項瓊脂擴散試驗三、單項瓊脂擴散試驗1.原理原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測抗原在凝膠中自由擴散，與相應抗使待測抗原在凝膠中自由擴散，與相應抗體結合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原濃體結合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相關。度呈正相關。（沉淀環(huán)直徑（沉淀環(huán)直徑) )2 2抗原濃度抗原濃度1.1.抗體混于凝膠中抗體混于凝膠中2.2.抗原加入孔內抗原加入孔內3.3.抗原自由擴散抗原自由擴散標準品抗原濃度測定標準品抗原濃度測定不同病人抗原濃度測定不同病人抗原濃度測定1.1.測定沉淀環(huán)直徑測

4、定沉淀環(huán)直徑2.2.在標準曲線上查找在標準曲線上查找 相應抗原濃度相應抗原濃度四、火箭電泳四、火箭電泳: 把抗原放在含有抗體的凝膠內電泳，其沉淀形把抗原放在含有抗體的凝膠內電泳，其沉淀形似火箭。似火箭。原理原理待測待測Ag在含適量在含適量Ab的瓊脂板中泳動時，的瓊脂板中泳動時，Ag與與Ab達到適當比例形成大的不溶性達到適當比例形成大的不溶性IC而不再而不再移動，未與移動，未與Ab結合的結合的Ag可繼續(xù)向前泳動，并形可繼續(xù)向前泳動，并形成新的沉淀，隨著成新的沉淀，隨著Ag的減少，沉淀帶越來越窄，的減少，沉淀帶越來越窄，形似火箭峰狀。形似火箭峰狀。1.1.抗體混于凝膠中抗體混于凝膠中2.2.抗原加

5、入孔內抗原加入孔內3.3.抗原定向向正抗原定向向正 極泳動極泳動4.4.形成沉淀峰形成沉淀峰68mm5mm沉淀峰高沉淀峰高抗原濃度對數(shù)抗原濃度對數(shù)1.1.測定沉淀峰高度測定沉淀峰高度2.2.在標準曲線上查找在標準曲線上查找 相應抗原濃度相應抗原濃度繪制標準曲線繪制標準曲線染色標本結果染色標本結果五、免疫電泳五、免疫電泳1.原理原理區(qū)帶電泳和雙擴結合區(qū)帶電泳和雙擴結合。此法主要用于血清蛋白組份分析，此法主要用于血清蛋白組份分析，如對多發(fā)性骨髓瘤、重鏈病等病人如對多發(fā)性骨髓瘤、重鏈病等病人血清蛋白的組份分析。血清蛋白的組份分析。1 1、2 2孔分別加孔分別加AgAg，I=3I=34mA/cm4mA/cm，電電泳泳2h2h，分離，分離Ag